一种快速提取农作物种子基因组DNA的简易方法与流程

本发明涉及一种快速提取农作物种子基因组DNA的简易方法。
背景技术：
：随着生物技术的快速发展，基于DNA研究的分子生物学技术(如分子标记、基因重组、分子克隆等)在农作物种子研究中得到广泛应用，而这些技术的应用离不开基因组DNA的提取。目前常规基因组DNA提取方法有CTAB法、SDS法、苯酚法、试剂盒法等。这些常用的方法都存在一些缺陷，并不适合大量样品的快速分析研究，特别是单粒种子测试分析，如SDS和CTAB法，要用到CTAB、SDS、饱和酚、氯仿等对人体有毒有害试剂，提取时间长、操作复杂、对操作人员技术要求高；试剂盒法虽然提取效率高，操作相对简便，但试剂成本高，难以用于大批量样品的DNA提取。因此发明一种既快速简便，又经济环保，适合农作物种子基因组DNA高通量快速提取的方法具有很大应用前景。技术实现要素：本发明的目的是提供一种快速提取农作物种子基因组DNA的简易方法。本发明提供一种提取农作物种子基因组DNA的方法，包括如下步骤：(1)取农作物种子，进行粉碎，得到颗粒；(2)取步骤(1)得到的颗粒，加入NaOH溶液，进行裂解；(3)完成步骤(2)后，加入HCl溶液，进行中和。所述方法中，所述裂解是在沸水浴中进行的。所述方法中还包括如下步骤(4)：完成步骤(3)后，静置并收集上清液，即为基因组DNA溶液。所述方法中，所述NaOH溶液可为0.1-0.2M的NaOH水溶液。所述方法中，所述HCl溶液可为0.005-0.075M的HCl水溶液。所述方法中，所述裂解的时间为3-40min。所述方法中，所述颗粒、所述NaOH溶液和所述HCl溶液的配比可为：50mg∶200-800μL∶200-800μL。所述方法中，所述颗粒的粒径小于2mm。所述农作物具体可为玉米、小麦、水稻、油菜或大豆。所述玉米具体可为京科968玉米。所述小麦具体可为京麦7号小麦。所述水稻具体可为宜香优208水稻。所述油菜具体可为富油杂108油菜。所述大豆具体可为中黄40大豆。所述方法中，所述农作物种子为玉米种子时，所述NaOH溶液为0.2MNaOH水溶液，加入量为500μL，所述裂解的时间为7min，所述HCl溶液为0.075MHCl水溶液，加入量为500μL。所述方法中，所述农作物种子为小麦种子时，所述NaOH溶液为0.2MNaOH水溶液，加入量为400μL，所述裂解的时间为15min，所述HCl溶液为0.075MHCl水溶液，加入量为400μL。所述方法中，所述农作物种子为水稻种子时，所述NaOH溶液为0.2MNaOH水溶液，加入量为400μL，所述裂解的时间为10min，所述HCl溶液为0.01MHCl水溶液，加入量为400μL。所述方法中，所述农作物种子为油菜种子时，所述NaOH溶液为0.2MNaOH水溶液，加入量为250μL，所述裂解的时间为12min，所述HCl溶液为0.05MHCl水溶液，加入量为250μL。所述方法中，所述农作物种子为大豆种子时，所述NaOH溶液为0.15MNaOH水溶液，加入量为600μL，所述裂解的时间为30min，所述HCl溶液为0.075MHCl水溶液，加入量为600μL。本发明提供了一种提取农作物种子的基因组DNA的方法。本发明建立的方法适用于农作物种子纯度、真实性、转基因成分等基于PCR技术的快速测定，规避了传统的提取方法存在对人体伤害的缺陷、减少了提取步骤(只需三步)、缩短了提取时间(96个样品只需10-40分钟)、降低了试剂成本(只需低浓度的NaOH和HCl，费用几近为零)。本方法解决了种子，特别是单粒种子DNA批量快速提取瓶颈问题，实现了DNA提取的高通量。附图说明图1为实施例1中提取的基因组DNA部分电泳图。图2为实施例5提取基因组DNA保存不同时间后的实时荧光定量PCR检测结果图。图3为实施例6采用两种方法提取玉米种子基因组DNA的扩增结果图。图4为实施例6采用两种方法提取小麦种子基因组DNA的扩增结果图。图5为实施例6采用两种方法提取油菜种子基因组DNA的扩增结果图。图6为实施例6采用两种方法提取大豆种子基因组DNA的扩增结果图。图7为实施例6采用两种方法提取水稻种子基因组DNA的扩增结果图。