磷酸二酯酶8a的制作方法

专利名称：磷酸二酯酶8a的制作方法
技术领域：
总的来说，本发明涉及命名为PDE8A的磷酸二酯酶的一个家族以及其应用。
背景技术：
磷酸二酯酶(PDEs)水解3′，5′环核苷酸生成它们各自的5′单磷酸核苷酸。环核苷酸cAMP和cGMP分别由腺苷酰和鸟苷酰环化酶合成，并作为许多细胞信号通路中的第二信使。第二信使信号的持续时间和强度是环核苷酸合成速率和分解速率的函数。
已鉴定了PDEs的各个家族。命名系统包括表示PDE家族的第一个数。到目前为止，已知7个家族(PDE1-7)，它们通过(i)一级结构；(ii)底物优选性；(iii)对不同调节剂的反应，(iv)对特异抑制剂的敏感性；和(v)调节方式来分类[Loughney和Ferguson，关于磷酸二酯酶抑制剂，Schudt，等(编辑)，学术出版社纽约，纽约(1996)pp.1-19]。表示家族的数后面是表示不同基因的大写字母，大写字母后面的第二个数，表示特异剪接变异体或使用独特转录起始位点的特异转录子。
到目前已鉴定的所有哺乳PDEs的氨基酸序列。包括位于蛋白羧基端一半的大约270个氨基酸的高度保守区域[Charbonneau等，美国国家科学院院刊(美国)839308-9312(1986)]。保守结构域包括cAMP和/或cGMP水解的催化位点和两个推定的锌结合位点以及家族特异的决定簇[Beavo，生理评论75725-748(1995)；Francis等，生物化学杂志26922477-22480(1994)]。各种PDEs的氨基端区域是高度可变的，包括其它家族特异决定簇例如(i)钙调蛋白结合位点(PDE1)；(ii)非催化环GMP结合位点(PDE2、PDE5、PDE6)；(iii)膜靶向位点(PDE4)；(iv)疏水的膜相关位点(PDE3)；和(v)对钙调蛋白-依赖的激酶II(PDE1)、cAMP-依赖的激酶(PDE1、PDE3、PDE4)或者cGMP依赖的激酶(PDE5)的磷酸化位点[Beavo，生理评论75725-748(1995)；Manganiello等Arch.Biochem.Acta 3221-13(1995)；Conti等，生理评论75723-748(1995)]。
钙-钙调蛋白可以激活PDE1家族的许多成员。已鉴定三个基因PDE1A和PPE1B优选水解cGMP而PDE1C已表明对cAMP和cGMP都有高度亲和力。PDE2家庭特征是可以特异地由cGMP活化[Loughney和Ferguson，同上]。已经鉴定只有一个基因，PDE2A，其酶产物可以由红-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)特异抑制。PDE3家族中的酶类被cGMP特异性抑制。已知两个基因，PDE3A和PDE3B，对cAMP和cGMP都有高度亲和力，尽管对cGMP水解的Vmax足够低，以至cGMP作为cAMP水解的竞争抑制剂。甲氰吡酮和依诺西酮 特异抑制PDE3酶[Loughney和Ferguson，同上]。PDE4家族影响cAMP水解，并包括4个基因，PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D，每一个都有多个剪接变异体。抗-抑郁的药环戊氧基甲氧苯基吡咯烷酮特异抑制这个家族的成员。PDE5家族的成员在非催化位点结合cGMP，并优先水解cGMP。只有一个基因，PDE5A得到鉴定。光感受器PDE6酶特异水解cGMP[Loughney和Ferguson，同上]。除了伴有三个较小蛋白以形成锥部的PDE的PDE6C，基因包括PDE6A和PDE6B(其蛋白产物二聚体化并结合两拷贝的较小γ抑制亚单位以形成杆部的PDE。PDE7家族影响cAMP水解，但与PDE4家族相比较，不受环戊氧基甲氧苯基吡咯烷酮抑制[Loughney和Ferguson，同上]。只有一个基因，PDE7A，已得到鉴定。
已知cAMP和cGMP在细胞内第二信使信号中的重要性，因而本领域存在持续的需要以鉴定另外的PDE种类。至今PDEs未知家族以及其基因和剪接变异体的鉴定将提供另外的药理学途径，以治疗环核苷酸途径异常的病态以及在某些细胞类型中想要调节细胞内cAMP和/或cGMP水平的病态。
发明简述简而言之，本发明提供命名为PDE8的新PDE家族的多肽和其多核苷酸。本发明包括自然发生的和非自然发生的PDE8多核苷酸和其多肽产物。自然发生的PDE8产物包括PDE8家族内的不同基因和多肽的种类(即PDE8A)；这些种类包括在相同动物细胞内表达的以及在其它动物细胞内表达的对应种的同系物。在每一个PDE8种类中，发明进一步提供由相同多核苷酸编码的剪接变异体，但它们产生于不同的mRNA转录子(即PDE8A1和PDE8A2)。非自然发生的PDE8产物包括自然发生产物的变异体如类似物(即其中一个或更多个的氨基酸得到添加、置换或删除)以及包括共价修饰(即融合蛋白、糖基化变异体、Met-1PDE8s、Met-2Lys-1-PDE8s、Gly-1PDE8s等等)的那些PDE8产物。PDE8家族不同于以前已知的PDE家族，对cAMP和cFMP的水解都表现高亲和，但对其它家族特异的酶抑制剂有相对低的敏感性。在优选的实施方案中，本发明提供了包含如SEQ ID NO1中所陈述序列的多核苷酸。本发明也包括编码如SEQ ID NO2中所陈述氨基酸序列的多核苷酸。本发明目前优选的多肽包括如SEQ ID NO2中所陈述的氨基酸序列。本发明提供两个剪接变异体cDNA，它产生两个命名为PDE8A1和PDE8A2的多肽。PDE8A1和PDE8A2多肽以及编码多肽的多核苷酸，在此处作为本发明所包括的PDE8酶家族的代表讨论。
本发明提供编码人PDE8s的新纯化和分离的多核苷酸(如DNA序列和包括其剪接变异体的RNA转录子、正义和互补反义链)。本发明的DNA序列包括基因组和cDNA序列以及全部或部分化学合成的DNA序列。如此处所用的“合成的”，在本领域理解为是指与酶学方法相反的用于合成多核苷酸的纯化学方法。“全部”合成的DNA序列因而完全由化学方法合成，而“部分”合成的DNAs包括那些其中只有部分DNA由化学方法合成。编码人PDE8多肽的优选DNA序列如SEQ IDNO1中所陈述。也优选的是编码SEQ ID NO2的PDE8多肽的多核苷酸以及SEQ ID NOS6和4中分别陈述的PDE8A1和PDE8A2的剪接变异体多肽。编码PDE8A1和PDE8A2的优选多核苷酸，分另在SEQ ID NOs5和3中陈述。本发明进一步包括种，优选人PDE8 DNA的哺乳类同系物。
本发明也包括在适度严格条件下与SEQ ID NOs1、3和5中多核苷酸的非编码链或互补杂交的编码PDE8种的DNA序列。本发明考虑能杂交但遗传密码多余的编码PDE8A多肽的DNA序列。典型的适度杂交条件如下在65℃、3×SSC、0.1％肌氨酰和20mM磷酸钠pH6.8中杂交，并在65℃带有0.1％SDS的2×SSC中洗涤。在本领域中应该理解通过如Ausebel等(主编)，分子生物学方法，John Wiley &Sons(1994)；PP.6.0.3至6.4.1 0所描述的改变温度和缓中液或盐浓度可以取得同严格的条件。
根据探针鸟嘌呤/胞嘧啶(GC)碱基对的长度和百分率可以经验确定或精确计算修约杂交条件中。如Sambrook等(主编)，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社冷泉港，纽约(1989)，pp.9.47至9.51所描述的可以计算杂交条件。
也提供自动复制重组表达构建物如带有PDE8序列的质粒和病毒DNA载体。也提供表达构建物，其中PDE8-编码多核苷酸与内源或外源表达控制DNA序列和转录终止子可操作性连接。
根据本发明的另一方面，也提供宿主细胞，包括用本发明的DNA序列以允许本发明PDE8多肽，稳定或瞬时转化表达的方式的原核和真核细胞。本发明的宿主细胞是免疫原有价值的来源用于发展特异地与PDE8免疫反应的抗体。本发明的宿主细胞在大量合成PDE8多肽的方法中也明显是有用的，其中细胞生长在合适的培养基中，所要的多肽产物从细胞或从细胞生长的培养基中通过例如免疫亲和纯化来分离。
PDE8 DNA序列的知识允许修饰细胞从允许或增加内源PDE8的表达。通过用全部或部分异源启动子全部或部分置换自然发生的PDE8启动子修饰细胞(如通过同源重组)以提供增高的PDE8表达，以便细胞在高水平表达PDE8。异源启动子以此方式插入以便它与PDE8编码序列可操作连接。见例如PCT国际申请号WO 94/12650、PCT国际申请号WO 92/20808和PCT国际申请号91/0995 5。本发明也考虑除了异源启动子DNA之外，可扩增的标记DNA(如编码磷酸甲氨酰合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶和氨甲酰天冬氨酸脱水酶的ada、dhfr和多功能CAD基因)和/或内含子DNA也可以与异源启动子DNA一起插入。如果与PDE8编码序列连接在一起，通过标准选择方法的标记DNA的扩增会在细胞中产生PDE8编码序列的共扩增。
