一种提高γ-谷氨酰转肽酶表达量的方法
【专利摘要】一种提高γ?谷氨酰转肽酶表达量的方法，主要是将GGT基因3′末端终止子后添加形式为AAA,AAAAAA,TTTAAA,AAATTTAAA,TTTAAATTTAAA,TTTAAAAAAAAA的poly(A/T)尾巴，提高其在钝齿棒杆菌中的表达量，属于基因工程和酶工程领域。本发明在于通过在GGT基因3′末端终止子后添加形式为TTTAAA的poly(A/T)尾巴，发现与不添加poly(A/T)尾巴的对照菌相比，GGT在钝齿棒杆菌中的表达量提高了2倍多，这说明添加形式为TTTAAA的poly(A/T)尾巴有利于提高GGT在钝齿棒杆菌中的表达量。
【专利说明】
一种提高γ -谷氨酰转肽酶表达量的方法
技术领域
[0001] -种提高γ -谷氨酰转肽酶表达量的方法，主要是通过基因工程技术提高γ -谷氨 酰转肽酶的表达量，属于基因工程和酶工程领域。 技术背景
[0002] L-茶氨酸，化学名称为Ν-乙基-γ-L-谷氨酰胺，是一种几乎只存在于茶类植物中 的游离氨基酸，决定茶叶的风味和品质。茶氨酸具有多种重要的生理功能:放松减压作用； 降血压作用;抑制咖啡因引起的兴奋反应;提高学习能力;抗肿瘤;控制体重等。早在1985年 美国食品和药物管理局(FDA)已经认证L-茶氨酸为一般公认安全的物质(GRAS)，在食品中 使用沒有特定用量限制。鉴于茶氨酸上述诸多生理功效及其绝对安全性，其作为一种食品 组分及饮品添加剂的需求量日益增加。进入21世纪，酶法转化合成以其优越性日益受到青 睐，因此研究人员重心也集中于酶法合成L-茶氨酸，可用于合成茶氨酸的酶包括谷氨酰胺 合成酶，谷氨酰胺酶和γ -谷氨酰转肽酶(GGT)。谷氨酰胺合成酶受ATP供应限制，谷氨酰胺 酶产物对底物的转化率低，γ -谷氨酰转肽酶脱颖而出。
[0003] γ-谷氨酰转肽酶分布广泛，负责催化谷胱甘肽及其类似物的γ-谷氨酰键的断 裂，并将生成的γ-谷氨酰基团转移给水(此时即为水解反应)或者其他氨基酸(转肽反应）。 利用GGT的转肽功能，选定L-谷氨酰胺和乙胺作为供体和受体时，即可实现酶法生成L-茶氨 酸。
[0004] 酶法催化中生产菌株的选育至关重要。目前γ -谷氨酰转肽酶的表达多选用大肠 杆菌体系，江南大学吴敬教授课题组利用大肠杆菌的分泌型质粒实现了 GGT蛋白的胞外分 泌，但是该大肠杆菌宿主表达体系仍存在一定的安全隐患。
【申请人】前期成功在B. subtil is 中实现了该蛋白的过量表达，胞外获得可观的蛋白酶含量。上述研究为我们实验提出了要 求和思路:生产菌株的绝对安全性和目的蛋白能否在宿主菌中实现胞外分泌。钝齿棒杆菌 SDNN403(保藏编号CGMCC0890，专利号为:ZL 03112896.3)是经过多级诱变筛选获得、适用 于多种氨基酸高产的安全菌株，具备高效表达外源蛋白的潜力。
【申请人】前期利用PXMJ19质 粒，实现了B · subt i 1 i s 168来源的GGT基因在C · crenatum SDNN403的表达。同时发现GGT蛋 白的信号肽片段可以在钝齿棒杆菌中被识别，从而引导该目的蛋白分泌到胞外，胞外GGT活 力为10.31U/mL，并申请了相关专利（申请号201610454875.8)，但是，相比于工业化生产要 求，该酶的表达量偏低，会增加上游生产成本。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于基于前期申请的专利（申请号201610454875.8)相关内容为基 础，提供一种进一步提高GGT在钝齿棒杆菌中表达量的方法，具体内容是将GGT基因3'末端 终止子后添加形式为 AAA，AAAAAA，TTTAAA，AAATTTAAA，TTTAAATTTAAA，TTTAAAAAAAAA 的 poly (A/T)尾巴，提高其在钝齿棒杆菌中的表达量，为钝齿棒杆菌作为宿主表达外源蛋白及茶氨 酸的生产均提供了有益的指导。