图8为实施例7将提取的基因组DNA进行SSR-PCR扩增的电泳结果图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实际应用中，可以用96孔深孔板代替实施例中的EP管。玉米种子：京科968，中国种子集团公司。水稻种子：宜香优208，中国种子集团公司。小麦种子：京麦7号，中国种子集团公司。大豆种子：中黄40，中国种子集团公司。油菜种子：富油杂108，中国种子集团公司。实施例1、简易方法提取溶液浓度优化待测种子为：玉米种子、水稻种子、小麦种子、大豆种子和油菜种子。一、提取溶液浓度筛选1、取待测种子，进行粉碎，得到粒径小于2mm的颗粒。2、取50mg步骤1得到的颗粒，加入2mL的EP管中。3、向步骤2的EP管中加入400μL的裂解溶液(裂解溶液即NaOH水溶液)并混匀，然后置于沸水浴中裂解10min，然后加入400μL的中和溶液(中和溶液即HCl水溶液)并混匀，然后静置并收集上清液，即为基因组DNA溶液。裂解溶液分别设置为不同浓度的NaOH水溶液。中和溶液分别设置为不同浓度的HCl水溶液。设置方法如表1所示，按照表1所示的2个因素(NaOH浓度、HCl浓度)设置36个处理组(每组设置五个重复处理)。表1NaOH浓度和HCl浓度裂解溶液中的NaOH浓度(M)中和溶液中的HCl浓度(M)0.30.10.250.0750.20.050.150.0250.10.010.050.0054、取步骤3得到的基因组DNA溶液，进行1％琼脂糖电泳，对基因组DNA质量进行检测，结果如表2所示。36个浓度组合中：4个浓度组合(1：0.2MNaOH，0.075MHCl；2：0.2MNaOH，0.05MHCl；3：0.15MNaOH，0.075MHCl；4：0.2MNaOH，0.01MHCl)提取基因组DNA的效果较好，基因组DNA溶液中的DNA量相对较多；4个浓度组合(1：0.15MNaOH，0.05MHCl；2：0.15MNaOH，0.025MHCl；3：0.15MNaOH，0.005MHCl；4：0.1MNaOH，0.005MHCl)提取基因组DNA的效果一般，基因组DNA溶液中的DNA量较少且降解严重；其余浓度组合提取基因组DNA的效果不好，基本没有提取得到DNA。表2不同浓度的提取溶液提取的DNA效果部分电泳结果见图1。图1中，泳道1-5依次对应使用0.2MNaOH，0.075MHCl浓度组合提取玉米种子、水稻种子、小麦种子、大豆种子、油菜种子得到的DNA电泳结果，泳道6-10依次对应使用0.15MNaOH，0.075MHCl浓度组合提取玉米种子、水稻种子、小麦种子、大豆种子、油菜种子得到的DNA电泳结果，泳道11-15依次对应使用0.15MNaOH，0.05MHCl浓度组合提取玉米种子、水稻种子、小麦种子、大豆种子、油菜种子得到的的DNA电泳结果，泳道16-20依次对应使用0.15MNaOH，0.025MHCl浓度组合提取玉米种子、水稻种子、小麦种子、大豆种子、油菜种子得到的的DNA电泳结果，泳道21-25依次对应使用0.1MNaOH，0.01MHCl浓度组合提取玉米种子、水稻种子、小麦种子、大豆种子、油菜种子得到的的DNA电泳结果。二、不同作物最适提取溶液浓度优化1、取待测种子，进行粉碎，得到粒径小于2mm的颗粒。2、取50mg步骤1得到的颗粒，加入2mL的EP管中。3、向步骤2的EP管中加入400μL的裂解溶液并混匀，然后置于沸水浴中裂解10min，然后加入400μL的中和溶液并混匀，然后静置并收集上清液，即为基因组DNA溶液。试验组A：裂解溶液为0.2MNaOH水溶液，中和溶液为0.075MHCl水溶液；试验组B：裂解溶液为0.15MNaOH水溶液，中和溶液为0.075MHCl水溶液；试验组C：裂解溶液为0.2MNaOH水溶液，中和溶液为0.05MHCl水溶液；试验组D：裂解溶液为0.2MNaOH水溶液，中和溶液为0.01MHCl水溶液。4、以步骤3得到的基因组DNA溶液为模板，进行实时荧光PCR扩增。用于检测玉米的zSSIIb基因(玉米的内参基因)的引物和探针如下(5’→3’)：zSSIIb-F(上游引物)：CGGTGGATGCTAAGGCTGATG；zSSIIb-R(下游引物)：AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC；zSSIIb-P(探针)：TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG。