专利名称：敲除脯氨酸合成途径提高钝齿棒杆菌精氨酸产量的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及工业微生物生产精氨酸的方法。更具体的，本发明涉及基因工程重组钝齿棒杆菌生产精氨酸的方法。
背景技术：
L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，是合成蛋白质肌酸的重要原料，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物，具有多种独特的生理和药理作用。L-精氨酸在临床医药、食品、化妆品以及有关生物研究领域中用途广泛。发酵法是目前L-精氨酸商业化生产比较有效和经济的方法。随着我国医药营养水平的提高，对精氨酸的需求日益增长，但传统生产L-精氨酸的高产菌株大多采用诱变筛选的方法获得，但此法有盲目性高、工作量大，且存在突变株生理失调、易退化等局限性；DNA重组技术出现以后，人们开始探索利用DNA重组技术调控合成精氨酸代谢途径，以达到提高精氨酸产量的目的。钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)是我国研究者分离到的一种钝齿状、无芽孢的革兰式阳性菌，其突变株在国内氨基酸生产中被广泛应用，但对其遗传背景的研究还处于空白状态。C.crenatum SYPW是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株(菌株的保藏编号为CCTCC NO:M208133), SYPA 5-5是此菌株经过传代5次后得到的菌株，其菌株特性在传代中与SYPW保持一致。对氨基酸生产菌株代谢途径及代谢网络进行有目的的改造从而提高氨基酸的产量是现代工业生物技术的一个主攻目标。对目标菌株进行遗传改造时，经常涉及到多个基因的连续敲除，利用枯草杆菌中sac B基因作为一个条件致死型标记，携带抗生素抗性与sacB双标记的新型整合型载体pKlSmobsacB，对谷氨酸棒状杆菌染色体基因实现了多基因的无痕敲除及基因替代，促进了棒杆菌属的一系列菌株的遗传改造，为棒杆菌代谢工程改造提供了良好的遗传改造手段。
发明内容
本发明主要针对精氨酸合成的竞争旁路代谢关键酶基因进行敲除，以增强目标产物精氨酸合成途径关键酶基因簇表达的同时，削弱脯氨酸合成竞争支路途径的代谢流，最终使L-谷氨酸分解代谢集中在L-精氨酸的合成代谢流从而进一步提高精氨酸的产量。通过对L-精氨酸合成代谢途径的分析，代谢工程改造L-精氨酸生产菌株的另一育种方案就是削弱葡萄糖一L-谷氨酸一L-精氨酸代谢相关竞争途径中的分支代谢流，使得更多的代谢流向合成L-精氨酸及其前体物L-谷氨酸。在钝齿棒杆菌L-精氨酸的合成代谢途径中，以葡萄糖为底物，经过TCA循环中的α -酮戊二酸合成L-谷氨酸，在基因簇argCH编码的7个酶的催化下合成L-精氨酸。而L-Glu除作为合成L-精氨酸的前体物，其代谢流还可以向L-脯氨酸和L-谷氨酰胺合成。对C.crenatum SYPA (相关菌株的保藏编号为CCTCC NO:M208133)发酵L-精氨酸来说，应削弱旁路代谢流量而集中葡萄糖经TCA循环中的α -酮戊二酸一L-谷氨酸一L-精氨酸的代谢流量，因此本发明将对L-精氨酸合成相关竞争途径一脯氨酸的合成进行敲除，根据模式菌株谷氨酸棒杆菌全基因组中ProB基因(GenBank N0.BA000036.3)设计钝齿棒杆菌中L-脯氨酸合成proB基因的敲除，从而提高了钝齿棒杆菌发酵产L-精氨酸的产量而完成了本发明，目前相关研究暂无报道。技术方案如下:(I)以钝齿棒杆菌基因组为模板，分别以proB基因上下游引物进行PCR扩增，其引物序列如下:PproBF EcoRI 5， -CGCGAATTCATGCGTGAGCGCATCTCCAACGCPproBR SalI 5， -CGCGTCGACTTACGCGCGGCTGGCGTAGTTGGACPCR获得长为1，IOObp的目标特异产物，经纯化后与PMD18-T连接，转化JM109，提取质粒，酶切验证并测序。