专利名称:加强表达转运蛋白LysE提高钝齿棒杆菌L-精氨酸的产量的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过加强IysE基因在钝齿棒杆菌的表达提高L-精氨酸产量，属于基因工程技术领域：
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背景技术：
L-精氨酸是人体和动物体内的半必需 碱性氨基酸，是合成蛋白质肌酸的重要原料，也是生物体尿素循环的ー种重要中间代谢产物，具有多种独特的生理和药理作用。L-精氨酸在临床医药、食品、化妆品以及有关生物研究領域中用途广泛。发酵法是目前L-精氨酸商业化生产比较有效和经济的方法。
増加合成途径中酶的表达量是提高L-精氨酸合成途径的代谢通量最终提高其产量最重要的策略之一，这也是代谢工程育种的主要手段，但研究发现，微生物细胞内氨基酸合成的通量増加会导致细胞内产物的积累量远高于野生型菌株，这表明改造后的菌株虽然一定程度上増加了目的产物的产量但产物的转运能力却是有限的。降低胞内产物L-精氨酸浓度解除其合成代谢途径中关键酶的反馈抑制和反馈阻遏有利于进ー步提高L-精氨酸合成途径的代谢通量实现L-精氨酸的过量生产。
在细菌中，氨基酸转运系统成分非常复杂，它由许多具有特定结构和功能的转运蛋白家族成员组成。在诸多氨基酸转运蛋白中，来源于谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸转运蛋白LysE的研究最多，1996年，Vrl jic等人成功克隆了 L-赖氨酸转运蛋白基因lysE，该基因的产物LysE由236个氨基酸构成，分子量约为25kD，其结构和功能都很新颖。2001年，德国学者L. Eggeling等人通过弓I物延伸及融合表达等实验证明位于L-赖氨酸转运蛋白基因IysE上游的IysG基因是其转录的正调控基因，并找出了 IysE基因转录的起始位点。他们还发现，尽管L-赖氨酸转运蛋白对L-精氨酸表现出较弱的亲和カ(Km ^ 20mM)，但L-赖氨酸转运蛋白LysE几乎以相同的速率从细胞内向细胞外转运L-赖氨酸和L-精氨酸。
综上所述，转运蛋白LysE在降低胞内L-精氨酸浓度解除其合成代谢途径中关键酶的反馈抑制和反馈阻遏，进ー步提高其产量发挥重要作用，研究IysE基因编码的转运蛋白LysE对实现精氨酸的过量生产有着非常重要的生产指导意义。
针对L-精氨酸发酵中代谢通量的増加引起胞内产物浓度的过度积累，抑制L-精氨酸产量进ー步提高的问题，本发明首次以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5为研究菌株，通过加强IysE基因在钝齿棒杆菌的表达降低L-精氨酸的胞内浓度，以解决包内产物积累引起的反馈阻遏及反馈抑制问题。C. crenatum SYPW是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株(菌株的保藏编号为CCTCC NO M208133)，SYPA 5-5是此菌株经过传代5次后得到的菌株，其菌株特性在传代中与SYPW保持一致。目前，尚未见关于钝齿棒杆菌精氨酸转运蛋白LysE的具体研究报道。
发明内容
本发明首先从钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5 (菌株的保藏编号为CCTCC NO M208133)中克隆出编码转运蛋白的基因lysE，并将该基因与穿梭表达质粒pJC-tac连接(pJC-tac详细构建过程及其特征已在已申请的专利中公开,专利公开号CN101397548A)，成功构建了携带IysE基因的穿梭表达质粒pJC-tac-lysE，并电转入钝齿棒杆菌SYPA5-5中，获得加强IysE基因表达的重组钝齿棒杆菌pJC-tac-lysE/C. crenatum。并对原始菌及重组菌进行平板显色定性检测和基本培养基培养实验考查L-精氨酸转运情况，验证了 L-精氨酸转运蛋白LysE在钝齿棒杆菌中的过量表达，说明增强LysE的表达能够一定程度上降低胞内L-精氨酸的浓度提高L-精氨酸的产量。
