一种高产l-精氨酸钝齿棒杆菌分批发酵优化工艺的制作方法
【专利摘要】本实验室前期对钝齿棒杆菌发酵生产L-精氨酸的诱变育种以及菌株代谢工程改造进行了系统的研究，相关成果已授权国家发明专利4项。基于前期研究，本发明提供了一种高产L-精氨酸钝齿棒杆菌分批发酵优化工艺，是在之前利用钝齿棒杆菌发酵生产L-精氨酸的工艺基础上进行了改进，主要通过种子培养以及发酵工艺改进来提高L-精氨酸产量。该工艺种子培养过程中，种子生长迅速且最终菌浓较高。该工艺发酵过程中发酵培养基成分简单，无需添加维生素、氨基酸等微量元素，工艺控制简单，菌株发酵性能稳定，L-精氨酸产量达到56.3g/L，为国内目前最高产量之一；糖酸转化率达到32％，为国内目前最高水平。
【专利说明】一种高产L-精氨酸钝齿棒杆菌分批发酵优化工艺
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵生产氨基酸【技术领域】，具体涉及一种提高L-精氨酸发酵产量和葡萄糖利用率的发酵工艺。
技术背景
[0002]L-精氨酸是人和动物体内的一种半必需氨基酸，是多种生物活性物质的合成前体，具有多种独特的生理和药理作用。随着对精氨酸的生物学功能不断地深入研究和了解，精氨酸在医药、食品、饲料工业上的用途越来越广泛。
[0003]L-精氨酸的生产方法有水解法和发酵法。我国现有的生产厂家目前大多仍主要采用蛋白质水解法来生产L-精氨酸，该方法对环境污染严重且收率不高，不适用于大规模生产。发酵法生产L-精氨酸工艺相对简单且对环境友好，具有很大的发展潜力。但是，国内以微生物发酵生产L-精氨酸，产酸水平普遍较低，成本较高，生产水平和产量不能满足国内需求。因此，提高L-精氨酸的发酵产酸水平和葡萄糖利用率非常重要。
[0004]本实验室前期工作中通过诱变育种筛选得到高产精氨酸Corynebacteriumcrenatum SYPA5-5，并对该菌株的L-精氨酸合成代谢途径进行了系统的分析；对1^_精氨酸合成代谢中的反馈抑制与反馈阻遏调控作用进行了研究，解除了菌株SYPA5-5中的反馈抑制；同时对精氨酸合成的竞争旁路代谢关键酶基因进行敲除等代谢改造，在增强目标产物精氨酸合成途径关键酶基因簇表达的同时，削弱脯氨酸、谷氨酰胺等竞争支路途径的代谢流，最终使L-谷氨酸分 解代谢集中在L-精氨酸的合成代谢流从而提高了精氨酸的产量，相关成果已授权国家发明专利4项。
[0005]对微生物发酵生产精氨酸而言，合适的发酵工艺对保证产酸水平、菌株发酵性能的稳定性、原料利用率至关重要。所以有必要通过发酵工艺的优化尤其是培养基的优化提高精氨酸产量、菌株发酵性能稳定性、糖酸转化率，降低生产成本。
【发明内容】
[0006]本发明所使用的菌株为Corynebacterium crenatum SYPA5-5,是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株。
[0007]本发明的目的在于提供一种优化的用于L-精氨酸发酵生产的发酵工艺，该工艺控制简单，菌株发酵性能稳定，L-精氨酸产量以及葡萄糖利用率得到显著提高。
[0008]本发明的技术方案:利用优化过的种子培养基培养发酵种子，所述的种子培养基成分为:葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，硫酸铵20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，碳酸钙lg/L ;种子培养过程采用700mL带挡板的三角瓶，培养温度为30°C，摇床转速160r/min，培养时间24h ；培养好的种子接入优化过的发酵培养基中，优化过的发酵培养基成分为:葡萄糖170g/L，酵母粉8g/L，硫酸铵20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L ;发酵过程温度为30°C，发酵罐搅拌转速600r/min，50%氨水控制pH7.0，通气量3L/min，发酵至葡萄糖耗尽结束。
[0009]本发明的有益效果:利用本发明所提供的种子培养工艺，发酵种子生长迅速且最终菌浓较大，接种发酵培养基后菌体生长延滞期明显缩短，显著提高了精氨酸的发酵效率。利用本发明所提供的精氨酸发酵工艺，发酵培养基成分简单，无需添加维生素、氨基酸等微量元素，工艺控制简单，显著提高了菌株发酵性能的稳定性以及L-精氨酸的产量和葡萄糖的利用率。
【具体实施方式】:
[0010]对照实施例:种子培养基成分:葡萄糖30g/L,玉米衆20g/L,尿素1.5g/L,磷酸二氢钾lg/L，硫酸铵20g/L，硫酸镁0.5g/L ;发酵培养基成分:葡萄糖120g/L，玉米浆40g/L，生物素8X 10_5g/L，组氨酸5X 10_4g/L，硫酸锰0.02g/L,硫酸铵20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸亚铁0.02g/L。种子培养过程采用普通250mL三角瓶，培养温度为30°C，摇床转速160r/min，培养时间14h ;发酵过程温度为30°C，发酵罐搅拌转速600r/min，50%氨水控制pH7.0，通气量3L/min，发酵至葡萄糖耗尽结束。发酵结束后L-精氨酸产量为33.4g/L，糖酸转化率为28 %。
[0011] 实施例:种子培养基成分为:葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，硫酸铵20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，碳酸钙lg/L ;发酵培养基成分为:葡萄糖170g/L，酵母粉8g/L，硫酸铵20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L。种子培养过程采用700mL带挡板的三角瓶，培养温度为30°C，摇床转速160r/min，培养时间24h ;发酵过程温度为30°C，发酵罐搅拌转速600r/min，50%氨水控制pH7.0,通气量3L/min，发酵至葡萄糖耗尽结束。发酵结束后L-精氨酸产量为56.3g/L，糖酸转化率为32%。
【权利要求】
1.一种高产L-精氨酸钝齿棒杆菌分批发酵优化工艺，是基于实验室前期的微生物发酵生产L-精氨酸研究工作，本实验室前期工作中通过诱变育种筛选得到高产精氨酸钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5,并对其L-精氨酸生物合成途径进行了系统的代谢工程改造，显著提高了 L-精氨酸产量，相关成果已授权国家发明专利4项，一种高产L-精氨酸钝齿棒杆菌分批发酵优化工艺，其特征在于，种子培养基含有葡萄糖、酵母粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、碳酸钙；发酵培养基含有葡萄糖、酵母粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁；他们的含量如下: 种子培养基:葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，硫酸铵20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，碳酸钙lg/L ； 发酵培养基:葡萄糖170g/L，酵母粉8g/L，硫酸铵20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L。
2.根据权利要求1所述的一种L-精氨酸分批发酵优化工艺，其特征在于，所述发酵优化工艺采用权利要求1所述的种子培养基培养c.crenatum SYPA5-5发酵种子,采用权利要求I所述的发酵培养基用于C.crenatum SYPA5-5发酵生产L-精氨酸。
3.根据权利要求1所述的发酵优化工艺，其特征在于，种子培养过程采用带挡板的三角瓶，培养温度为30°C，摇床转速160r/min，培养时间24h ;发酵过程温度为30°C，发酵罐搅拌转速600r/min，50% 氨水控制pH7.0，通气量3L/min，发酵至葡萄糖耗尽结束。
【文档编号】C12P13/10GK103981231SQ201410249335
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】许正宏, 饶志明, 满在伟, 徐美娟, 杨套伟, 张显, 耿燕 申请人:江南大学