(2)设计引物利用重叠PCR的方法扩增缺少了 300 500bp的缺失型基因proB’，引物序列如下:ΡΔproB R5，-CCCATCCACTAAACTTAAACACGCACGATCACGCTTTCCTGCATCP AproB F 5’ -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGTGTCTGCTGCACGTTTGGCT经两轮重叠PCR获得核苷酸片段经琼脂糖凝胶电泳检测，图1所示为含同源片段proB’与理论大小一致,缺失片段构建成功；将目的片段proB’与pK18mobsacB线性化载体相连构建重组质粒，转化E.coli JM109，并挑取阳性转化子。(3)将经酶切验 证后质粒pK18mobsacB_proB’电击转化进入钝齿棒杆菌，经1800V,5ms电击后涂布于含有LBG+Km固体培养基平板上，30°C培养24 36h，第一次同源重组转化子长出。再分别将目标转化子在含蔗糖的培养基中进行胁迫二次重组筛选，最终在LBG平板上进行划线分离并挑取多个转化子，通过PCR对发生第二次同源重组的菌株进行回复野生型/基因缺失型的鉴定。(4)发生二次同源重组后缺失了 200_300bp的AproB具有约50%的几率替代原基因组中具有功能的proB，因此，在上述LBG平板中随即挑取转化子，提取染色体为模板，以目标基因proB的上下游引物进行PCR扩增，PCR鉴定结果如图2所示。经PCR验证，第
3、5泳道对应的转化子为基因缺失型钝齿棒杆菌AproB。
图1含同源臂片段的缺失型基因proB’的PCR扩增2 二次重组菌株的基因缺失型和回复野生型转化子proB PCR鉴定泳道说明I:DL2000marker ；2,4:回复突变型proB ；3, 5:基因缺失型AproB ；6:λDNA/Hind III marker图3重组钝齿棒杆菌与原始对照菌株摇瓶发酵产酸比较分析(A)原始对照菌株(B)重组钝齿棒杆菌AproB
具体实施例方式实施例1:重组钝齿棒杆菌中谷氨酸激酶酶活力的检测随机选择上述验证的proB基因缺失型转化子在种子培养基中培养至对数生长期，收集菌体经超声波破碎后测定胞内谷氨酸激酶酶活:以L-谷氨酸为底物，在pH 7.0的0.25mL 体系中加入 50mM L-谷氨酸，IOmM ATP,20mM MgCl2, IOOmM 盐酸羟氨，50mM Tris，加Λ 200 μ L粗酶液，充分混匀后置于37°C，30min反应。加入含三氯乙酸的FeCl3反应终止液lmL，3，500g低速离心后取上清液于535nm下测定Y -谷氨酸氧厢酸的吸光值。IU定义为每分钟生成Iymol氧肟酸盐所需的酶量。与对照菌钝齿棒杆菌SYPA 5-5相比，转化子粗酶液中基本测不到ProB编码的谷氨酸激酶酶活力，确定了重组菌SYPA 5-5 AproB失去由谷氨酸激酶催化谷氨酸磷酸化合成L-谷氨酸-5-P的功能。实施例2:重组钝齿棒杆菌Λ proB转化子摇瓶发酵产L-精氨酸种子培养基(g/L):葡萄糖30，玉米浆 20，尿素 1.5，KH2PO4I, (NH4)2S0420,MgSO4.7H20 0.5 ;pH 为 7.0 7.2，装液量 30mL/250mL, 121°C灭菌 20min。发酵培养基(g/L):葡萄糖150(分消)，玉米浆40，生物素8X10_5，L-组氨酸5X 1θΛ MnSO4.H2O 0.02，(NH4) 2S0420, MgSO4.7H20 0.5，KH2PO4L 5，FeSO4.7H20 0.02，CaC0330(分消灭菌)。pH 为 7.0 7.2，装液量 25mL/250mL, 121°C灭菌 IOmin0将上述经酶活验证的重组菌钝齿棒杆菌SYPA 5-5 Δ proB进行摇瓶发酵实验，从新鲜活化的斜面培养基中挑取一满环钝齿棒杆菌(对照菌及重组菌)于种子培养基中(30mL/250mL)，30°C，220r/min往复式摇床培养14 16h,至OD = 0.6时，以5%接种量，发酵96h其L-精氨酸产量比对照菌株钝齿棒杆菌SYPA 5-5显著提高，提高率为20.4%。实施例3:重组钝齿棒杆菌Λ proB转化子5L发酵罐发酵产酸种子培养基(g/L):葡萄糖30，玉米浆 20，尿素 1.5，KH2PO4I, (NH4)2S0420,MgSO4.7H20 0.5 ;pH 为 7.0 7.2，装液量 30mL/250mL, 121°C灭菌 20min。