基于以上研究，对原始菌以及重组菌进行250mL摇瓶发酵实验，结果表明，与原始菌株相比，重组菌精氨酸产量提高了约12%，产率最大时提高了 11. 1%，且发酵周期有所缩短。
图I重组质粒pMD18-T_lysE酶切验证结果
I. DNAMaker DL2000 ；2. PCR product of IysE gene ;3.pMD18-T_lysE/BamHI ;
4.pMD18-T-lysE/BamHI+SalI；5.入DNA/Hindlll
图2C. crenatum SYPA 5-5 与 C. glutamicum ATCC 13032 精氨酸转运蛋白基因IysE核苷酸对比
图3重组穿梭表达质粒pJC-tac-lysE的酶切验证
I. DNA Marker DL2000 ；2.IysE gene ;3.pJC-tac/Sall ;4.pJC-tac-lysE/Sall ;
5.pJC-tac-lysE/Sall+BamHI；6.入DNA/Hindlll
图4抗性平板上重组钝齿棒杆菌pJC-tac-lysE/C. crenatum 5-5阳性转化子的筛选
图5平板显色法检测两种钝齿棒杆菌L-精氨酸分泌情况
3. C. crenatum ；4. pJC-tac-lysE/C. crenatum
图6钝齿棒杆菌基本培养基中胞内外L-精氨酸水平
注图中测量值为三个平行的平均值A.细胞菌体量；B.胞内L-精氨酸含量；C.胞外L-精氨酸含量
图7钝齿棒杆菌各菌株250mL摇瓶发酵过程曲线
注图中测量值为三个平行的平均值A.菌体生长量g/L ；B.葡萄糖残留量％
图8钝齿棒杆菌各菌株250mL摇瓶发酵过程曲线
注图中测量值为三个平行的平均值A.胞内L-精氨酸含量g/g ；B.胞外L-精氨酸含量(产量)g/L ；C. L-精氨酸的产率g/L/h
图9钝齿棒杆菌各菌株中氨基酸含量的分析
A C. crenatum SYPA5-5B pJC-tac-lysE/C. crenatum
具体实施方法
实施例I :目的基因的扩增及重组钝齿棒杆菌的构建
以C. crenatum SYPA5-5 染色体基因组为模板，以 CclysE F BamHI 和 CclysER Sal I为引物，PCR扩增获得含有BamHI和Sal I两个酶切位点的IysE基因，与PMD18-T Vector 连接，构建克隆载体 pMD18-T_CclysE (BamHI+Sal I)，将克隆载体pMD 18-T-CclysE (BamHI+Sa 11)转化至受体大肠杆菌中，涂布于含Amp的LB琼脂平板上，37°C培养过夜后，随机挑取阳性转化子酶切鉴定后送上海生工测序并进行序列分析，用BamHI和Sal I双酶切得到含有BamHI和Sal I两个酶切位点的IysE基因，与同样双酶切的穿梭表达载体pJC-tac连接,得到重组穿梭表达载体pJC-tac-lysE酶切验证,后以电击转化的方法转化钝齿棒杆菌C. crenatum5-5在Kan抗性LB平板上筛选阳性转化子，即得到重组纯齿棒杆菌 pJC-tac-lysE/C. crenatum5_5。
以C. crenatu m SYPA5_51ysE基因(CclysE)为模板，设计两条引物，PCR扩增CclysE,引物设计如下
CclysE F BamHI :5’ -CGCGGATCCATGGAAATCTTCATTACAGG-3
CclysE R Sal I :5’ -CGCGTCGACCTAACCCATCAACATCAG-3，
PCR扩增获得基因产物如图I泳道2所示，重组质粒pMD18-T_lysE以限制性内切酶BamHI、Sail单双切验证如图I泳道3、4所示，重组质粒pMD18-T_lysE双酶切所得片段与PCR扩增基因产物一致，说明重组克隆载体连接正确。对重组质粒pMD18-T-lysE进行测序，序列分析表明插入片段分别为702bp的序列，且编码的多肽分别含有233个氨基酸，相对分子量大小分别约为25kDa。将CclysE基因序列与NCBI数据库中谷氨酸棒杆菌C. glutamicumATCC13032 基因组对比，结果表明 CclysE 与 C. glutamicum ATCC13032 中的IysE基因核苷酸序列同源性为99. 7%，氨基酸序列同源性为100%，如图2。
