一种脯氨酸内切酶的制备方法与流程

本发明涉及微生物发酵工程，尤其是涉及一种酶制剂的制备方法，具体是一种脯氨酸内切酶的制备方法。

背景技术：

黑曲霉(Aspergillus niger)来源的脯氨酸内切蛋白酶(prolyl endoprotease，PEP)是一种可以高效水解蛋白质或多肽脯氨酸残基羧基端肽键的蛋白酶。PEP可广泛应用于预防啤酒后浑浊、茶乳酪形成和降低蛋白水解物苦涩味。国内市场还没有自主研发的PEP酶制剂产品，完全依赖进口。丝状真菌具有强大的分泌表达能力，广泛用于表达同源或者异源蛋白。黑曲霉作为基本安全(GRAS)微生物具有完整和高效的蛋白翻译后修饰，在表达同源或者异源蛋白时，具有安全、高产和高效的特点。

在食品酶制剂行业，通常要求工业化应用的酶具有较高的稳定性和合适的最适pH值及较低的生产成本。黑曲霉来源的脯氨酸內肽酶可以作用于分子量较大的蛋白(35kDa)和多肽，作用的底物范围广。同时黑曲霉来源的脯氨酸内切蛋白酶的热稳定性好，在pH5.0，65℃条件下孵育30min，没有检测到脯氨酸内切蛋白酶活力的减少。

目前利用曲霉尤其是黑曲霉制取脯氨酸内切蛋白酶主要采取基因工程的方法，例如中国专利CN200710150282.3、CN201610202929.1、CN201310656778.3均涉及制取脯氨酸内切蛋白酶的方法，所采用的技术手段均是通过基因重组方式培养工程菌来获得目标酶制剂，过程复杂，需要测定目标酶制剂的氨基酸序列，设计相关引物，不利于工业上推广生产。

本发明采以黑曲霉为生产菌，以脯氨酸为诱导表达底物来直接诱导黑曲霉内的脯氨酸内切酶基因的高效表达。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种新的脯氨酸内切酶的制备方法，通过高密度发酵加入适量的诱导表达底物脯氨酸来诱导黑曲霉中脯氨酸内切酶基因的表达，从而得到脯氨酸内切酶，该酶制剂可广泛应用于食品领域。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种脯氨酸内切酶的制备方法，包括黑曲霉种液制备、培养发酵、发酵液提取处理，步骤具体如下：

(1)种液的制备：将黑曲霉菌种于培养基平板活化后，取菌种接入BMGY液体培养基中，28-35℃、200-250r/min摇瓶培养至菌体OD600nm为2-3，培养12-18h，得到种液；

(2)培养发酵：将制得的种液离心收集菌体，并用灭菌蒸馏水洗涤后，接入黑曲霉高密度发酵培养基中，28-35℃、200-250r/min摇瓶培养发酵，每隔16-48h补加脯氨酸，至脯氨酸内切酶的酶活缓慢升高或者不再升高，终止发酵，发酵时长96-200h；发酵菌浓5-20g/L(以菌体湿重计)；

或者将步骤(1)制得的种液，接入黑曲霉高密度发酵培养基中，28-35℃、200-800r/min发酵罐培养发酵，根据发酵罐pH和溶氧的状态调整补加脯氨酸的流速，至脯氨酸内切酶的酶活缓慢升高或者不再升高，终止发酵，发酵时长96-200h；发酵菌浓100-300g/L(以菌体湿重计)；

(3)发酵液经过滤、浓缩、调配后，精滤或者干燥得到液体脯氨酸内切酶或固体脯氨酸内切酶。

作为进一步改进，所述步骤(1)中的BMGY液体培养基重量百分比组成为：胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，121℃，灭菌20min后，加入100mmol/L pH6的磷酸钾，无氨基氮源13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，甘油10g/L。

作为进一步改进，所述步骤(2)中的黑曲霉高密度发酵培养基由下述重量百分比组分制备而成：蔗糖5-15％，玉米粉5-6％，豆饼粉1.5-2.5％，葡萄糖3-4％，酵母粉0.4-0.8％，玉米浆0.1-0.5％，硫酸铵0.05-0.4％，磷酸氢二钾0.05-0.4％，磷酸二氢钾0.05-0.4％，柠檬酸钠0.1-0.5％，消泡剂0.1-1mL，pH值5.0-7.0，121℃灭菌20min。采用特别配制的发酵罐培养基，同时控制发酵终点时菌体浓度，能够保证进一步提高脯氨酸内切酶的酶活。