本发明提供的DNA序列信息也使得通过如同源重组或“敲除”策略[Capecchi，科学2441288-1292(1989)]发展成为可能，该策略是得到不能表达功能PDE8或表达PDE8变异体的动物。这样的动物作为研究PDE8体内活性和PDE8调节剂的模型是有用的。
本发明也提供纯化的和分离的哺乳类PDE8多肽。目前优选的PDE8A多肽陈述于SEQ ID NOs4和6中。最优选的是含有陈述于SEQ ID NO2中的氨基酸序列的PDE8多肽。本发明的PDE8多肽可以从天然细胞来源中分离或化学合成，但优选通过包括本发明宿主细胞的重组方法来合成。哺乳类宿主细胞的使用期望提供这些翻译后修饰(如糖基化、截短、脂质化和磷酸化)，需要这些修饰以便对本发明的重组表达产物赋于最佳生物活性。本发明的PDE8产物可以是全长多肽、生物活性片段或保留特异的PDE8生物活性的其变异体。变异体可以包括PDE8多肽类似物，其中删除或置换一个或多个特异的(即自然编码)的氨基酸，或者其中加入一个或多个非特异的氨基酸(1)不丢失对PDE8特异的一个或多个生物活性或免疫特征；或者(2)PDE特定生物活性的特异残失。
本发明的变异体产物包括成熟的PDE8A产物，即其中去除前导或信号序列的PDE8产物，具有附加的氨基端残基。考虑在-1位具有附加甲硫氨酸残基的PDE8产物(Met-1-PDE8)，以及在-2和-1位具有附加的甲硫氨酸和赖氨酸的PDE8产物(Met-2-Lys-1-PDE8)。这些类型的变异体，对在细菌细胞类型中重组蛋白合成尤其有用。
本发明也包括具有附加氨基酸残基的PDE8变异体，这些氨基酸残基产生于特异表达系统。例如使用商业可获得载体表达所需要多肽如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合产物的所需多肽，该多肽在-1位具有附加甘氨酸残基，结果能从所需多肽上切除GST成分。也考虑在其它载体系统中表达所产生的变异体。
本发明进一步包括修饰以包括一个或多个水溶多聚体附着物的PDE8产物。尤其优选的是和具有聚乙二醇(PEG)亚单位共价修饰的PDE8产物。水溶多聚体可以在特定位置如PDE8产物的氨基末端键合，或随机附着在多肽的一个或多个侧链上。
本发明也包括抗体(如单克隆和多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体等等)和对PDE8产物或其片段特异的其它结合蛋白。使用分离或重组的PDE8产物、PDE8变异体或表达这些产物的细胞发展特异结合蛋白。使用已知的免疫方法，结合蛋白对纯化PDE8产物和在流体和组织样品中检测或定量PDE8产物是有用的。结合蛋白在调节(即阻断、抑制或激活)PDE8的生物活性，尤其是参与信号转导的那些活性是明显有用的。也考虑对抗-PDE8抗体特异的抗-独特型抗体。
通过本发明DNA和氨基酸序列的披露所贡献的信息的科学价值是明显的。鉴于一系列的实施例，PED8A cDNA序列的了解使得通过使用Southern杂交或聚合酶链反应(PCR)鉴定编码PDE8以及PDE8表达控制调节序列如启动子、操纵子、增强子、抑制子等等的基因组DNA序列成为可能。在适度至高度严格的条件下用本发明的DNA序列进行的DNA/DNA杂交过程也预期允许分离编码PDE8A等位变异体的DNAs，本领域已知等位变异体包括对PDE8A特异的一个或多个生物和/或免疫特性的结构相关蛋白。相似地，编码与PDE8A同源蛋白的非人类种基因，也可以通过Southern和/或PCR分析得到鉴定。因为一个可选择的、互补研究对鉴定其它人PDE8产物以及享有一个或多个PDE8A生物特性的非人类蛋白和编码蛋白的DNA是有用。
本发明的多核苷酸，在用以检测细胞表达PDE8能力的杂交实验中也是有用的。本发明的多核苷酸也是用于鉴定PDE8位点中遗传改变的诊断方法的基础，而PDE8位点中遗传改变是造成疾病状态的根本原因。
本发明也可以得到的是识别并与编码PDE8的多核苷酸杂交的反义多核苷酸。提供全长和片段反义多核苷酸。反义多核苷酸通过表达PDE8mRNA的那些细胞对调节PDE8的表达尤其相关。
本发明提供的DNA和氨基酸序列信息也使得系统分析PDE8s的结构和功能成为可能。 PDE8的DNA和氨基酸序列信息也允许鉴定与PDE8A相互作用的分子。通过将推定的调节剂与PDE8温育并确定推定调节剂对PDE8磷酸二酯酶活性的影响可以鉴定调节(即增加、降低或阻断)PDE8活性的药剂。通过将它对PDE8的活性与它对其它PDE酶活性相比较，可以评估调节PDE8活性的化合物的选择性。本发明考虑以细胞为基础的方法，如双杂交实验和断裂杂交实验以及体外方法，包括固定多肽或它的结合伙伴的实验和溶液实验。
选择性调节剂可以包括如抗体和其它与PDE8或PDE8核酸特异结合的蛋白或肽、与PDE8或PDE8核酸特异结合的寡核苷酸、以及与PDE8或编码PDE8的核酸特异反应的其它非肽化合物(如分离的或合成的有机分子)。本发明也考虑影响野生型PDE8酶活性或细胞定位的PDE8突变形式。目前用于发展选择性调节剂的优选目标包括(1)和其它蛋白联系和/或细胞内定位PDE8的PDE8区域，(2)结合底物的PDE8区域，(3)PDE8的变构环核苷酸结合位点，(4)PDE8的磷酸化位点和(5)参与PDE8亚单位多聚化的PDE8区域。PDE8活性的调节剂对治疗已知PDE活性参与的广泛的疾病和生理状态是治疗上有用的。
本发明进一步考虑PDE8A酶活性的小分子调节剂。至少有三种不同类型的文库用以鉴定小分子调节剂。这包括(1)化学制剂文库、(2)天然产物文库和(3)包含随机肽、寡核苷酸或有机分子的组合文库。
化学制剂文库由已知化合物的结构类似物或通过天然产物筛选鉴定为“hits”或“Leads”的化合物。天然产物文库是微生物、动物、植物或海洋生物的集合，它们通过(1)来自土壤、植物或海洋微生物的液体培养基发酵和提取或(2)植物或海洋生物的提取制造混合物用于筛选。组合文库包括大量的肽、寡核苷酸或有机化合物作为混合物。通过传统自动合成方法、PCR、克隆或者专有的合成方法它们相对容易制备。尤其感兴趣的是肽和寡核苷酸组合文库。感兴趣的其它文库也包括肽、蛋白、肽模拟物、多平行、合成集合、重组的和多肽文库。对从那里制的组合化学和文库的评论，见Mysers，生物技术的现行评价8701-707(1997)。
通过使用在此描述的各种文库调节剂的鉴定允许修饰候选的“hit”(或“Lead”)以最优选“hit”调节活性的能力。
本发明进一步提供方法以鉴定本发明PDE8A多肽的特异结合伙伴化合物，包括步骤a)在允许化合物和PDE8A多肽结合的条件下将PDE8A多肽与化合物接触；b)检测化合物与PDE8A多肽的结合；和c)鉴定化合物作为PDE8A多肽的特异结合伙伴。本发明的方法所鉴定的结合伙伴通过酶的抑制、活化或加强，优选调节PDE8A酶活性。
本发明也提供方法以鉴定本发明PDE8A多核苷酸的特异结合伙伴化合物，该方法包括步骤a)在允许化合物和PDE8A多核苷酸结合的条件下，将PDE8A多核苷酸与化合物接触；(2)检测化合物与PDE8A多核苷酸的结合；和c)鉴定化合物作为PDE8A多核苷酸的特异结合伙伴。PDE8A多核苷酸的结合伙伴通过抑制表达或者加强表达。优选调节PDE8A多核苷酸所编码的PDE8A多肽的表达。
本发明也提供通过本发明的方法所鉴定的化合物以及包含所鉴定化合物和药学可接受载体的组合物。
发明详述通过涉及编码PDE8多肽的多核苷酸的分离以及编码多肽的表达和特征的下列实施例说明本发明。为了鉴定对分离本发明的DNAs潜在有用的探针，实施例1描述寻找表达序列标签(EST)数据库的方法。实施例2涉及PDE8A-编码多核苷酸的鉴定。实施例3说明分离的多核苷酸的序列分析。实施例4描述PDE8A多核苷酸编码的多肽的分析。实施例5说明重组的PDE8A多肽的表达。实施例6涉及PDE8A表达的Northern分析。实施例7说明编码PDE8A的基因的染色体定位图。实施例8描述证明PDE8A1和PDE8A2是剪接变异体。实施例9说明重组PDE8A的表达和特征。实施例10详细说明抗-PDE8A单克隆抗体的合成。实施例11说明通过原位杂交分析PDE8A表达的。