发酵培养基(g/L):葡萄糖150(分消)，玉米浆40，生物素8X10_5，L-组氨酸5X 1θΛ MnSO4.H2O 0.02，(NH4) 2S0420, MgSO4.7H20 0.5，KH2PO4L 5，FeSO4.7H20 0.02，CaC0330(分消灭菌)。pH 为 7.0 7.2，装液量 25mL/250mL, 121°C灭菌 IOnW93]。5L自控发酵罐分批发酵条件:5L发酵罐中装液量3L，接种量采用5%，30°C，通气量为3L/min，自动流加氨水以控制pH在6.8，采用工厂发酵L-精氨酸专用消泡剂，溶氧自动控制，搅拌转速为600r/min,发酵96h。结果表明:钝齿棒杆菌中proB基因的功能缺失，使得脯氨酸合成的能力大大降低，发酵液中脯氨酸的积累量只有对照菌株的2.7%，同时提高了糖耗，使得精氨酸产量提高，其中精氨酸产量提高了 13.6%。经氨基酸分析仪测定其发酵液中各游离氨基酸含量，如图3、表I所示。表I发酵液中残糖、生长量和各氨基酸含量分析
权利要求
1.一种脯氨酸合成关键酶缺失型基因λ pr0B，其特征是:以保藏编号为CCTCC NO:M208133的C.crenatum SYPA菌株DNA为模板，通过重叠PCR法将获得来自钝齿棒杆菌SYPA的脯氨酸合成关键酶基因ProB中的了 352个核苷酸碱基缺失；重叠PCR的引物序列为:第一轮PCR引物序列:PproBF EcoRI 5’ -CGCGAATTCATGCGTGAGCGCATCTCCAACGCPproBR SalI 5’ -CGCGTCGACTTACGCGCGGCTGGCGTAGTTGGAC第二轮PCR引物序列:PAproB R 5’ -CCCATCCACTAAACTTAAACACGCACGATCACGCTTTCCTGCATCPAproB F 5’ -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGTGTCTGCTGCACGTTTGGCT。
2.一株重组钝齿棒杆菌SYPA 5-5 Λ proB，其特征是将权利要求1所述的缺失AproB基因利用电转化的方法通过同源重组整合至钝齿棒杆菌SYPA 5-5染色体中获得。
3.一种利用权利要求2中所述的重组钝齿棒杆菌发酵生产精氨酸的方法，其特征在于该菌株的脯氨酸的合成显著降低，L-精氨酸的产量显著提高。
全文摘要
L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，具有多种独特的生理和药理作用。本发明主要针对精氨酸合成的竞争旁路代谢关键酶基因进行敲除。以钝齿棒杆菌基因组为模板，分别以proB基因上下游引物进行PCR扩增，利用重叠PCR扩增获得缺失型基因proB’。连接重组质粒pK18mobsacB-proB’电击转化进入钝齿棒杆菌，筛选二次同源重组基因缺失型菌株。将上述重组菌钝齿棒杆菌ΔproB进行摇瓶发酵实验，钝齿棒杆菌中proB基因的功能缺失，使得脯氨酸合成的能力大大降低，同时提高了糖耗，发酵液中脯氨酸的积累量只有对照菌株的2.7％，从而使目标氨基酸L-精氨酸产量提高。
文档编号C12R1/15GK103173466SQ20121021042
公开日2013年6月26日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者饶志明, 许正宏, 徐美娟, 孙红梅, 窦文芳 申请人:江南大学