一种从尖吻蝮蛇蛇毒提纯磷酸二酯酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种纯化蛇毒磷酸二酯酶的方法，以尖吻蝮蛇（Deinagkistrodonacutus）蛇毒冻干粉为原料，用PH6.81的磷酸盐缓冲液溶解，经过CM SepHarose FF、Superdex 200和SepHarose G25纯化，最终的得到电泳纯的蛇毒磷酸二酯酶，本发明以尖吻蝮蛇蛇毒为原料，提供了一种快速、经济、有效地从尖吻蝮蛇蛇毒中提取磷酸二酯酶的纯化方法。
【专利说明】
一种从尖吻蝮蛇蛇毒提纯磷酸二酯酶的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药提取技术领域，尤其是涉及一种从尖吻蝮蛇蛇毒中提取磷酸 二酯酶的方法。
【背景技术】
[0002] 磷酸二酯酶(PDE)广泛存在于各种蛇毒中，不同的蛇毒其TOE活力及含量有很大 差异。该酶是核酸结构分析的一种重要工具酶，具有核酸水解酶作用，是一种核酸外切酶， 它能从3'-端顺序地降解核糖或脱氧核糖多核苷酸，生成5'-单核苷酸.该酶既能水解DNA 又能水解RNA，因而在核酸的鉴定和序列测定方面获得了广泛的应用。蛇毒 PDE水解核糖核酸产生单核苷酸，单核苷酸在医药上有十分重要的作用，可制 成药物治疗白血病和血小板减少症等。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于改进已有技术的不足而提供一种快速、经济、有效地从尖吻蝮 蛇蛇毒中提取磷酸二酯酶的方法。
[0004] 本发明的目的是这样实现的，一种从尖吻蝮蛇蛇毒提纯磷酸二酯酶的方法，其特 点是以尖吻蝮蛇蛇毒冻干粉为原料提取蛇毒磷酸二酯酶，该方法包括以下步骤： a、 将冻干的尖吻蝮蛇蛇毒粉溶于pH6.81的磷酸盐缓冲液，溶液经0.22nm滤膜过滤除 菌； b、 将原料液上样于PH6.81磷酸盐平衡的CM SepHarose FF层析柱，上样完毕后，以 20ml/min的速度通PH6.81的磷酸盐缓冲液，待流穿峰流尽，紫外信号回复至基线后，改为线 性洗脱，洗脱条件为NaCl浓度从Omol/L升至0.3mol/L，6个柱体积，流速20ml/min; c、 洗脱物经浓缩，上样于Superdex 200，保留活性部分； d、 活性部分经SepHarose G25除盐，收集活性部分，即为纯化后的蛇毒磷酸二酯酶。
[0005] 本发明与原有技术相比，大大提高了产品纯度和活性，第一步采用离子色谱，首先 让大量杂质以流穿峰形式脱去，避免了以往采用变性法处理时引入新杂质并降低目标峰活 性的风险，提高了产品处理量和得率，更适合于规模化生产。
[0006] 采用本方法纯化，具有以下优点： 1、与DEAE SepHarose相比，蛇毒磷酸二酯酶更容易被CM SepHarose吸附，不需要极端 的pH环境，就可以去除大量杂蛋白。
[0007] 2、离子色谱有很大的载量，与凝胶色谱相比能处理更多的蛋白，适合作为初步纯 化，以提尚目标蛋白含量。
[0008] 3、大流速，缩短生产周期。CM SepHarose可以在很高的流速下工作，这为整个纯化 流程节省了大量的时间。
[0009] 4、蛇毒磷酸二酯酶的分子量约为100KDa，Superdex 200可以很好地分尚此分子量 的蛋白。
[ΟΟ?Ο] 5、与SepHarose G200相比，Superdex 200能承受更大的压力，可以在大流速下，取 得良好的分离效果。这大大的节省了纯化时间。
[0011 ] 6、以SepHarose G25凝胶层析柱除盐与超滤除盐相比，更加节省能耗，方便，不需 要其他仪器，适合处理中量样品，可以得到效小的样品体积。而超滤除盐更加适合处理大量 样品。
[0012] 本方法选用适于分离大分子物质的层析基质，经试验研究建立了比较确实可行的 分离纯化方法，使分离操作简单，可靠性高。因而避免了热变性和酸变性的处理过程中酶变 性和失活，无论在提高酶纯度或活性方面均获得较满意的结果，是一种较理想的分离纯化 方法。
【附图说明】
[0013] 下面结合附图和实例对本发明作进一步详细说明。
[0014] 图 1为 CM SepHarose FF层析图。
[0015] 图2 为Superdex 200层析图。
