用于检测胃癌相关代谢小分子的液质联用模型及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于代谢小分子检测领域，特别涉及对胃癌相关代谢小分子的液质联用检测模型及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]胃癌是我国发病率较尚的癌症之一，胃癌病人多数无明显症状，少数人有恶心、呕吐或溃疡类似病症的上消化道疾病的症状。胃癌的发病具有地域性。研究发现，亚洲地区，如中国、日本、韩国等具有较高的发病率。其次，胃癌的发病原因较为复杂，目前，已经报道的研究发现，胃癌的诱因与日常饮食因素、胃溃疡疾病、胃息肉疾病以及幽门螺旋杆菌感染有关。根据最新的2012年的统计，我国胃癌发病率为3.314人/万人，死亡率为每万人2.434人/万人，远远高于世界上其他国家(发病率为2.309人/万人，死亡率为1.639人/万人)，位居恶性肿瘤第2位。通过不断的研究发现，提高胃癌诊断效果从而提高胃癌病人五年生存率的根本策略是对胃癌的诊断，达到早发现早治疗的目的。对于胃癌的诊断，开展较好的国家，如日本，其胃癌诊断的比例已经超过全部诊断胃癌病例的一半以上，而我国对于胃癌的诊断仅为全部胃癌诊断病例的5-15%。胃癌在诊断以后进行治疗，病患的五年生存率可以达到90%，原因超过进展期胃癌的治疗效果(五年生存率仅为16.6%)。目前，对于胃癌的诊断方法，主要集中在内窥镜手段、影像学诊断和分子生物学诊断。其中，影像学手段包括钡餐造影、螺旋CT成像;分子生物学手段即使对与癌症相关的基因、蛋白质的标志物进行筛查，例如，张力蛋白同源磷酸酶基因、survivin基因、Livin基因、CA72-4蛋白、CA19_9蛋白等。钡餐造影、内窥胃镜的方法，对于胃癌的诊断准确率较高，但是由于这些方法检测过程复杂，对病人的在生理上造成一定的伤害;对与基因和蛋白质标志物的筛查，检测过程复杂，需要大型的仪器，同时，诊断的准确率仍然处于较低的水平，在我国的普及率相对较低。
[0003]肿瘤标志物是由肿瘤细胞合成并且分泌到体液中的活性物质，存在与组织液、血液、唾液、尿液等体液中。1978年，在国立癌症研究所召开的“人类免疫及肿瘤免疫诊断会议”上，由美国学者Herberman首次提出肿瘤标志物(Tumor marker，TM)这一概念。肿瘤标志物是指在恶性肿瘤发生及增殖过程中，由肿瘤细胞自身的特殊性所表达并合成，最后分泌到细胞间及体液中的物质，或者，病人由于对肿瘤出现各种不同的生理或病理反应，从而自身正常细胞分泌到组织或体液中的物质，如某些蛋白质、小分子等等，统称为肿瘤标志物。使用肿瘤标志物，可以实现对对肿瘤的检测，并在诊断过程中起到辅助作用。依据其产生原理，肿瘤标志物分为两类，一类是由肿瘤自身分泌的；另一类是肿瘤与机体相互作用产生的。按其产生原理，我们把能反映恶性演变各个阶段中表型及基因型的特征或特性的物质，均称为肿瘤标志物。代谢组学是1999年英国帝国理工大学Jeremy Nicho I son教授提出的，定性定量的分析生物体内代谢小分子物质的研究方法。对胃癌的代谢组学的研究，可以发现与胃癌有关的代谢小分子物质。通过胃癌的标志性小分子代谢物，有利于胃癌的早发现，早治疗，从而提高胃癌病人的生存质量。较早关于胃癌代谢组学的研究是2009年发表于Cancer Res的文章，而后又有多篇文章对胃癌的代谢组学进行阐述，通过对胃癌的研究，科学家发现了很多胃癌所导致的产生差异调节(包括上调和下调)的代谢小分子物质，例如:乳酸、苹果酸、尿酸、棕榈酸、丁酸、丙酸、嘧啶、甘油、丝氨酸、谷氨酸、鸟氨酸、脯氨酸等。
[0004]液相色谱-质谱联用仪(liquidChromatograph Mass Spectrometer，缩写为LC-MS)结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力。液相色谱(LC)能够有效的将待测样品中的有机物成分离开，而质谱(MS)能够对分开的有机物逐个的分析，得到有机物分子量和浓度的信息，其原理为:使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质荷比。尽管液相色谱-质谱法(简称液质联用)在肿瘤代谢物检测中有所应用，但是迄今为止尚未见通过唾液以及高效液相色谱-质谱构建的模型能够用于胃癌相关代谢小分子的检测。
【发明内容】
[0005]本发明目的是为了克服已有对胃癌相关代谢小分子标志物检测技术的不足之处，提供一种用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的液质联用模型及制备方法，并对如何应用进行了介绍。
[0006]本发明的第一个目的是提供一种用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的液质联用模型，利用高效液相色谱-质谱联用仪测定胃癌患者和健康人唾液样本的代谢小分子，并筛选出相应的胃癌相关代谢小分子标志物，其中的胃癌相关代谢小分子标志物包括:脯氨酸、β-氨基异丁酸、谷氨酸、羟脯氨酸、谷氨酰胺、γ -氨基丁酸、鹅肌肽和肌肽。
[0007]进一步地，高效液相色谱条件为:选用C18色谱柱，流动相A为0.01 %七氟丁酸与0.1 %甲酸水溶液;流动相B为0.01%七氟丁酸与0.1 %甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，均为体积百分比；流速为0.8mL/min，柱温为50°C。