重组穿梭表达质粒pJC-tac-lysE的酶切验证结果如图3所示，重组质粒pJC-tac-lysE经BamHI和SalI双酶切所得片段与IysE片段一致，说明质粒pJC-tac-lysE构建正确，以电击转化的方法转化钝齿棒杆菌C. crenatum 5-5在Kan抗性LB平板上筛选阳性转化子，结果如图4，随机挑取阳性转化子，提取质粒酶切验证，结果与图4 一致，表明重组钝齿棒杆菌构建成功。
实施例2 :钝齿棒杆菌原始菌及重组菌L-精氨酸分泌情况的检测及胞内外L-精氨酸含量分析
基本培养基中以IO5个/mL细胞浓度混入E. coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株制成检测平板，将本发明中构建的钝齿棒杆菌重组菌pJC-tac-lysE/C. crenatum 5-5 (编号4)及原始菌C. crenatum 5-5 (编号3)以相同量点种至该平板，30°C培养3_5d，于超净工作台均匀喷洒无菌I U g/mL TTC溶液(膜过滤除菌)，37°C放置l_2h，观察平板上显色情况。菌株周围红色圈的大小是由L-精氨酸缺陷型的大肠杆菌的生长情况决定的，大肠杆菌的生长与菌株L-精氨酸的分泌量呈正相关。结果如图5，重组菌pJC-tac-lysE/C. crenatum(编号4)的红色圈直径比原始菌株(编号3)大，因此推断pJC-tac-lysE/C. crenatum比原始菌株的L-精氨酸分泌能力强。
将钝齿棒杆菌和重组菌分别接种至LBG培养基(装液量50mL/250mL) 30°C预培养过夜，5000g离心弃上清，以冰冷的0. 9% NaCl洗涤细胞沉淀2 3次，接种至CGX II培养基30°C培养过夜5000g离心IOmin收获细胞，以冰冷的CGX II培养基洗涤细胞2次，重悬于CGXII培养基中(装液量50mL/250mL，起始OD562约为2)，30°C震荡培养，3h内每隔20min取样，测定细胞培养物吸光值OD562，折算为细胞干重g/L DCff0培养液经5000g离心lOmin，上清中L-精氨酸含量即为胞外产物含量；胞内L-精氨酸含量测定需先以超纯水洗涤细胞
3-4次后悬浮于等体积PBS缓冲液中，加入溶菌酶溶液至终浓度10mg/mL37°C恒温水浴震荡过夜，次日经沸水浴30min彻底破壁，IOOOOg高速离心IOmin上清中L-精氨酸含量即为胞内产物含量，采用氨基酸自动分析仪进行测定。结果如图6所示，两株菌的菌体生长量均是随着培养时间的延长逐渐增加，但两菌株之间没有明显的差异，IOOmin之前原始菌的生长量略高于重组菌，这可能是由于培养开始重组菌受L-精氨酸转运蛋白LysE表达的影响生长比较缓慢(图6A)。重组菌与原始菌胞内外L-精氨酸水平的增长趋势基本一致，但在Ih之后重组菌胞内L-精氨酸水平稳定低于原始菌，且在整个过程中重组菌的胞外L-精氨酸含量均高于原始菌(图6B、C)，3h时，重组菌胞外L-精氨酸含量高于原始菌13%，说明转运蛋白LysE的过量表达可以一定程度上降低胞内产物浓度，提高胞外L-精氨酸含量。
以上结果验证了转运蛋白LysE在钝齿棒杆菌中的过量表达，表明IysE基因的过 量表达可以促进钝齿棒杆菌L-精氨酸的分泌，降低胞内L-精氨酸的浓度从而解除胞内产物积累引起的反馈抑制，进一步提高L-精氨酸的产量。
实施例3 :钝齿棒杆菌原始菌及重组菌的发酵性能验证
基于实例2的结果验证,对重组菌pJC-tac-lysE/C. crenatum 5-5以及原始菌C. crenatum 5_5进行250mL摇瓶发酵实验，从发酵角度对钝齿棒杆菌中IysE基因的过量表达对L-精氨酸产量的提高作用进行验证。往复式摇床转速为200r/min，30°C，发酵96h，每12h取一次样，对各发酵时间点各组样品的菌体生长量、葡萄糖的消耗情况、胞内外L-精氨酸的含量(胞外含量即为产量)及产率进行跟踪测定对比分析，同时对各菌株发酵96h的发酵液中各种氨基酸的含量进行比较。结果分别如图7 9。