[0016] 图3 为SepHarose G25 层析图。
【具体实施方式】
[0017] -种从尖吻蝮蛇蛇毒提纯磷酸二酯酶的方法，是： 1、原料处理:取合格的尖吻蝮蛇蛇毒冻干粉5g，加入50ml pH6.81的磷酸盐缓冲液，适 当搅拌待其充分溶解后，以l〇〇〇〇rpm离心10min，取上清液过0.22nm滤膜，除去细菌及其它 不溶性杂质。
[0018] 2、CM SepHarose FF柱层析：以PH6.81的磷酸盐缓冲液对层析柱进行平衡，24ml/ min流速压柱，20ml/min流速平衡。以12ml/min的速度，将原料液上样于PH6.81磷酸盐平衡 的CM S印Harose FF层析柱(3.8*22cm)，上样完毕后，以20ml/min的速度通PH6.81的磷酸盐 缓冲液，待流穿峰流尽，紫外信号回复至基线后，改为线性洗脱，洗脱条件为NaCl浓度从 0m 〇l/L升至0.3mol/L，6个柱体积，流速20ml/min。收集活性部分，活性测定方法见下方。收 集完毕后以含1.0m 〇l/L的NaCl磷酸盐缓冲液，将柱子冲洗至基线回落至0。
[0019] 3、浓缩:将CM SepHarose FF柱纯化所得中间液移入旋转蒸发容器中，在25°C的水 浴中进行减压浓缩，浓缩至Superdex 200预装柱体积的4%，将浓缩液移入储存容器中，另 加 Superdex 200预装柱体积1%的去离子水，对蒸发容器进行清洗，与浓缩液合并。
[0020] 4、Superdex 200层析：用2%NaCl溶液对Superdex 200(5.0*85cm)层析柱以20ml/ min流速压柱，以10ml/min流速平衡，浓缩液上样于2%NaCl溶液平衡的Superdex 200层析 柱，并用2%NaCl溶液冲洗，收集活性部分。
[0021] 5、Sepharose G25脱盐:将Superdex 200洗脱下来的活性部分上样于去离子水平 衡的Sepharose G25(5.0*25cm)，收集活性部分，得到纯化后的蛇毒磷酸二酯酶原液。
[0022] 6、将步骤5得到的磷酸二酯酶产品峰过0.22um滤膜，无菌分装，冷冻干燥后即得尖 吻蝮蛇毒磷酸二酯酶成品。
[0023]活性测定方法： 1.溶液配制： A液:精确称量6.057gTris，溶解于500ml水中，以2mol/L的HC1调节PH至8.5。
[0024] B液:精确称量0.3854g醋酸氨，溶解于500ml水中。
[0025] C液:精确称量0.03402g双对硝基苯磷酸酯，溶解于lOOmlB液。
[0026] D液:精确称量6.4335g醋酸镁，溶解于100ml水中。
[0027] 2.样品测量： 按下表将溶液依次加入比色杯中：
以移液器充分混匀后，将样品和空白置于37°C水浴锅中水浴60s，测得空白管和样品管 的吸光度，重复5次。
[0028] 3.结果计算
样品ΔΑ:两次样品测量所得吸光度之差 空白ΔΑ:两次空白吸光度之差。
【主权项】
1. 一种从尖吻蝮蛇蛇毒提纯磷酸二酯酶的方法，其特征在于：以尖吻蝮蛇蛇毒冻干粉 为原料提取蛇毒磷酸二酯酶，该方法包括以下步骤： a、将冻干的尖吻蝮蛇蛇毒粉溶于pH6.81的磷酸盐缓冲液，溶液经0.22nm滤膜过滤除 菌； b、 将原料液上样于PH6.81磷酸盐平衡的CM SepHarose FF层析柱，上样完毕后，以 20ml/min的流速通PH6.81的磷酸盐缓冲液，待流穿峰流尽，紫外信号回复至基线后，改为线 性洗脱，洗脱条件为NaCl浓度从Omol/L升至0.3mol/L，6个柱体积，流速20ml/min; c、 洗脱物经浓缩，上样于Superdex 200，保留活性部分； d、 活性部分经SepHarose G25除盐，得到纯化后的尖吻蝮蛇蛇毒磷酸二酯酶原液。2. 根据权利要求1所述的一种从尖吻蝮蛇蛇毒提纯磷酸二酯酶的方法，其特征在于:CM SepHarose FF柱进行线性洗脱，洗脱条件为NaCl浓度从Omol/L升至0.3mol/L，6个柱体积。
【文档编号】C12N9/16GK105969749SQ201610180643
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年3月28日
【发明人】王东, 何万臣, 林锋
【申请人】中鑫东泰(莱阳)纳米基因生物技术有限公司