[0008]进一步地，梯度洗脱的条件为:0min(98%流动相A+2%流动相B)，9.5min(76%流动相A+24%流动相B)，11.0111；[11(20%流动相4+80%流动相13)，16.0111；[11(98%流动相4+2%流动相B)，25.0min(98%流动相A+2%流动相B)，均为体积百分比。
[0009]进一步地，质谱条件为:电喷雾离子源，正离子扫描，MRM扫描方式，气帘气为137.9kPa，碰撞气为中等，喷雾气为413.7kPa，辅助加热气为413.7kPa，电压为1500V，去簇电压为30V，人口电压为10V，碰撞能为30V，出口电压为5V。
[0010]本发明的第二个目的是提供一种用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的液质联用模型的制备方法，包括以下步骤:
[0011 ]步骤一、收集多例胃癌患者唾液样本和健康人的唾液样本分别作为病例组和对照组，进行低温冷冻备用；
[0012]步骤二、对唾液样本进行解冻，加入aTRAQ? Kit Phys1logical衍生化试剂进行预处理；
[0013]步骤三、对预处理过的两组唾液样本进行高效液相色谱-质谱检测，并收集检测到的代谢小分子的检测数据；
[OOM] 步骤四、对于高效液相色谱-质谱检测到的代谢小分子，用Mann-Whitney U test方法进行差异性检验，得到16种在病例组和对照组中存在明显差异的代谢小分子；
[0015]步骤五、对存在明显差异的代谢小分子使用百分比差异度进行评估，得到百分比差异度得分最大的代谢小分子脯氨酸；
[0016]步骤六、以对照组唾液样本中脯氨酸浓度的均值作为聚类分割值，将全部样本分为2个子类，脯氨酸浓度小于聚类分割值的归为一个子类命名为Ml，脯氨酸浓度大于等于聚类分割值的归为另一个子类命名为M2，并通过ROC曲线比较聚类前后的曲线线下面积；
[0017]步骤七、使用mRMR的方法，分别对Ml子类和M2子类中的代谢小分子进行打分，根据打分值进行排序，得到小分子与胃癌相关度的顺序;按照小分子与胃癌相关度的顺序，从相关度大的开始，先选择I个小分子，利用最近邻方法进行胃癌判断和“刀切法”得到胃癌判断的准确率;选择η个小分子，利用最近邻方法再次进行胃癌判断和“刀切法”得到新的准确率，直到选择所有的16个小分子为止;当准确率最大时，得到建模需要的小分子数目及其胃癌判断的准确率;其中，η〈 = 16;结果是得到了羟脯氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、鹅肌肽、肌肽、β-氨基异丁酸、谷氨酸和脯氨酸，作为胃癌相关代谢小分子标志物，建立用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的液质联用模型。
[0018]进一步地，步骤一中收集到的唾液样本经离心去上皮细胞后以上清液作为唾液待测样本进行低温冻存备用。
[0019]进一步地，最近邻方法是对于每一个样本，使用唾液中代谢小分子的含量来对样本进行编码，每一个样本对应一个向量;利用向量之间的距离，来判断样本之间的相似性；二个样本向量之间的距离越大，相似性越大;二个样本向量之间的距离越小，相似性越小；向量之间距离的定义为:
[0020]距离(Χ，Υ)=Χ.Υ/(||Χ||*||Υ||)
[0021]其中，X.Y为点乘，IlXlI与IlYlI分别为X与Y的模;
[0022]“刀切法”是:
[0023]I)每次从样本集N中取出一个样本，用剩下的N-1个样本作为训练集来训练模型，然后用取出的那个样本来检验距离(Χ，Υ)=Χ.Υ/(ΙΙΧ||*ΙΙΥ||)模型；
[0024]2)把刚才取出的样本放回，又取出另外一个样本；
[0025]3)重复检验N次，直到N个样本全部取遍；
[0026]4)统计用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的液质联用模型应用最终的预测准确率。
[0027]本发明还提供一种如上述的用于检验胃癌相关代谢小分子的液质联用模型在胃癌诊断或监测中的应用，或者在制备胃癌诊断设备或胃癌监测设备中的应用。
[0028]本发明提供的一种如上述的用于检验胃癌相关代谢小分子的液质联用模型的应用，使用最近邻算法，最近邻算法是对于每一个样本，使用唾液中代谢小分子的含量来对样本进行编码，每一个样本对应一个向量;利用向量之间的距离，来判断样本之间的相似性；二个样本向量之间的距离越大，相似性越大;二个样本向量之间的距离越小，相似性越小；向量之间距离的定义为:
[0029]距离(χ，γ)=χ.Υ/(||Χ||*||Υ||)
[0030]其中，X.Y为点乘，IlXlI与IlYlI分别为X与Y的模。
[0031 ]进一步地，使用“刀切法”验证胃癌判断的准确性，其方法是:
[0032]I)每次从样本集N中取出一个样本，用剩下的N-1个样本作为训练集来训练模型，然后用取出的那个样本来检验距离(χ，γ)=χ.Y/(IIX||*IIY||)模型；
[0033]2)把刚才取出的样本放回，又取出另外一个样本；
[0034]3)重复检验N次，直到N个样本全部取遍；
[0035]4)统计用于检测胃癌相