用于检测水稻的SPS基因(水稻的内参基因)的引物和探针如下(5’→3’)：SPS-F(上游引物)：TTGCGCCTGAACGGATAT；SPS-R(下游引物)：TCCGAGCCGTCCGTGCGTC；SPS-P(探针)：CGGTTGATCTTTTCGGGATG。用于检测小麦的WOX12(小麦的内参基因)的引物和探针如下(5’→3’)：WOX12-F(上游引物)：GTCGCGGGAACAGATTTGTWOX12-R(下游引物)：GGTGTTCCTCCATTGCGAAA；WOX12-P(探针)：CAAGGCGGCCGAAATAAGTTGCC。用于检测大豆的Lectin(大豆的内参基因)的引物和探针如下(5’→3’)：Lectin-F(上游引物)：CCTCCTCGGGAAAGTTACAA；Lectin-R(下游引物)：GGGCATAGAAGGTGAAGTT；Lectin-P(探针)：CCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCT。用于检测油菜的HMGI/Y(油菜的内参基因)的引物和探针如下(5’→3’)：HMGI/Y-F(上游引物)：GGTCGTCCtCCTAAGGCGAAAG；HMGI/Y-R(下游引物)：CTTCTTCGGCGGTCGTCCAC；HMGI/Y-P(探针)：CGGAGCCACTCGGTGCCGCAACTT。用于检测玉米相应内参基因的PCR反应体系：2.5μL10×PCR缓冲液(含MgCl2)，2μLdNTPs，0.5μLzSSIIb-P，1.0μLzSSIIb-F，1.0μLzSSIIb-R，0.2μLTaq酶(5U/μL)，50ng模板，补水至25μL。在反应体系中，zSSIIb-P的浓度为0.2μmol/L，zSSIIb-F的浓度为0.4μmol/L，zSSIIb-R的浓度为0.4μmol/L。用于检测水稻相应内参基因的PCR反应体系：2.5μL10×PCR缓冲液(含MgCl2)，2μLdNTPs，0.5μLSPS-P，1.0μLSPS-F，1.0μLSPS-R，0.2μLTaq酶(5U/μL)，50ng模板，补水至25μL。在反应体系中，SPS-P的浓度为0.2μmol/L，SPS-F的浓度为0.4μmol/L，SPS-R的浓度为0.4μmol/L。用于检测小麦相应内参基因的PCR反应体系：2.5μL10×PCR缓冲液(含MgCl2)，2μLdNTPs，0.5μLWOX12-P，1.0μLWOX12-F，1.0μLWOX12-R，0.2μLTaq酶(5U/μL)，50ng模板，补水至25μL。在反应体系中，WOX12-P的浓度为0.2μmol/L，WOX12-F的浓度为0.4μmol/L，WOX12-R的浓度为0.4μmol/L。用于检测大豆相应内参基因的PCR反应体系：2.5μL10×PCR缓冲液(含MgCl2)，2μLdNTPs，0.5μLLectin-P，1.0μLLectin-F，1.0μLLectin-R，0.2μLTaq酶(5U/μL)，50ng模板，补水至25μL。在反应体系中，Lectin-P的浓度为0.2μmol/L，Lectin-F的浓度为0.4μmol/L，Lectin-R的浓度为0.4μmol/L。用于检测油菜相应内参基因的PCR反应体系：2.5μL10×PCR缓冲液(含MgCl2)，2μLdNTPs，0.5μLHMGI/Y-P，1.0μLHMGI/Y-F，1.0μLHMGI/Y-R，0.2μLTaq酶(5U/μL)，50ng模板，补水至25μL。在反应体系中，HMGI/Y-P的浓度为0.2μmol/L，HMGI/Y-F的浓度为0.4μmol/L，HMGI/Y-R的浓度为0.4μmol/L。PCR反应程序：第一阶段：95℃10min；第二阶段：95℃15s、60℃60s，循环数40；在第二阶段的退火延伸时段收集荧光值，PCR反应结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值分析结果。