作为进一步改进，所述步骤(2)离心收集菌体采用的参数为离心速率为5000-10000r/min，离心5-10min。

作为进一步改进，所述步骤(2)中补加的脯氨酸浓度为0.1-0.5mg/L。以合适浓度的脯氨酸为诱导底物，并通过补料方式添加能够有效诱导高酶活的脯氨酸内切酶的产生。

作为进一步改进，所述步骤(2)中发酵罐内pH维持在5.0-7.0，溶氧维持在35-50％。

与现有技术相比，本发明采用天然的黑曲霉菌种，安全性高，以脯氨酸为诱导底物，在摇瓶或者发酵罐中配合一定组分的培养基在温和的发酵条件下能够获得酶学性质良好的脯氨酸内切酶；发酵培养的条件容易控制，方法简便易操作；本发明方法制备的脯氨酸内切酶其温度和pH适应范围宽，稳定性良好，且在10℃以下低温保存12个月后酶活损失小于10％，发酵液酶活可达0.1-10PPU/mL。

附图说明

图1为不同pH下脯氨酸内切酶的相对活性曲线；

图2为不同温度下脯氨酸内切酶的相对活性曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。如无特别说明，实施例中所用试剂均为符合发酵方法的市售产品。

实施例1 黑曲霉Aspergillus niger的摇瓶高密度发酵

步骤一：将常规甘油-80℃保存的黑曲霉甘油菌种划线于麦芽汁培养基平板上，放置30℃培养箱中培养2天，直至长出单菌落；再挑取饱满的单菌落划线接种于麦芽汁培养基平板上，放置28℃培养箱中培养2天后，取饱满的菌种接入50mLBMGY液体培养基中，28℃，200rpm摇瓶培养18h，得到种液。

其中BMGY液体培养基重量百分比组成为：胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，121℃，灭菌20min后，加入100mmol/L pH 6的磷酸钾，无氨基氮源13.4g/L，生物素4×10^-4g/L(过滤灭菌)，甘油10g/L。

步骤二：在超净工作台无菌环境中，在火焰的保护下将制得的种液离心10000r/min，10min，收集菌体，并用灭菌蒸馏水摇洗两次后，接入制备得到的黑曲霉高密度发酵培养基中，28℃，200rpm/min摇瓶培养发酵；每隔24h补加0.5mg/L的脯氨酸，至脯氨酸内切酶的酶活缓慢升高或者不再升高，发酵培养120h后，终止发酵，发酵菌浓5-20g/L(以菌体湿重计)。

其中黑曲霉高密度发酵培养基组成为：蔗糖5-15％，玉米粉5-6％，豆饼粉1.5-2.5％，葡萄糖3-4％，酵母粉0.4-0.8％，玉米浆0.1-0.5％，硫酸铵0.05-0.4％，磷酸氢二钾0.05-0.4％，磷酸二氢钾0.05-0.4％，柠檬酸钠0.1-0.5％，消泡剂0.1-1mL，pH值5.0-7.0，121℃灭菌20min。

实施例2 黑曲霉Aspergillus niger的发酵罐高密度发酵

步骤一：同实施例1；

步骤二：无菌操作室中，将制得的种液，接入黑曲霉高密度发酵培养基(同实施例1)中，发酵培养基pH调节至5.8，30℃，200-800r/min培养发酵；根据发酵罐pH和溶氧的状态调整补加0.5mg/L的脯氨酸的流速，pH维持5.0-7.0，溶氧维持35-50％之间，至脯氨酸内切酶的酶活缓慢升高或者不再升高，终止发酵，发酵时长96-200h，发酵菌浓100-300g/L(以菌体湿重计)。