实施例1与人PDE相关的EST的鉴定为了鉴定对新磷酸二酯酶(PDE)基因的鉴定潜在有用的cDNA片段，使用已知的人3′，5′环核苷酸磷酸二酯酶的序列，进行国家生物技术信息中心(NCBI)表达序列标签(EST)数据库的搜寻。这个数据库包含代表从许多组织来源收集的cDNA一端或两端的DNA序列。在cDNA的一端或两端进行单一序列测定，DNA序列的质量变化巨大。此时进行PDE搜寻，EST序列数据库含有来自许多生物体的超过600000 cDNA序列。
新的PDE序列的搜寻包括3个步骤。首先通过NCBI可得到的BLASTN程序用于在EST序列数据库中鉴定与编码已知人PDEs的cDNA同源和DNA序列。程序将核苷酸搜寻序列与核苷酸序列数据库比较。提交15个已知人PDEs的cDNA序列，并进行15次BLASTN搜寻；搜寻PDEs序列包括PDE1A3[Loughney，等，生物化学杂志，271796-806(1996)]、PDE1B1[Yu等，细胞信号，待发表(1997)]、PDE1C2[Loughney等，生物化学杂志.271796-806(1996)]、PDE2A3[Rosman等，基因19189-95(1997)]、PDE3A[Meacci等，美国国家科学院院刊(美国)893721-3725(1992)]、PDE3B[Miki等，基因组36476-485(1996)]、PDE4A5[Bolger等，分子细胞生物学136558-6571(1993)]、PDE4B2[Bolger等，分子细胞生物学136558-6571(1993)]、PDE4C[Bolger等，分子细胞生物学136558-6571(1993)]、PDE4D1和PDE4D3[Bolger等，分子细胞生物学136558-6571(1993)]、PDE5A、PDE6A[Pittler等，基因组6272-283(1990)]、PDE6B[Collins等，基因组13698-704(1992)]、PDE6C[Piriev等，基因组28429-435(1995)]和PDE7A1[Michaeli等，生物化学杂志1712925-12932(1993)]。检查BLASTN结果，判断为与15个已知PDE cDNAs的每一个相对应的EST序列得到鉴定并收集进表中。用作搜寻的PDE6和PDE6B序列由于在cDNAs的3′未翻译区域存在重复元件而在3′端截短(去除部分3′未翻译区域)。
其次，NCBI TBLASTN程序用于检查15个已知人PDEs(如上述)的蛋白序列和由每一个EST DNA序列编码的6个不同可能蛋白之间的同源性。在此搜寻中，在6个框架中翻译EST序列，产生的氨基酸序列与搜寻PDE氨基酸序列相比较。检查在氨基酸水平鉴定为同源的序列，去除在上述BLASTN搜寻过程中绝对确定与已知PDE对应的任何EST序列。
搜寻的第三步包括分析那些并不是已知的PDEs的序列。这些氨基酸序列与已知的PDE同源但不是BLASTN搜寻中鉴定为15个已知PDE基因的其中一个。
BLAST搜寻从人肺胎儿肺cDNA文库中鉴定一个EST序列(命名WO 4835)，为编码具有与PDE2A、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE5A、杆αPDE6A、杆βPDE6B、椎αPDE6C和PDE7A的催化区域同源性的氨基酸序列。WO 4835的数据库序列陈述于SEQ ID NO7。使用PDE4D序列举例说明来自如下面讨论的数据库分析的结果。
WO4835 cDNA从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)获得，它保藏并使得由I.M.A.G.E.(Lawrence Livermore国家实验室，Livermore，CA)所鉴定和测定的EST保藏物可公开获得。一旦收到对WO4835 DNA进行测序以肯定它的身份并确定与SEQ IDNO7相一致。
由EST序列WO4835的-1阅读框架编码的氨基酸序列可以被除了PDE1A、1B和1C之外的所有PDE搜寻cDNA序列识别。使用PDE4D3的TBLASTN的结果作一个例子，检测相似的两个区域。第一个区域显示15/37精确匹配或40％相同(19/37相似氨基酸)并包括在所有的搜寻序列中发现的HD(X)2HXG(X)13A(SEQ ID NO8)基序[Charboneau，分子药理细胞调节2267-298(1990)]。第二个区域显示9/20精确匹配或45％相同，并包括在大部分搜寻序列中发现的YHNXXHA基序。WO 4835序列BLASTN分析提示它是独特的，因为它不与Genbank数据库中的任何其它人DNA序列相同。WO4835的EST数据库登记鉴定此序列与PIRA4879、牛cGMP结合的、水解cGMP的PDE5A1序列相似。WO4835框架-1的蛋白序列与牛PDE5A1序列比较揭示58/153匹配，38％的完全相同。在此区域内是更大同源性的小区域；一个区域表现12/14相同的氨基酸。考虑到WO4835序列的独特性质，与牛PDE5A1的相对低同源性以及存在在大部分其它已知人PDE氨基酸序列中发现的氨基酸基序，WO4835代表一种新的人PDE cDNA。
实施例2推定PDE cDNA的分离用限制酶EcoRT和Hind III将WO4835 cDNA插入子从pTTT3D载体上消化成为两个片段，这两个片段用两个序列低溶点琼脂糖凝胶纯化。利用本领域常规执行的方法，两个片段用作探针筛选来源于人心脏(Stratagene，La Jolla，CA)和人胎儿脑(Stratagene)的cDNA文库。筛选来自每一个文库的大约5×15噬菌体。杂交于65℃在含有3×SSC、0.1％肌氨酰、20mM磷酸钠、pH6.8、10×Denhardts溶液和50μg/ml鲑鱼精子DNA的缓冲液中过夜进行。放射自显影之前滤膜于65℃在含2×SSC和0.1％SDS的缓冲液中洗涤。
来自胎儿脑cDNA文库的9个克隆和来自心脏cDNA文库的2个克隆与WO4835探针杂交。部分测序和定位图使得从胎儿脑文库中选择一个克隆命名为FB66a以进一步分析特征。
使用WO4835 5′部分的1.3kb EcoRI/Hind III片段在第一次筛选所用的条件下第二次筛选来自胎儿脑cDNA文库的大约7.5×105个噬菌体，产生19个另外的cDNA克隆。这些cDNAs中的6个也与包括WO4835 5′端的256个核苷酸区域的WO 4835的HindIII/kpn I片段杂交。5个这些克隆的部分测序和定位图使得选择第2个克隆命名为FB85C-2做进一步分析。
买施例3FB66a和FB85C-2的DNA序列分析根据生产者建议的步骤使用下面在SEQ ID NOS9至31中陈述的DNA寡核苷酸引物和Perkin Elmer应用生物系统部门的373ADNA测序仪对两条链确定FB66a的DNA序列。根据PCR产物的大小计算用作模板的PCR产物的量，并用带有Apli Taq DNA聚合酶FS(Perkin Elmer，Foster City，CA)的ABI PRISM Dye TerminatorCycle Sequencing Ready反应试剂盒和不对称PCR测序。反应产物在AGCT旋转柱(Advanced Genetic Technologies Corp.，Gaithersburg，MD)并干燥。上样缓冲液加至每一纯化的样品中，混合物于90℃加热2分钟。溶液转移到冰上直至加到4％聚丙烯酰胺凝胶上。一旦数据收集程序启动则自动收集数据，并由序列分析程序自动分析和阅读。手工进行所有的编辑，在确定一致的序列的地方得到的序列进行对比M13Rev.1GGAAACAGCTATGACCATGSEQ ID NO9W48A2 ACTCTCCAAGGAAATACAGSEQ ID NO10W48A9 CTGTCTCTGCACTAACAC SEQ ID NO11W48A4 TTGGCAAGGCCTCTGCAT SEQ ID NO12W48S1 CCTCTATGAACTGAGCAG SEQ ID NO13W48A1 GAAGGCACTGCCACTGAT SEQ ID NO14W48S6 TCGAGCTGTATCGGCACT SEQ ID NO15W48A5 AGCGTGTGATTGTTCTGAASEQ ID NO16W48S7 TGCTGGCCAAGTAGCAAG SEQ ID NO17W48AAAGGTCACAGGCAGTCAT SEQ ID NO18W48S2 GAAGAGTGGCAAGGTCTC SEQ ID NO19W48S3 TCATGACCTGGACCACCAGSEQ ID NO20W48A8 CCTTCTTGAAGAGGTTTGCSEQ ID NO21W48S4 ATGACTGCCTGTGACCTT SEQ ID NO22W48S5 CTGCTATACAACCCTTACCSEQ ID NO23W48S8 GCTAATATTGCTGAGGCC SEQ ID NO24W48A7 TAAGTGAGAGGTGACTGC SEQ ID NO25W48S9 CCTAAAGGGCTGAGATCA SEQ ID NO26W48S10 CGCAGTCACCTCTCACTT SEQ ID NO27M13 TGTAAAACGACGGCCAGT SEQ ID NO28W48A11 ACAAAACGCCTATGGTGG SEQ ID NO29W48A10 TTGATCTCAGCCCTTTAGCSEQ ID NO30W48S11 TCATGTGGCAGGAAACTG SEQ ID NO31