[0006]本发明的技术方案：
[0007] 1 ·重组质粒 pXMJ19_tacM_ggtM 的构建
[0015]以
【申请人】前期申请的专利（申请号201610454875 · 8)所公开的pXMJ19-tacM-ggt载 体为模板，选用PrimerSTAR HS高保真酶，利用引物ggt-F和引物ggt-Rl-6中一条为引物分 别对应扩增出6条目标基因片段ggtM(l-6)，分别将胶回收获得的上述6条DNA片段ggtMl-6 与
【申请人】前期申请的专利（申请号201610454875.8)所公开的?乂1〇19-丨&(^载体连接，获得6 个重组质粒？乂]\1119吋3〇]\1飞8七]\1(1-6)〇
[0016] 2突变GGT在钝齿棒杆菌SDNN403中的表达
[0017] 将构建好的6个重组质粒pXMJ19-tacM-ggtM(l_6)分别单个电转化法转化至 C.glutamicum SDNN403感受态中，在氯霉素抗性平板上筛选阳性重组子，提取质粒进行酶 切验证，验证正确即为构建成功的重组菌C. glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM_ggtM( 1-6)。上述菌株分别接种至含有10yg/mL氯霉素的LBG液体培养基中30°C培养过夜，次日以 10 %的接种量转接至25mL的钝齿发酵培养基中培养，添加 IPTG终浓度为0.8mM进行诱导表 达，完整培养周期为96h。培养结束后8000rpm离心20min，收集上清液即为胞外酶液，4°C保 存。细胞沉淀用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤3次，重悬浮于该缓冲液中，超声波破碎仪破 碎细胞。lOOOOrpm离心30min去除沉淀细胞碎片，上清即为胞内蛋白液，置于4°C保存。均用 于后续GGT的酶活测定。
[0018] 4 GGI1酶活力的测定
[0019] GGT转肽酶活的测定原理是利用酶的转肽功能，催化底物γ -L-谷氨酰对硝基苯胺 (γ-GpNA)的γ -谷氨酰基团转移到受体双甘二肽，随之生成的对硝基苯胺在410nm处有特 殊吸收，通过测定该反应生成的对硝基苯胺的浓度来衡量GGI1酶活力。
[0020] lmL反应体系中包含：50mmol/L硼酸-NaOH缓冲液(pH 10·0)，2·5mmol/L γ -GpNA， 60mmol/L双甘二肽，20yL适当稀释的酶液。37°C反应10min后，添加125μΙ^度为3.5mol/L的 醋酸终止反应。以不添加双甘二肽受体的反应液作为对照，其他处理均和实验组相同， 410nm处测定吸光度差值。酶活单位定义为：lmin内经由转肽反应催化生成Ιμπιο?对硝基苯 胺(p-Nitrophenylamine)所需酶量即为一个酶活单位(U)。
[0021] 本发明的有益成果：本实验实现了 B. subtilis 168来源的GGT基因在 C.glutamicum SDNN403的高效表达。C.glutamicum SDNN403是一株适合于氨基酸生产的安 全菌株，其细胞培养可以达到的高密度水平也使其具备作为宿主菌表达外源蛋白的潜能， 因此该表达系统不但可以满足工业生产的安全性，而且可以满足工业生产的强度。
【附图说明】
[0022] 无
[0023] 具体实施方法
[0024] 下面结合实施例，对本发明进一步说明。
[0025] 实施例1:重组质粒pXMJ19-tacM_ggtM的构建
[0033]以