每个试验组设置3个重复，PCR设置4个重复，共计12个重复。统计PCR扩增的Ct值平均值及其标准偏差，结果如表3所示。表3实时荧光PCR检测结果提取玉米和小麦的基因组DNA时，试验组A效果最好，平均Ct值低(扩增效率高)，且扩增一致性好(偏差小)，稳定性高。提取大豆的基因组DNA时，试验组B效果最好。提取水稻的基因组DNA时，试验组D效果最好。提取油菜的基因组DNA时，试验组C效果最好。根据以上结果，确定对于不同作物最佳的提取溶液的浓度，如表4所示。表4最佳的提取溶液浓度作物裂解溶液中的NaOH浓度(M)中和溶液中的HCl浓度(M)玉米0.20.075小麦0.20.075水稻0.20.01油菜0.20.05大豆0.150.075实施例2、简易方法提取溶液加入量优化待测种子为：玉米种子、水稻种子、小麦种子、大豆种子、油菜种子。1、取待测种子，进行粉碎，得到粒径小于2mm的颗粒。2、取50mg步骤1得到的颗粒，加入2mL的EP管中。3、向步骤2的EP管中加入nμL的裂解溶液并混匀，然后置于沸水浴中裂解10min，然后加入nμL的中和溶液并混匀，然后静置并收集上清液，即为基因组DNA溶液。n＝200μL、250μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、600μL、700μL或800μL。当待测种子为玉米种子时，裂解溶液为0.2MNaOH水溶液，中和溶液为0.075HCl水溶液。当待测种子为小麦种子时，裂解溶液为0.2MNaOH水溶液，中和溶液为0.075HCl水溶液。当待测种子为水稻种子时，裂解溶液为0.2MNaOH水溶液，中和溶液为0.01HCl水溶液。当待测种子为油菜种子时，裂解溶液为0.2MNaOH水溶液，中和溶液为0.05HCl水溶液。当待测种子为大豆种子时，裂解溶液为0.15MNaOH水溶液，中和溶液为0.075HCl水溶液。4、以步骤3提取的DNA为模板，使用实施例1中的引物和反应条件对待测DNA进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结果如表5所示。提取玉米种子的基因组DNA时，提取液加入500μL时扩增Ct值最小，扩增效果最好。提取水稻种子的基因组DNA时，提取液加入400μL时扩增Ct值最小，扩增效果最好。提取大豆种子的基因组DNA时，提取液加入600μL时扩增Ct值最小，扩增效果最好。提取小麦种子的基因组DNA时，提取液加入400μL时扩增Ct值最小，扩增效果最好。提取油菜种子的基因组DNA时，提取液加入250μL时扩增Ct值最小，扩增效果最好。根据结果，确定对于不同作物最佳的提取溶液接入量，如表6所示。表5提取液加入量与扩增效果分析表6最佳的提取溶液加入量作物NaOH水溶液HCl水溶液玉米500μL500μL小麦400μL400μL水稻400μL400μL油菜250μL250μL大豆600μL600μL实施例3、简易方法加热裂解时间优化待测种子为：玉米种子、水稻种子、小麦种子、大豆种子、油菜种子。1、取待测种子，进行粉碎，得到粒径小于2mm的颗粒。2、取50mg步骤1得到的颗粒，加入2mL的EP管中。3、向步骤2的EP管中加入裂解溶液并混匀，然后置于沸水浴中裂解nmin，然后加入中和溶液并混匀，然后静置并收集上清液，即为基因组DNA溶液。n＝3min、5min、7min、10min、12min、15min、17min、20min、25min、30min、35min或40min。当待测种子为玉米种子时，裂解溶液为0.2MNaOH水溶液，中和溶液为0.075HCl水溶液，裂解溶液加入量为500μL，中和溶液加入量为500μL。当待测种子为小麦种子时，裂解溶液为0.2MNaOH水溶液，中和溶液为0.075HCl水溶液，裂解溶液加入量为400μL，中和溶液加入量为400μL。当待测种子为水稻种子时，裂解溶液为0.2MNAOH水溶液，中和溶液为0.01HCl水溶液，裂解溶液加入量为400μL，中和溶液加入量为400μL。当待测种子为油菜种子时，裂解溶液为0.2MNaOH水溶液，中和溶液为0.05HCl水溶液，裂解溶液加入量为250μL，中和溶液加入量为250μL。