陈述于SEQ ID NO3中的FB66a cDNA长度上是4389个核苷酸，从核苷酸3至核苷酸2411编码具有大约90 775 Da预计分子量的803个氨基酸的蛋白质。FB66a推断的氨基酸序列陈述于SEQ ID NO4中。第一个甲硫氨酸在核苷酸45编码；缺少一个上游框架内终止密码使得此残基是内部甲硫氨酸还是开放阅读框架的起始不太清楚。
使用引物M13Rev.1、W48A2、W48A9、W48A4、W48S1、W48A1、W48S6、W48A5、W48A6、W48S2、W48S3、W48S4、W48S5、W48S7、W48A8和M13相似地确定FB85c-2(SEQ IDNO5)的DNA序列。FB85c-2好象包括两个不同的DNA插入子，只有一个与WO4835同源。与WO4835同源的区域大约长2.8kb。插入子5′端精确序列并不确定，因而几百个是5′-未翻译区域的序列碱基不包括在陈述于SEQ ID NO5的2573个核苷酸序列中。核苷酸67至核苷酸2406编码具有预计分子量88353Da的具有779个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO6)。框架内上游终止密码子使得有可能核苷酸67位所编码的甲硫氨酸是起始甲硫氨酸。
FB66a和FB85c-2所编码的蛋白有不同的氨基端序列，这可能由于可选择的剪接。从FB66a中核苷酸112及FB85c-2中核苷酸104的5′DNA序列彼此不同。这样FB85c-2在氨基端有13个在FB66a蛋白中未发现的氨基酸。如果起始甲硫氨酸推测由核苷酸35编码，FB66a蛋白包括23个独特的氨基端残基；如果FB66a克隆中开放阅读框架不完整，蛋白则包括超过37个独特的氨基端残基。
FB66a序列的BLASTN分析，其中搜寻核苷酸序列与核苷酸序列数据库相比较，揭示与Genbank、NCBI、STS、NCBIHTGS、或NCBIGSS数据库中的序列不相同。然而两个相同序列在NCBI EST数据库中得到鉴定。
一个序列是用于鉴定cDNA克隆的WO4835 EST。第二个，起源于结肠癌细胞系KM12C(HCC)的AA307865(SEQ ID NO32)，显示与FB66a和FB85c-2克隆的3′未翻译区域有序列相同性。在鉴定AA307865的搜寻中，另外的EST DNAs得到鉴定推测它编码FB66a和FB85c-2所编码人蛋白的推定小鼠(EST AA386789，SEQ IDNO38)和大鼠(EST H32734，SEQ ID NO33)同系物。小鼠序列与人的序列是86％相同，而大鼠是81％。
实施例4分析FB85c-2和FB66a蛋白由克隆FB85c-2和FB66a编码的PDEs分别命名为PDE8A1和PDE8A2。在上面所讨论的分岐点以外具有完全氨基酸序列相同性的两个PDE8A蛋白与人PDE2A、PDE5A、PDE6A、PDE6B和PDE6C最相似。表1和表2表明PDE8A和PDE2A、PDE5A及PDE6A之间氨基酸相同的百分率。
PDE8A1和PDE8A2在催化区域(PDE8A1中氨基酸492至748)与其它PDEs以及PDE2A、PDE5A、PDE6A、PDE6B和PDE6C的氨基端区域中保守的推定cGMP结合结构域享有同源性。PDE8A的潜在cGMP结合结构域从PDE8A1多肽中的氨基酸75延伸至氨基酸445。在PDE2A、PDE5A、PDE6A、PDE6B和PDE6C的cGMP结合结构域中，有两个命名为“a”和“b”的内部重复，每个重复含有一系列保守氨基酸[McAllister-Lucas等，生物化学杂志26822863-22873(1993)]。在PDE8A的对应“b”重复区域，发现所有的保守氨基酸；在对应的“a”重复区域，只检测到一些保守的残基。表明对牛PDE5A的cGMP结合是必需的一个天冬氨酸残基[McAllister-Lucas等，生物化学杂志.2701-9(1995)]不存在于PDE8A的“a”重复区域。因而不能肯定PDE8A的此区域是否有结合cGMP的功能。
表1在整个蛋白中PDE8A的相同性
表2在催化结构域中PDE8A的相同性
买施例5重组PDE8A的表达产生PDE8A的表达构建物，它包括从PDE8A1和PDE8A2分岐点3′的DNA序列通过终止密码子。表达构建物包括编码8个氨基酸表位标签的DNA。包含陈述于SEQ ID NO34肽序列的所谓“FLAG标签”，加到氨基末端以便蛋白通过Western印迹技术用抗-FLAGMZ抗体(Eastman Kodak，Rochesterm，NY)得到鉴定，此抗体特异识别SEQ ID NO34的肽。
SEQ ID NO34 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在蛋白的氨基末端也加上编码起始甲硫氨酸的序列。
作为构建表达质粒的第一步，用FB66a DNA作为模板，用陈述于SEQ ID NO35(下面)和W48A2(SEQ ID NO10， p14)的引物，在含有2μl每一引物[储存液100μg/ml]、2μl 10×PCR缓冲液II(Perkin Elmer)/2μl 10X每一核苷酸储存液(储存液2mM)、1.2μl MgCl2(储存液25mM)的反应混合物中进行PCR。0.09μl 5Units/μl taq聚合酶(Perkin Elmer)、FB66a DNA和水加入反应混合物中至20μl进行PCR反应。在5′引物中(SEQ ID NO35)，NcoI粒点加重，FLAG标签编码区域划线。
SEQ ID NO35CAGTCAGCTAGCCGCCATGGACTACAAGGAC-GACGATGACCAAGTTGACTGATGAAAAGGTG在Perkin Elmer DNA热循环仪中在下列条件下进行PCR95℃4分钟，接着94℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟，30个循环。
得到的PCR产物用NcoI和kpnI消化，凝胶纯化，并亚克隆进入已用相同酶消化的Bluescript SKII载体中。Bluescript载体已经过修饰以包括从YEpC-PADH2d载体上去除的醇脱氢酶2(ADH2)启动子片段(Price等，酶学方法185308-315(1990))。得到的质粒命名为W48pcr1。
含有开放阅读框架3′部分的kpnI/SstI片段从FB66a cDNA分离，并插入已用kpnI和EcoRV消化的W48pcr1中。得到的质粒命名为W485.1。
含有ADH2启动子和PDE8A基因5′部分的SacI/KpnI片段从W49pcr1中分离。含有PDE8A 3′区域的kpnI/SalI片段从W485.1分离。两个片段连接进已用SacI和SalI消化的酵母表达载体YEpC-PADH2d。得到的质粒命名为W48-2ADH2，并按照布达佩斯条约于1997年10月2日保藏于美国典型培养物保藏中心(A.T.C.C.)，12301Parklawn Drive，Rockville，MD20852。带有质粒W48-2ADH2的细菌菌种授与保藏号ATCC98552。确定PCR产生的DNA序列和PDE8/载体结合处的DNA序列以确保正确的质粒构建物。一旦确认了序列，质粒转化进缺少内源PDE活性的酵母菌种BJ2-54(ura3-52；trp1；leu2；cir°；gal2；pep4-3；prb1-1122；prc1-402；ΔPDE1URA3；HIS3；ΔPDE2TRP1)。
宿主细胞在包括2％葡萄糖的SC-leu选择培养基中过夜生长，稀释至1-2×105细胞/ml，接下来在相同的培养基中生长至107细胞/ml的浓度。即使在非-诱导条件下表达质粒的出现好象将细胞生长的双倍时间增加2至3倍。细胞经离心收集，用包括3％甘油的YEP培养基洗涤，以107细胞/ml的密度重新悬浮于YEP/3％甘油中，收获前生长24小时。细胞冷冻直至使用。