实施例3 脯氨酸内切酶的最适pH以及稳定性

使用脯氨酸作为底物，确定脯氨酸内切酶的最适pH和稳定性。列举表1所展示的各种pH条件下，在37℃孵育30分钟后记录下相对活性，绘制出图1所示的pH曲线。根据该曲线可知，酶在pH 5.0下显示最高活性，在pH 3.5-8.0之间相对活性超过60％，可以确定其最适pH范围为3.5-8.0，而相对于黑曲霉的天然脯氨酸内切酶的最适pH为4.5-5.5，本发明的方法明显扩大了脯氨酸内切酶的最适pH范围。同时从酶的pH稳定性上来看，在pH3.0-7.0之间，其保留了初始活性的80％以上。

表1

从上述数据可知，本发明的脯氨酸内切酶能够在较大的pH范围内保持稳定性，并适于在该范围内发挥酶活性。

实施例4 脯氨酸内切酶的最适温度以及稳定性

使用脯氨酸作为底物，确定脯氨酰内切酶的最佳温度和稳定性。列举表2所展示的各种温度条件下，在pH为5时孵育30分钟后记录下相对活性，绘制出图2所示的温度曲线。根据温度曲线，酶在45℃下显示最高活性，在25℃-60℃相对活性超过60％，相对于来自黑曲霉的天然脯氨酸内切酶的最佳温度是35℃-45℃。同时从酶的温度稳定性上来看，在25℃-50℃，其保留了初始活性的80％以上。

表2

实施例5 脯氨酸内切酶的酶活检测方法

原理：特异性脯氨酸内切酶属于丝氨酸蛋白酶家族，能够对多肽内部的脯氨酸残基进行特异性切割。本方法以碳端苄基保护，氮端以对硝基苯胺作为保护基的脯氨酸为底物，通过检测酶催化体系中的对硝基苯胺浓度进行酶活计算；酶活单位定义为每毫升酶液每分钟内产生1umol对硝基苯胺为一个酶活单位。

酶活测定试剂配制：

母液A(250μMZ-Gly-Pro-pNA(M＝426.43))：准确称取0.0053g Z-Gly-Pro-pNA溶解于50mL 1,4-二氧六环(体积比40％)，超声波助溶，充分溶解后，2mL离心管分装，并保存于-20℃。

母液B(200mM磷酸钾(M＝212.27)溶液)：准确称取42.45g磷酸钾单蒸水溶解后，定容至1L；

母液C(200mM乙酸(M＝60.05)溶液)：准确称取12.01g乙酸，单蒸水定容至1L；

工作液D(乙酸/磷酸钾缓冲液(100mM,pH5.0))：将母液B，C分别用单蒸水稀释2倍后，在pH监测下相互混合，配制成pH5.0，100mM的工作液；

母液E(对硝基苯胺(M＝138.13)，50mM，配制)：准确称取0.173g对硝基苯胺，用工作液D溶解，定容到50mL；

对硝基苯胺标准曲线的绘制：吸取母液E于试管中，用工作液D稀释成终浓度为5，10，20，40，75，100，150μM，总体积为10mL的待测样，充分混匀，编号为1，2，3，4，5，6，7，8；分光光度计预热20min后，在410nm处用工作液D调零；每个样品重复混匀后分别取2.5mL，在410nm条件下测定待测样品1-8号的吸收值，每个样品重复测定3次，记录实验数据；对所记录的实验数据计算平均值，以吸收值为X轴，浓度为Y轴，绘制标准曲线，添加趋势线，建立对硝基苯胺吸收峰和浓度的基本计算公式；

Y＝аX

酶活测定步骤：

取发酵液1mL，10000rpm/min离心2min，取上清液4℃保存备用；取工作液D 1025mL于石英比色皿中，并加入母液A 475uL在410nm处调零；取1000uL PESP发酵上清酶液加入比色皿中，迅速吸打均匀；在410nm处测定吸光值，计时10min，每隔60s记录一次数据；重复测定三次；计算10分钟内吸收值的差值ΔAbs

酶活计算：

酶活(PESPU)计算公式为PESPU/mL＝ΔAbs*а*E/(2.5*0.025)(PPU/mL)

ΔAbs:410nm处吸收峰10分钟内吸收值的差值；а：标准计算常数；E：发酵上清液稀释倍数；

酶活测定结果如表3所示

表3

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合微生物发酵制酶领域的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。