当待测种子为大豆种子时，裂解溶液为0.15MNaOH水溶液，中和溶液为0.075HCl水溶液，裂解溶液加入量为600μL，中和溶液加入量为600μL。4、以步骤3提取的基因组DNA为模板，使用实施例1中的引物对待测DNA进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结果如表7所示。提取玉米种子的基因组DNA时，加热时间为7min时扩增Ct值最小，扩增效果最好。提取水稻种子的基因组DNA时，加热时间为10min时扩增Ct值最小，扩增效果最好。提取大豆种子的基因组DNA时，加热时间为30min时扩增Ct值最小，扩增效果最好。提取小麦种子的基因组DNA时，加热时间为15min时扩增Ct值最小，扩增效果最好。提取油菜种子的基因组DNA时，加热时间为12min时扩增Ct值最小，扩增效果最好。最终确定的最佳加热时间如表8所示。表7加热时间与扩增效果分析表8最佳的加热裂解时间作物加热时间玉米7min小麦15min水稻10min油菜12min大豆30min实施例4、不同作物的种子基因组DNA简易提取最佳方法根据实施例1、2、3的实验结果，确定对于玉米、小麦、水稻、油菜和大豆五种作物的种子基因组DNA简易提取最佳方法，具体方法如下：1、取待测种子，进行粉碎，得到粒径小于2mm的颗粒。2、取50mg步骤1得到的颗粒，加入2mL的EP管中。3、向步骤2的EP管中加入裂解溶液并混匀，然后置于沸水浴中裂解一定时间，然后加入中和溶液并混匀，然后静置并收集上清液，即为基因组DNA溶液。对于不同作物的种子，NaOH溶液和HCl溶液的浓度和加入量不同，裂解时间不同，对于不同农作物种子的最佳溶液浓度如表4所示，最佳溶液加入量如表6所示，最佳的加热裂解时间如表8所示。实施例5、简易方法提取DNA保存时间分析采用实施例4的种子基因组DNA简易提取最佳方法分别提取玉米种子、小麦种子、水稻种子、油菜种子和大豆种子的基因组DNA，将提取的DNA置于4℃保存，对保存的DNA分别在保存后的0小时、2小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天时通过实时荧光定量PCR检测，检测结果如图2所示。图2中，纵坐标表示反应的循环数，横坐标表示储存时间，1代表0小时，2代表2小时，3代表8小时，4代表12小时，5代表1天，6代表2天，7代表3天，8代表4天，9代表5天，10代表6天，11代表7天，12代表8天，13代表9天。结果表明，随着存贮时间增加，DNA质量有所下降(扩增的Ct平均值下降)，在8小时以内，五个作物提取的DNA质量下降都不明显，超过24小时后油菜和水稻DNA质量明显下降，超过48个小时大豆和小麦DNA质量也开始明显下降，只有玉米的DNA保存时间超过一周，一周后扩增效果明显下降，因此实施例4的基种子基因组DNA简易提取最佳方法适用于提取DNA后的快速检测。实施例6、简易方法提取DNA与试剂盒法提取DNA的扩增效果比较待测种子为：玉米种子、小麦种子、水稻种子、油菜种子、大豆种子。1、采用实施例4的种子基因组DNA简易提取最佳方法提取待测种子基因组DNA。2、采用北京天根生化科技有限公司新型植物基因组提取试剂盒，按照说明书的方法提取待测种子基因组DNA。3、将步骤1和步骤2提取的DNA通过实时荧光定量PCR检测，结果如图3-图7所示。图3-图7中，横坐标为反应循环数。图3为采用两种方法提取玉米种子的DNA扩增结果图。图4为采用两种方法提取小麦种子的DNA扩增结果图。图5为采用两种方法提取油菜种子的DNA扩增结果图。图6为采用两种方法提取大豆种子的DNA扩增结果图。图7为采用两种方法提取水稻种子的DNA扩增结果图。结果表明，使用实施例4的方法提取的DNA存与用试剂盒法提取的DNA扩增结果比较，其中玉米、小麦和油菜Ct值差异小于2，大豆和水稻Ct值差异小于3，使用实施例4的方法可以提取出满足PCR实验扩增要求的DNA。实施7、简易方法提取DNA用于SSR标记分析待测种子为：玉米种子、小麦种子、水稻种子、油菜种子、大豆种子。1、采用实施例4的种子基因组DNA简易提取最佳方法提取待测种子基因组DNA。2、对提取的DNA进行SSR-PCR扩增和电泳检测。