冷冻的细胞块(0.06ml)融解，悬浮于含有100mM MOPS、pH8.0、200mM NaCl、2μM ZnSO4、2mM二硫苏糖醇、和10μg/ml每一种蛋白酶抑制剂抑胃酶肽、亮抑酰肽和抑蛋白酶酞的0.2ml裂解缓中液中。大约0.2ml 0.5mm玻璃珠加到细胞中，这些细胞然后用4个30秒剧烈振荡循环裂解。吸出裂解物，玻璃珠用0.3ml裂解缓中液洗涤2次。裂解物和洗涤液合并产生酵母提取液。在一些实验中，裂解物通过在105000×g离心30分钟而分成几部分。
按如下对含有重组蛋白的酵母提取液进行Western分析。蛋白首先在SDS-PAGE上分离，并使用标准方法转移到Immobilon-P(Millipore)上。蛋白印迹于室温使用存在于20mM Tris-HCl、pH7.4、150mM NaCl、0.05％Tween-20中的5％无脂干牛奶(TBST缓中液加牛奶)封闭1小时。印迹与存在于TBST缓冲液加牛奶中的浓度为1μg/ml的抗-FLAG M2抗体(上面讨论的)温育1小时，之后点迹用TBST缓中液洗涤4次。印迹然后与偶联了辣根过氧化物酶(HRP)的印迹级亲和纯化的山羊抗小鼠IgG抗体温育1小时。山羊IgG事先在加牛奶TBST缓冲液中1∶10000稀释。印迹用TBST洗涤4次，根据生产商建议的步骤，散射自显影之前用加强化学发光的Renaissance系统(New England Nuclear Life SeieneesProducts)处理。通过抗体检测的大部分蛋白是重组蛋白预期的大小。
如以前所描述的[Loughney等，生物化学杂志271796-806(1996)]方法，通过检测从32P-CAMP或32P-cGMP中释放的32P-磷酸测定PDE活性。酵母提取物在也含有0.5mg/ml牛血清白蛋白的0.5X裂解缓冲液中稀释。20μl酵母提取物或稀释的酵母提取物，在包括另外的50mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl2、1μM ZnSO4和0.1mg/ml牛血清白蛋白的100μl反应体积中测定。蛋白浓度通过Bradford的方法测定。
观察到PDE8A水解cAMP和cGMP。在未分部的裂解物中，对cAMP的特异活性是3.9nmol/min/mg，对cGMP的特异活性是7.6nmol/min/mg。分部揭示20-40％的总活性与高速上清部分相关。用cAMP作为底物的活性动力学分析表明以1∶1活性比率存在酶的高和低km形式。估计的km值是0.2μM和350μM。高速沉淀块的分析表明相同种也存在但是以1∶4的高km低km活性。用cGMP作为底物的动力学分析表明存在酶的低和高活性的形式。在这些分析中，km值估计是3μM和300μM。
使用一套同功酶选择性PDE抑制剂和非选择性抑制剂异甲基丁基黄嘌呤(IBMX)确定PDE8A活性抑制的IC50值。因为此测定在60nM的cAMP浓度进行，IC50值只反映低km形式的抑制。结果陈述于表3中，值以微摩尔单位显示。
表3使用同功酶特异的PDE抑制剂的PDE8抑制
每一种选择抑制剂对PDE8的IC50值比对它们的靶同功酶高至少30倍，这说明PDE8的抑制情况不同于PDEs1-5。cAMP和cGMP的水解将PDE8A的酶活性和PDE6及PDE7A的活性清楚区别开。非选择性抑制剂IBMX对PDE8的IC50值在对已知人PDEs所观察的范围内，表明PDE8的催化点与其它人和哺乳类PDEs的相似，并不同于对IBMX不敏感的更低真核形式。
买施例6PDE8A表达的Northern分析使用人多组织点迹(Clontech，Palo Alto，CA)进行PDE8A表达的Northern分析。327个碱基的探针从SEQ ID NO3中的核酸1767延伸至2293。核糖探针的制备和杂交条件如以前所描述的[Loughney等，同上]。
结果表明在所有检查的组织中有9.5kb的mRNA但带强度有变化。信号在心脏、脑和肾中最强；信号在肝、胎盘、胰腺和骨骼肌中较弱。信号在肺中最弱。
实施例7人PDE8A的染色体定位图含有人PDE8A基因的酵母人工染色体(YACs)从购买自遗传研究公司的一组人YACs中分离并按如下通过PCR筛选。
用两个嵌套引物对筛选YAC的上库。在第一次筛选反应中，正义引物W48S8(SEQ ID NO36)与反义引物W48A10(SEQ IDNO37)配对。用10mM Tris-HCl、pH8.3、50mM KCl、2mMMgSO4、0.2mM每一种dNTP、10μg/ml每一种引物、0.5 units Taq聚合酶(Perkin-Elmer)以及1.5μl YAC库DNA作为模板进行PCR。反应进行30个循环，每一循环包括94℃1分钟、60℃2分钟和72℃4分钟。首轮扩增以后，反应产物用内部引物对W48S12(SEQ IDNO36)和W48A12(SEQ ID NO37)再扩增。
W48S12SEQ ID NO36CCAGAAGGGGTACTTTTCCW48A12SEQ ID NO37CATTGTCCTGAGGCTGTGG除了模板是1μl首轮反应1∶10稀释液(在水中)外按上述进行反应。鉴定产生正确大小PCR产物的上库，在相同条件下用相同的嵌套引物对筛选对应的下库以鉴定含有PDE8A的YACs的独特位置。
带有相关YACs的酵母菌株从遗传研究公司购买。为了确证PDE8A基因在各种YACs中存在，从每一菌株中制备DNA，并通过PCR用引物W48S8和W48A10分析。根据以前描述[Hoffman和Winston，基因57267-272(1987)]但按下面经过修改的方法从每一菌株中制备DNA。菌株在含有葡萄糖的YEP培养基中30℃过夜生长。离心沉淀10ml培养物，并在含有10mM Tris-HCl、pH8.0、100mM NaCl、1mM Na2EDTA、1％SDS和2％Triton-X100的200μl水缓冲液中重新悬浮。在200μl酚/氯仿(1∶1混合物)和100μl玻璃珠(425-600μm)的存在下通过剧烈振荡裂解细胞。裂解后，加入200μl TE缓冲液(100mM Tris、pH8.0、1mM Na2EDTA)，样品离心以分相。用200μl水缓冲液再次抽提有相机。收集的水相用100units牛胰腺PNase(Boehringer Mannheim)37℃处理1小时，根据已建立的方法样品用酚/氯仿抽提，用氯仿再抽提，乙醇沉淀。得到的沉淀重新悬浮在50μl TE缓冲液中。除了反应体积是25μl以及模板由1μl相关酵母DNA制品组成之外，按上述进行PCR。
鉴定3个位置为805B6、919H10和920A3(作为每一个CEPH命名)含有PDE8基因的人YACs。根据基因组研究数据库中心的信息(Whitehead)，3个YACs互相重叠，是人染色体6上单独连接的毗连序列群(WC6.16)的部分。在基因组研究中心的工作中此毗连序列群中的两个序列标签位点(D6S305和D6S411)放在染色体6遗传图谱距离6p端167cM的位置上；在CEPH-Genethon的工作中，D6S305定位于距离6p端173cM的位置上。在CEPH-Genethon通过荧光原位杂交已定位WC6.16毗连序列群中3个其它YACs(932F1、956B1和947D5)。杂交信号位于距离6P端0.94和0.99部分长度单位之间。根据CEPH结合的总结图谱[Chumakov等，自然377(增刊)175-297(1995)]，此区域对应于细胞遗传区域6q26-27。
与人基因组这个区域相关的遗传缺陷包括视网膜锥退化(OMIM数据库)、胰岛素依赖的糖尿病[Davies等，自然371130-136(1994)，Luo等，美国人类遗传杂志，57911-919(1995)]和青少年发病的帕金森神经机能障碍[Matsumine等，美国人类遗传杂志60588-596(1997)]。此外，在各种不同的癌细胞中，包括Burkitt′s淋巴瘤[Parsa等，基因、染色体&癌913-18(1994)]、星形细胞瘤[Liang等，神经病学44533-536(1994)]、胃癌[Queimado等，基因、染色体&癌1428-34(1995)]、甲状旁腺瘤[Tahara等，癌症研究56599-605(1996)和卵巢瘤[Cooke等，基因、染色体&瘤15 223-233(1996)]；Saito等，癌症研究565586-5589(1996)]中在此区域经常观察到杂合性的丢失(LOH)。LOH表明在受影响的区域表明存在肿瘤抑制基因[Weinberg，科学2541138-1146(1991)]。由于它的广泛表达，有可能PDE8基因的突变参与所有或者一部分这些遣传异常。