图7A表明，发酵过程中各菌株菌体生长趋势一致，并无明显差异，重组菌较原始菌而言发酵36h之前生长量偏低，之后两种菌生长趋于一致。这可能是由于发酵开始重组菌受L-精氨酸转运蛋白LysE表达的影响生长比较缓慢，随着发酵的进行，L-精氨酸在胞内不断积累，原始菌的生长变慢，而重组菌由于L-精氨酸转运蛋白的增强表达使得细胞内L-精氨酸维持在一个较低的水平，其优势得以逐渐体现出来。如图7B所示，发酵过程中各菌株葡萄糖消耗情况差异不大，重组菌糖耗速度较原始菌快一些，在发酵84h时，发酵液中葡萄糖已基本消耗完毕，说明重组菌pJC-tac-lysE/C. crenatum的发酵周期有所缩短,这对降低钝齿棒杆菌发酵能耗具有一定意义。
如图8A所示，发酵36h之后，原始菌胞内L-精氨酸水平约为40mg/gDCW，而重组菌胞内L-精氨酸水平降到大约30mg/gDCW，且稳定维持这一水平。同时，对于各菌株L-精氨酸的产量(即L-精氨酸的胞外含量)进行对比，如图SB所示，在整个发酵过程中重组菌L-精氨酸的产量均高于原始菌，且重组菌L-精氨酸最终产量达到33. 6g/L，较原始菌提高了约12%。如图SC所示，发酵过程中各菌株L-精氨酸产率均是呈先增加到一个最大值后开始降低，48h达到最大值,重组菌pJC-tac-lysE/C. crenatum在48h产酸速率达0. 5g
比原始菌提高了 11. I %，且在发酵过程中重组菌产率均高于原始菌。
以上结果表明，在L-精氨酸工业生产菌株C. crenatum SYPA5-5中增强转运蛋白LysE的表达有助于提高发酵过程中L-精氨酸的产率，最终L-精氨酸的发酵产量较原始菌有所提高，且发酵周期有所缩短。这可能是由于增加L-精氨酸转运蛋白的表达量会降低细胞内L-精氨酸水平从而在一定程度上解除对L-精氨酸合成关键酶的反馈抑制和反馈阻遏，进而增加L-精氨酸的合成通量，最终使得L-精氨酸发酵产量较出发菌有所提高同时也加快了底物转化的速率。[0042]另外对钝齿棒杆菌各菌株发酵96h的发酵液中17种游尚氨基酸含量进行分析，如图9及表I所示，比较两株菌发酵液的L-精氨酸和L-赖氨酸含量发现，重组菌发酵液中这两种氣基酸的含量均提1 了 12%。
表I钝齿棒杆菌发酵液中氨基酸含量分析
权利要求
1.一种加强了 IysE基因表达的重组钝齿棒杆菌pJC-tac-lysE/C. crenatum,其特征在于将精氨酸转运蛋白编码基因IysE构建成为重组穿梭表达质粒pJC-tac-lysE并克隆至保藏编号为CCTCC NO M208133的钝齿棒杆菌中从而提高了钝齿棒杆菌向胞外分泌精氨酸的能力，并且IysE基因是来源于保藏编号为CCTCC NO M208133的钝齿棒杆菌。
2.将权利要求
I所述的重组钝齿棒杆菌用于L-精氨酸发酵上的应用，其特征是与CCTCCNO M208133的钝齿棒杆菌相比，重组菌精氨酸产量提高了约12%，产率最大时提高了 11. I %，且发酵周期有所缩短。
专利摘要
L-精氨酸从胞内分泌到胞外依靠的是转运蛋白LysE。本发明以首次以钝齿棒杆菌为研究菌株，构建了携带自身lysE基因的穿梭表达质粒pJC-tac-lysE并电转入钝齿棒杆菌中，获得加强lysE基因表达的重组钝齿棒杆菌。并对原始菌及重组菌进行平板显色定性检测和基本培养基培养实验考查L-精氨酸转运情况，验证了L-精氨酸转运蛋白LysE在钝齿棒杆菌中的过量表达，说明增强LysE的表达能够一定程度上降低胞内L-精氨酸的浓度提高L-精氨酸的产量。并对原始菌和重组进行250mL摇瓶发酵实验，结果表明，重组菌L-精氨酸产量提高了约12％，产率最大时提高了11.1％，且发酵周期有所缩短。
文档编号C12P13/10GKCN102747025SQ201210210386
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月20日
发明者刘巧利, 张博慧, 徐美娟, 杨娟, 窦文芳, 许正宏, 饶志明 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan