一种在生物合成法生产顺式-3-羟基-l-脯氨酸的系统中有效提高脯氨酸转化率的方法
【技术领域】
[0001] -种在生物合成法生产顺式-3-径基-1H?氨酸的系统中有效提高脯氨酸转化率 的方法，属于微生物基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 径脯氨酸化y化〇xyproline，Hyp)为亚氨基酸，是脯氨酸径基化后的产物，根据其 径基化位置的不同，可分为3-径脯氨酸(3-Hyp)或4-径脯氨酸(4-Hyp)。自然界中反式-4-径 脯氨酸较为常见，顺式-3-径基脯氨酸是动物组织蛋白如胶原等的重要组成部分。顺式- 3-径基A-脯氨酸广泛应用于医药、营养和美容业等方面。
[0003] 目前，国内外生产径脯氨酸的方法主要有3种：水解法，化学合成法W及生物合成 法。水解法主要用于提取动物骨胶原中的反式-4-径脯氨酸[16]，由于顺式-3-径脯氨酸在 骨胶原中含量极少，因而无法通过常见的水解法获得。已有的研究报道中，获取顺式-3-径 脯氨酸的方法主要是化学合成法和微生物转化法。
[0004] 生物合成法能将游离的脯氨酸通过脯氨酸-3-径化酶的催化，转化为顺式-3-径 基-1H?氨酸，但在生物细胞中，游离的脯氨酸也是一种可W被利用的碳源，所W有必要打 断生物细胞的脯氨酸降解途径，W阻止菌体降解脯氨酸。
[000引本发明所提供的使含有重组DNA的顺式-3-径脯氨酸生物合成系统活性增强的方 法，具有重要的工业应用价值。
【发明内容】
[0006] 针对生物合成法生产顺式-3-径基-1H?氨酸时，需降解脯氨酸会限制顺式-3-径 脯氨酸合成等缺点，本发明的目的是提供一种在生物合成法生产顺式-3-径基脯氨酸的 系统中能够有效提高脯氨酸转化率的方法。
[0007] 本发明是一种在生物合成法生产顺式-3-径基-1H?氨酸的系统中有效提高脯氨 酸转化率的方法。其特征是:在利用生物细胞生产顺式-3-径基脯氨酸的过程中，通过打 断生物细胞内的脯氨酸降解途径来提高脯氨酸的有效转化率及顺式-3-径基-1H?氨酸的 产量。
[000引本发明所述重组细胞的构建方法：
[0009] 1.含有脯氨酸-3-径化酶基因的载体的构建
[0010] 根据大肠杆菌密码子的偏好性，利用密码子的简并性在不改变氨基酸序列的基础 上，消除低使用率的密码子，优化脯氨酸-3-径化酶基因，使得其更有利于在大肠杆菌中得 到表达。同时，选用色氨酸串联启动子作为其启动子，对其进行优化，使得径化酶基因得到 更为高效的表达。
[0011] 2.通过敲除基因 putA打断细胞内的脯氨酸降解途径
[001引putA化C: 1.5.99.81.5. 1.12)基因编码的蛋白PutA同时具有脯氨酸脱氨酶 (PRODH)和Δ -化咯嘟-5-簇酸脱氨酶(P5C)两个催化区域，从而将脯氨酸氧化为谷氨酸。首 先，通过PR0DH的作用，脯氨酸被氧化为化咯嘟-5-簇酸(P5C)同时禪合着辅酶Q的还原，之 后，P5C与水自发反应生成谷氨酸-丫 -半醒，再在Δ -化咯嘟-5-簇酸脱氨酶的催化作用下， 转变为谷氨酸。同时化tA蛋白也是一种多功能的DNA结合转录因子，在脯氨酸供应不足的情 况下会作为转录阻遏子从而阻遏基因 putA和PU巧(表达的化巧是主要的脯氨酸转运体）的 表达。
[0013] 敲除putA基因，可W有效的打断细胞内由k脯氨酸降解为谷氨酸的过程，从而积 累更多的心脯氨酸，有利于径脯氨酸的产生。
[0014] 3.重组大肠杆菌的发酵实验
[001引 35°C、220巧m培养2地，包括化21(DE3)AputA(pET21a-pt巧2-册P)，取发酵液测定 顺式-3-径脯氨酸的含量。
【附图说明】
[0016] 图1.顺式-3-径脯氨酸在大肠杆菌细胞中的生物转化途径。
[0017] 图2.色氨酸启动子质粒图谱。
[001引图3.表达质粒祀T21a-pt巧2-册P图谱。
【具体实施方式】
[0019] LB培养基：1 % (W/V)膜蛋白腺，0.5 % (W/V)酵母抽提物，1 % (W/V)化C1，pH 7.0- 7.2。
[0020] Amp(Kan)抗性平板：1 % (W/V)膜蛋白腺，0.5% (W/V)酵母抽提物，1% (W/V)化Cl， 1.5% (W/V)琼脂糖，氨节青霉素(卡那霉素)50yg/mL。
[0021 ] 5XKCM(大肠杆菌转化缓冲液）：0.5MKCl，0.15MCaCl2,0.化MMgCl2。
[00对顺式-3-翔捕氨酸的定量测定:将发酵液离屯、后，取上清，稀释到2.5mL后加于lOmL 试管中，之后加入0.2血化S04 · 5肥0(化S04 ·甜20浓度：0.05M)，然后依次加入0.5mLNa0H (NaOH浓度：2.5M)、0.5血H202 (0.5 % )、0.8血肥S04化2S04浓度：4M)、2血显色剂（显色剂： 称取5g对二甲氨基苯甲醒，用45mL去离子水，缓慢加入55mL正丙醇)摇匀后迅速将试管移至 70°C水浴锅中，保溫3min，再用冷水冷却，最后用紫外分光光度计在560nm波长处测定吸光 值。
[0023] 实施例1:色氨酸串联启动子序列的设计
[0024] 色氨酸串联启动子来源于pt巧L1质粒，质粒图谱如说明书附图2,该质粒的色氨酸 启动子来源于大肠杆菌K12菌株的色氨酸操纵子，是一个适合工业生产应用的强启动子，在 SD序列跟起始密码子序列之间有Cla I酶切位点，同时，色氨酸启动子的-35区上游有化nd 虹酶切位点，运样便于将启动子连接到其他的表达载体上。由于两个色氨酸启动子串联起 来可提高表达强度，因此，根据ptrpLl质粒的色氨酸启动子序列，全基因合成色氨酸串联启 动子。
[0025] 通过优化色氨酸串联启动子，将化nd虹酶切位点AAGCTT修改为EcoR I酶切位点 GAATTC，同时，为了使串联启动子内部的酶切位点单一，因此将两个色氨酸启动子的结合部 位的Cla I酶切位点ATCGAT修改为ATGTCGAC，使得连接处变为Sal I酶切位点，同时，在第二 个色氨酸启动子序列的Cla I酶切位点后面加入一个化nd虹酶切位点AAGCTT，运样可利用 酶切等分子操作来优化SD序列与起始密码子之间的距离，使得目的基因得到高效表达。
[0026] 本实施方式中色氨酸启动子基因序列的原始序列，见SEQ ID NO: 1。本实施方式中 优化的色氨酸串联启动子序列为人工合成;优化的色氨酸串联启动子序列见SEQ ID N0:2。
[0027] 实施例2:脯氨酸-3-径化酶基