实施例8证实PDE8A1和PDE8A2代表剪接变异体并努力扩展PDE8A2的5′序列为了证实PDE8A1和PDE8A2代表5′剪接变异体，采用两种方法。首先PCR分析表明，在基因组DNA中，PDE8A1和PDE8A2的序列都不邻近普通区域的DNA序列。普通区域的基因组序列上游存在于第三个PDE8A cDNA，FB74b中，它在与实施例2中所述探针OW4835的5′端杂交的6个最初克隆的一组中得到鉴定。克隆FB74b的部分序列(3′端755个核苷酸)陈述于SEQ ID NO39。FB74b cDNA在FB85c-2和FB66a彼此分岐的相同位置与FB85c-2和FB66a分岐，但FB74b克隆不保留开放阅读框架。在FB74b序列5′至与FB66a和FB85c-2克隆序列分岐点，一个框架内终止密码子比起始甲硫氨酸密码子更接近分岐点表明，如果FB74b代表cDNA而不是未剪接前体，起始甲硫氨酸有必要位于对FB66a和FB85c-2都普通的序列中。
使用FB74b上游序列中命名为FB74bS1(SEQ ID NO40)的一个引物和对FB74b、FB66a和FB85c-2共同的序列内命名为W48A9(SEQ ID NO11)的第二个引物进行PCR分析。FB74bS1GTTAGATGAGAGGTTGCTGGSEQ ID NO40使用1μg人基因组DNA作为模板，扩增一条带，与用FB74b作为模板扩增的带具有同样大小，表明FB74b所独特的序列和共同区域在基因组DNA中是邻近的。这样FB74b序列可以代表未剪接内含子或者代表编码具有共同区域内起始甲硫氨酸蛋白的第三个剪接变异体。在两种情况下，FB85c-2和FB66a序列推测由剪接产生。
第二，使用从人皮质、小脑、心脏、肝、肺组织分离的RNA进行5′RACE分析。按所描述的[Loughney等，生物化学杂志271796-806(1996)]从冷冻组织片段中分离RNA，用使用Fast TrackTM mRNA分离系统(Invitrogen)选择polyA+mRNA。使用5μg polyA+mRNA和cDNA合成试剂盒(Boehringer Mannheim)制备双链cDNA。cDNA连接到通过退火寡核苷酸L15(SEQ ID NO41)和L30(SEQ ID NO42)形成的接头上。
L15 GTATGCTAATCTCAGSEQ ID NO41L30 CAACTCGAATTCCTTGACAGATTAGCATAC SEQ ID NO42对5′RACE，使用寡核苷酸L18(SEQ ID NO43)和W48A13(SEQ ID NO44)通过PCR扩增接头所连接的cDNA。
L18CAACTCGAATTCCTTGACSEQ ID NO43W48A13 GTTGTTCTTCCTCTTCAGCC SEQ ID NO44在25μl的反应体积中反应含有10mM Tris-HCl、pH8.3、50mMKCl、1.5mM MgCl2、0.2mM每一种dNTP、10μg/ml每一种引物和1μg接头所连接的cDNA。94℃加热步骤后，加入0.1unit Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)起始PCR，PCR继续30个循环，每个循环94℃1分钟、60℃2分钟和72℃4分钟。
PCR反应的产物用水稀释10倍，并在如上述相同条件下使用寡核苷酸L21(SEQ ID NO45)和W48A9S(SEQ ID NO46)的第2个PCR反应中用作模板。
L21 CAACTCGAATTCCTTGACAGA SEQ ID NO45W48A9S GATCGTCGACCTGTCTCTGCACTAACAC SEQ ID NO46在第2个PCR反应中扩增的DNA用EcoRI和SalI切割，并连接进已经用相同的酶消化的载体Bluescript(stratagene)中。
开始，检查来自每一组织来源的5个质粒中DNA序列，并发现PDE8A1和PDE8A2 5′都在所分离的cDNA中。也可以获得FB74b 5′序列，它是几个序列，每一人只分离一次，代表另外的剪接变异体或不相关DNA序列。
因为无PDE8A2一样cDNA比最初FB66a cDNA向5′延伸更长，为了试图延伸5′端序列分析另外的PDE8A2 RACE克隆。鉴定并测序另外5个肺PDE8A2 cDNA，但没有一个延伸PDE8A2序列。
使用L21引物(SEQ ID NO45)和引物W48A14S(SEQ IDNO47)重复RACE PCR的第2轮。
W48A14S SEQ ID NO47GATCGTCGACAAGCACTCGGTCAGCCTTCG通过PCR筛选得到的克隆，选择最长的一个用于测序。只有两个克隆比最初FB66a cDNA长，它们在未翻译区域分别延伸5′序列8和12bp。用5′-CCCAGGGCGCCA使FB66a序列得到延伸。FB66a最远5′端是GC非常丰富的，这也许决定了困难得到全长cDNA。
实施例9PDE8A的表达和特征描述实施例5中所描述重组PDE8A在酵母提取液中以低亲和和高亲和形式存在。因为有可能低亲和形式代表部分未活化酶，在sf9和COS细胞中进行PDE8A表达以试图或者获得同型酶或者确定是否两种动力学形式总是从cDNA表达。
用来自质粒W4851(实施例5中所述)3′KpnI-SalI片段和按如下PCR产生的5′片段产生PDE8A sf9表达构建物。引物FLAG-1(SEQ ID NO48)和W48A4(SEQ ID NO12)用在PDE8COS-1 DNA(在下面描述)作为模板的PCR中。
FLAG-1 GATCGGATCCACCATGGACTACAAGGSEQ ID NO48除了2mM MgSO4置换MgCl2使用并用0.02μ Taq聚合酶之外，按实施例8中所述进行PCR。94℃4分钟初始温育后，进行30个循环，94℃1分钟、50℃1分钟和72℃2分钟。5′扩增产物用BamHI和KpnI切割、凝胶纯化并与3′片段连接进已用BanHI和SalI消化的载体pFASTBC(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。得到的质粒命名为pFBRPDE8。通过测序确证所有的PCR扩增产物和所有新的结合物。
根据生产商所建议的步骤使用FastBac系统(Gibco BRL)产生重组病毒株，并按如下进行蛋白表达。sf9细胞于27℃生度在含50μ/ml氨苄青霉素和50μg/ml硫酸链霉素(Gibco)的CCM3培养基(Hyclone，Logan，UT)中生长。指数生长的细胞以大约每个细胞两个病毒的倍数感染并培养48小时。离心收集细胞，用CMF-PBS(2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、137mM NaCl、8.1mM Na2PO4)洗涤，冷冻沉淀细胞并于-80℃保藏至使用。在等体积玻璃珠(酸洗涤，0.5mm，Sigma)存在时通过剧烈振荡在缓冲液(50mM MOPS pH7.2、10μM硫酸锌、1mM DTT、2mM苯扎明、10μg/ml抑胃酶肽、亮抑酶肽和抑蛋白酶肽以及20μg/ml钙蛋白酶抑制剂I和钙蛋白酶抑制剂II)中裂解细胞，并如实施例5中所描述的确定PDE活性。
在sf9提取物中，对cAMP水解(100μM底物)检测到45.4nmol/min/mg PDE活性，对cGMP水解(100μm底物)检测到69.4nmol/min/mg PDE活性。背底PDE活性是可以忽略的。PDE8A活性好象是实施例5中所描述的如在酵母提取液中所检测到的高和低亲和形式的混和物。
对在COS细胞中的表达，通过联合来自质粒W485.1(实施例5)3′KpnI/SalI片段和切割PCR扩增产物获得的NheI/KpnI片段产生pDE8COS-l，而PCR扩增产物来自包括FB66a cDNA作为模板使用引用W48A2(SEQ ID NO10)和ATG(SEQ ID NO35)的反应。PCR的条件包括在Perkin Elmer Cetus DNA热循环仪中，94℃4分钟的初始温育，接着30个循环，94℃1分钟，50℃1分钟和72℃2分钟。得到的5′片段和上述3′片段连接进已用NheI和SalI消化的载体pClneo(Promega，Aadison，WI)中。