【申请人】前期申请的专利（申请号201610454875 · 8)所公开的pXMJ19-tacM-ggt载 体为模板，选用PrimerSTAR HS高保真酶，利用引物ggt-F和引物ggt-Rl-6中一条为引物分 别对应扩增出6条目标基因片段ggtM(l-6)，分别将胶回收获得的上述6条DNA片段ggtMl-6 与
【申请人】前期申请的专利（申请号201610454875.8)所公开的?乂1〇19-丨 &(^载体连接，获得6 个重组质粒？乂]\1119吋3〇]\1飞8七]\1(1-6)〇
[0034] 实施例2:C.glutamicum SDNN403重组菌的构建及GGT蛋白表达情况分析
[0035] 将构建好的6个重组质粒pXMJ19-tacM-ggtM(l_6)分别单个电转化法转化至 C.glutamicum SDNN403感受态中，在氯霉素抗性平板上筛选阳性重组子，提取质粒进行酶 切验证，验证正确即为构建成功的重组菌C. glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM_ggtM( 1-6)。上述菌株分别接种至含有10yg/mL氯霉素的LBG液体培养基中30°C培养过夜，次日以 10 %的接种量转接至25mL的钝齿发酵培养基中培养，添加 IPTG终浓度为0.8mM进行诱导表 达，完整培养周期为96h。培养结束后8000rpm离心20min，收集上清液即为胞外酶液，4°C保 存。细胞沉淀用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤3次，重悬浮于该缓冲液中，超声波破碎仪破 碎细胞。lOOOOrpm离心30min去除沉淀细胞碎片，上清即为胞内蛋白液，置于4°C保存。均用 于后续GGT的酶活测定。
[0036]实施例3:重组菌株GGI1酶活力测定
[0037]重组菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19_tacM-ggtM( 1-6)和对照菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM-ggt分别单独在精氨酸高产培养基中培养结束后，分别测定胞内破 碎上清液及发酵上清中GGT的酶活力，结果如表1所示，重组菌株R1，R4，R6的GGI 1酶活力和对 照菌相对，菌株R2未能检测到GGT酶活力，R5酶活力仅为对照菌的1/10。而菌株R3的GGT活力 最高，为对照菌的2倍，说明在GGT基因3'末端终止子后添加形式为TTTAAA的poly(A/T)尾巴 有利于提高GGT在钝齿棒杆菌中的表达量和产量。
[0038] 表1重组菌GGI1酶活测定
【主权项】
1. 一种提高γ -谷氨酰转肽酶表达量的方法，其特征是，在GGT基因3'末端终止子后添 加 poly(A/T)尾巴，并将带有poly(A/T)尾巴的γ-谷氨酰转肽酶基因导入微生物体内进行 发酵培养生产γ -谷氨酰转肽酶。2. 权利要求1所述的poly(A/T)尾巴碱基序列，优选但不限于ΤΤΤΑΑΑ。3. -种提高γ -谷氨酰转肽酶在重组钝齿棒杆菌表达量的方法，其特征是:利用权利要 求1所述方法，将γ -谷氨酰转肽酶基因3'末端终止子后添加形式为ΤΤΤΑΑΑ的poly(A/T)尾 巴，随后将带有形式为TTTAAA的poly(A/T)尾巴的γ-谷氨酰转肽酶基因克隆至钝齿棒杆菌 中，通过发酵培养获得γ -谷氨酰转肽酶。4. 利用权利要求1或权利要求3所述方法获得γ -谷氨酰转肽酶用于茶氨酸的生产。
【文档编号】C12N9/10GK105969748SQ201610576989
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月20日
【发明人】饶志明, 杨套伟, 徐美娟, 张显, 和斐
【申请人】江南大学