PCR扩增引物如表9所示。表9SSR-PCR扩增引物PCR反应体系：2μLTaqBuffer(10×)，2μLMgCl2(25mol/L)，1.2μLdNTPs(2.5mol/Leach)，0.25μL上游引物(10μmol/L)，0.25μL下游引物(10μmol/L)，0.2μLTaq聚合酶(5U/μL)，1μLDNA模板，补水至20μL。PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性40s，58℃退火35s，72℃延伸45s，共36个循环，72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物采用2.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果如图8所示。图8中，泳道M为DNAMaker，泳道1-2为运用引物bnlg439wl-F和引物bnlg439wl-R对提取的玉米基因组DNA进行PCR扩增的条带，泳道3-4为运用引物umc1335y5-F和引物umc1335y5-R对提取的玉米基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道5-6为运用引物umc2007y4-F和引物umc2007y4-R对提取的玉米基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道7-8为运用引物RM209-F和RM209-R引物对提取的水稻基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道9-10为运用引物RM19-F和RM19-R引物对提取的水稻基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道11-12为运用引物RM1195-F和RM1195-R引物对提取的水稻基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道13-14为运用引物satt429-F和satt429-R引物对提取的大豆基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道15-16为运用引物satt197-F和satt197-R引物对提取的大豆基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道17-18为运用引物satt556-F和satt556-R引物对提取的大豆基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道19-20为运用引物MR014-F和MR014-R引物对提取的油菜基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道21-22为运用引物CN57-F和CN57-R引物对提取的油菜基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道23-24为运用引物CB10330-F和CB10330-R引物对提取的油菜基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道25-26为运用引物xcwm65-F和xcwm65-R引物对提取的油菜基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道27-28为运用引物xbarc80-F和xbarc80-R引物对提取的油菜基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带，泳道29-30为运用引物xcfd72-F和xcfd72-R引物对提取的油菜基因组DNA进行PCR扩增的电泳条带。结果表明，用简易法提取五种作物的基因组DNA，每个作物分别采用3对SSR引物进行扩增，电泳检测结果显示，所有引物均扩增出目的条带，条带干净且明亮，说明采用实施例4的简易法提取的DNA可用于SSR分子标记技术分析。当前第1页1 2 3