生长在15cm培养皿中的半融合COS细胞用25ml DMEM(Dulbeccos修改的Eagle培养基，100U/ml氨苄青霉素和100μg/ml硫酸链霉素，GIBCO)洗涤1次，之后14ml DMEM/DEAE-dextran/氯奎加到每个培养皿中。DMEM/DEAE-dextran/氯奎包括75mlDMEM和30μl存在于PBS(2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、137mM NaCl、8.1mM Na2PO4、0.9mM CaCl2、0.5mMMgCl2)中的0.25M氯奎与0.75ml 50μg/ml DEAE-dextran(Pharmacia，Uppsala，瑞典)。存在于135μl Tris/EDTA缓中液(TE)中的20μg质粒DNA加入每一培养皿中，培养皿于37℃在5％CO2中培养2小时。去除培养基，加入12ml 10％DMSO/PBS 1分钟并去除。细胞用25ml DMEM洗涤1次，之后另外25ml含有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的DMEM加入，细胞于37℃在5％CO2中过夜培养。去除培养基并用25ml CMF-PBS洗涤单层细胞。加入6ml含有0.05％胰蛋白酶/0.5mM EDTA(Gibco)的溶液。细胞于37℃温育5分钟。通过研磨从培养皿中取出细胞并转移到园锥形离心管中。培养皿用6ml完全DMEM洗涤以收获任何剩余的细胞，洗涤溶液加到离心管中。通过在大约340×g下离心5分钟沉淀细胞，在5ml完全DMEM中重新悬浮，移至含20ml完全DMEM的15cm组织培养皿中，于5％CO2中过夜培养。
单层细胞用CMF-PBS洗涤两次，在维尔烯(0.5mMNa2EDTA·2H2O、137mM NaCl、2.68mM KCl、8.1mMNa2HPO4、1.1mM葡萄糖、pH7.4)中于37℃温育5分钟，并按上述收获。沉淀的细胞用CMF-PBS洗涤，在干冰中冷冻，并保藏于-80℃直至使用。在缓中液(50mM MOPS、pH7.2、10μM硫酸锌、1mM DTT、2mM苯扎明10μg/ml抑胃酶肽、亮抑酶肽、抑蛋白肽和20μg/ml钙蛋白酶抑制剂I和钙蛋白酶抑制剂II)中于20000psi通过French压力细胞(SLM仪器)裂解细胞，如实施例5中所描述的方法确定PDE活性。
PDE8A的表达在COS细胞提取液中是低的，由于来自内源PDEs的高水平背景活性，不能精确确定其特征。为了更完全确定COS细胞表达产物的特征，根据生产商建议的步骤，使用抗-FLAG M2亲和柱(Sigma)从细胞提取液100000xg上清中纯化包括在氨基端FLAG标签的酶(实施例5)。为了更精确确定酵母PDE8A活性的特征，如实施例5中所描述的为了获得同型蛋白进行氨基端截短但保留催化区域的重组蛋白的表达。
实施例10抗-PDE8A抗体的合成在大肠杆菌中合成GST融合蛋白以提供产生抗PDE8A单克隆抗体的抗原。来自FB70a(包括FB85c-2的核苷酸182-1330的一个PDE8AcDNA，它是最初鉴定的与实施例2中所述全长WO4835探针杂交的9个克隆之一)的EcoRI片段插入pGEX5XI(Pharmacia)的EcoRI位点，得到的构建物转化进大肠杆菌菌株XL1 Blue。用IPTG诱导此构建物产生包括来自PDE8A 382个氨基酸的GST-PDE8融合蛋白。用SDS-PAQE分离融合蛋白，用冷0.4M KCl染色后从凝胶中取出合适大小的带，并通过电洗脱从丙烯酰胺中获得蛋白。洗脱产物逆着PBS透析，注射进小鼠之前用Centriprep 10和Centricon柱(Amicon，BeverlyMA)浓缩。
第0天，4只Balble小鼠预先出血，并用200μl总体积中在完全弗氏佐剂中包括30μg/小鼠GST-PDE8融合蛋白的抗原皮下注射。在第3周和第9周在不完全弗氏佐剂中重复相同的注射。最后一次免疫后10天，获得检测血样，并通过抗原捕获ELISA和Western分析来筛选。
在ELISA中，Immulon 4培养板(Dynex，Cambridge，Massachusetts)于4℃用50μl/孔于50mM碳酸盐缓中液pH9.6中含2μg/ml GST-PDE8的溶液来包被。培养板用0.5％鱼皮明胶(Sigma)封闭30分钟，加入在PBS加5％Tween 20(PBST)中稀释的50μl血清。血清稀释液范围从1∶100至1∶102400，通过一系列加倍稀释获得。37℃温育30分钟并用PBST洗涤3次，加入50μl偶联辣根过氧化物酶的山羊-抗小鼠IgG(fc)抗体(Jockson)(在PBST中以1∶1000稀释)。如上述温育培养板并用PBST洗涤4次。加入四甲基联苯胺(Sigma Chemical，St.Louis，Missouri)检测抗体，加入50μl15％ H2SO45分钟后终止颜色反应。在培养板阅读仪上测量450nm的吸收值。
对Western分析，用大约10μg酵母PDE8提取物和大约200ng凝胶纯化的GST-PDE8跑SDS-PAGE凝胶，并且蛋白转移至Immobilon-PVDF上。使用BioRad山羊抗小鼠IgG辣根过氧化酶作为二抗进行一个标准的加强化学发光(ECL)Western印迹方法。
在制备杂交瘤时，来自上面ELISA和/或Western点杂交方面给出阳性结果的小鼠脾细胞使用聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)通过标准方法以5∶1的比率与NS-1融合(Harlow和Lane，抗体，实验室手册，冷泉港实验室，1988)。融合细胞重新悬浮于200ml含15％ FBS、100mM次黄嘌呤钠、0.4mM氨基喋呤、16mM胸腺嘧啶(HAT)(Gibco)、25units/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106小鼠胸腺细胞/ml的RPMI中，并以200μl/孔分配至10个96孔平底组织培养板中(Corning，United kingdon)。通过用18G针(Becton Dickinson)从每一孔中吸出大约100μl，并加入除含有10units/ml IL-6和缺少胸腺细胞之外的上述100μl/孔铺板培养基在融合后第2、4和6天饲养细胞。在第9至12天，通过使用GST和GST-PDE8的抗原捕获ELISA和上述ELC Western分析筛选来自融合孔的上清。
使用小鼠血在Western杂交的两个泳道上获得预期大小的阳性信号，在随后的融合中获得与酵母重组蛋白具有弱反应性的单克隆抗体。使用50μg抗原/小鼠重复整个过程以获得更强免疫反应的单克隆抗体。
实施例11通过原位杂交分析PDE8A的表达通过如下述的原位杂交在组织切片中检查PDE8A的表达。探针的制备来自cDNA FB70a的XhoI/EcoRI限制酶片段(对应于SEQ IDNO1的核苷酸571至1226)亚克隆进Bluescript载体(Stratagene，LaJolla，CA)以产生命名为PDE8XR2A的表达质粒。质粒用XhoI切割并用T3聚合酶转录(见下面)以产生反义探针。用EcoRI切割PDE8XR2A并用T7聚合酶转录产生正义探针。使用RNA转录试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)在含有5μl 5X转录缓冲液(Stratagene)、30mMDTT(Stratagene)、0.8mM每一种ATP、CTP、GTP(10mM(Stratagene)、40U Rnase BlockII(Stratagene)、12.5U T3或T7聚合酶(Stratagene)、和300ng线性化质粒模板、50μ Ci35S-UTP(大于1000Ci/mmol，Amersham，Arlington Heights，IL)的反应中转录PDE8A模板。混合物于37℃温育1小时，之后加入1μl无RNase的DNase I(Stratagene)并于37℃温育15分钟去除模板DNA。60℃下加入4μl 1M NaHCO3和6μl 1M Na2CO322分钟分解探针，通过加入25μl含有100μl 3M乙酸钠、5μl乙酸(VWR，So.Plainfield，NJ)和395μl dH2O的溶液中和反应混合物。根据生产商建议的方法制备一个Quick Spin G50 RNA柱(5′→3′Inc.，Boulder，Co)。探针放在柱子中心，柱子在桌子高离心机中于1000rpm离心4分钟。柱子的流经液体与50μl H2O、2μl 10mg/ml tRNA溶液、10μl 3M乙酸钠和200μl 100％乙醇(VWR)混和，得到的混合液于-20℃下温育过夜。探针溶液于4℃微量离心15分钟，去除上清，沉淀重新悬浮于含有1μl 0.1M DTT的40μl 1X TBE中。探针保藏于-70℃直至进行原位杂交试验。
组织样品的制备和原位杂交。
组织(国立疾病研究交流中心，Philadephia，PA和合作的人组织网络，Philadephia，PA)以6μm切片，并放置于Super frost Plus切片(VWR)上。切片4℃于4％低聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO)中固定20分钟。载玻片在1X CMF-PBS中洗3次，在用70％乙醇、95％乙醇和100％乙醇的3次连续洗涤中脱水，于室温干燥30分钟。载玻片在存在于2X SSC中的70％甲酰胺(J.T.Baker)中于70℃放置2分钟，于4℃在2X SSC中冲洗，通过70％、95％和100％乙醇洗涤而脱水，并室温下干燥30分钟。
将载玻片放置在避光盒子中，盒子中含有用存在于4X SSC中50％甲酰胺(J.T.Baker)的盒子缓冲液饱和的一张滤纸。每一个切片用100μl由10％硫酸葡聚糖(Sigma)、50％甲酰胺(J.T.Baker，Phillpsburg，NJ)100mM DTT(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、0.3M NaCl(Sigma)、20mM Tris、pH7.5、5mM EDTA(Sigma)、和1×Denhardt′s溶液(Sigma)组成的rHB2缓冲液覆盖，载玻片于42℃温育1小时。通过将4×105cpm/每个组织切片与每个切片5μl 10mg/ml tRNA溶液混合并于95℃加热混合物3分钟制备如上述的探针。加入冰冷rHB2缓冲液使终体积为20μl/每个切片。含有探针的溶液(20μl/切片)加到以前加入的100μl rHB2缓冲液中。载玻片于55℃温育12至16小时。杂交后，载玻片用含有10mM DTT的4×SSC于室温下洗涤1小时，在50％去离子甲酰胺(J.T.Baker)、1×SSC、和1mM DTT中于60℃洗40分钟，于2×SSC中室温下洗30分钟，在0.1×SSC于室温下洗30分钟。切片通过70％、95％和100％乙醇洗涤而脱水，空气干燥30分钟。载玻片浸在KodakNTB2核乳胶中，于黑暗中室温干燥1至3小时，并在黑暗中于4℃下用干燥剂保藏直至显影时间。载玻片在4℃ Kodak Dektol显影液中显影4分钟，在4℃dH2O中浸泡4次，在4℃ Kodak定影液中放置4分钟。载玻片用dH2O冲洗，按如下进行标准H&E染色。
载玻片在dH2O中冲洗，并通过载玻片的转移经过下列一系列用苏木精和曙丝染色在甲醛/乙醇(100ml甲醛、900ml 80％乙醇)中5分钟；于水中洗涤3次总共2分钟；在0.75％ Harris苏木精(Sigma)中5分钟；在水中洗涤3次总共2分钟；4次浸泡在1％碳酸锂中；在水中10分钟；在0.5％曙红(Sigma)中2分钟；在水中洗3次总共2分钟；在70％乙醇中2分钟；在95％乙醇中3次1分钟洗涤；在100％乙醇中两次1分钟洗涤；两次2分钟在二甲苯洗涤。用Cytoseal 60(Stephens Scientific，Riverdale，NJ)封闭载玻片。
用反义PDE8A探针获得的信号与正义PDE8A探针产生的对照信号相比较，对反义探针特异的信号可认为代表PDE8A的表达。在整个小脑的大部分、睾丸输精小管的一个细胞亚群中、骨骼肌仍未确定来源的分散细胞中、卵巢粒膜细胞和卵巢基质中、肾Henle襻的上皮细胞中和心脏一些小动脉的平滑肌中检测到PDE8A的信号。
这些结果不同于通过实施例6中所述Northern杂交所获得的结果，因为由Northern杂交在心脏检测到中等信号，而使用此心脏样品的原位数据给出弱信号。这种不一致反应来自不同个体组织中的差异或者两种方法固有的测检差异的水平。卵巢中的信号和肾中的信号表明PDE8A分别参与排卵或盐和/或水自身稳定。
对本领域的那些熟练技术人员预期发生如在上面说明的实施例中所陈述的本发明的许多修改和变化方法。因而只有出现在附加权利说明中的限制应放在本发明中。
序列表<110>Loughney，Kate<120>磷酸二酯酶8A<130>27866/35047<140>
<141>
<150>08/951,648<151>1997-10-16<160>48<170>PatentIn Ver. 2.0<210>1<211>2298<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(2298)<220>
<221>misc_feature<222>(868)..(870)<223>
核苷酸868-870所编码的氨基酸是Pro或Leu<400>1ttg aca gat gaa aaa gtg aag gca tat ctt tct ctt cac ccc cag gta 48Leu Thr Asp Glu Lys Val Lys Ala Tyr Leu Ser Leu His Pro Gln Val1 5 10 15tta gat gaa ttt gta tct gaa agt gtt agt gca gag aca gta gag aaa 96Leu Asp Glu Phe Val Ser Glu Ser Val Ser Ala Glu Thr Val Glu Lys20 25 30tgg ctg aag agg aag aac aac aaa tca gaa gat gaa tcg gct cct aag 144Trp Leu Lys Arg Lys Asn Asn Lys Ser Glu Asp Glu Ser Ala Pro Lys35 40 45gaa gtc agc agg tac caa gat acg aat atg cag gga gtt gta tat gaa 192Glu Val Ser Arg Tyr Gln Asp Thr Asn Met Gln Gly Val Val Tyr Glu50 55 60cta aac agc tat ata gaa caa cgg ttg gac aca gga gga gac aac cag 240Leu Asn Ser Tyr Ile Glu Gln Arg Leu Asp Thr Gly Gly Asp Asn Gln65 70 75 80
cta ctc ctc tat gaa ctg agc agc atc att aaa ata gcc aca aaa gcc 288Leu Leu Leu Tyr Glu Leu Ser Ser Ile Ile Lys Ile Ala Thr Lys Ala85 90 95gat gga ttt gca ctg tat ttc ctt gga gag tgc aat aat agc ctg tgt 336Asp Gly Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Gly Glu Cys Asn Asn Ser Leu Cys100 105 110ata ttc acg cca cct ggg ata aag gaa gga aaa ccc cgc ctc atc cct 384Ile Phe Thr Pro Pro Gly Ile Lys Glu Gly Lys Pro Arg Leu Ile Pro115 120 125gct ggg ccc atc act cag ggc acc acc gtc tct gct tat gtg gcc aag 432Ala Gly Pro Ile Thr Gln Gly Thr Thr Val Ser Ala Tyr Val Ala Lys130 135 140tcc agg aaa aca ctg cta gta gaa gac atc ctt gga gat gaa cga ttt 480Ser Arg Lys Thr Leu Leu Val Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Arg Phe145 150 155 160cca aga ggt act gga ctg gaa tca ggg act cgt atc cag tct gtt ctt 528Pro Arg Gly Thr Gly Leu Glu Ser Gly Thr Arg Ile Gln Ser Val Leu165 170 175tgc tta cca att gtc act gca att ggt gac ttg att ggt att ctc gag 576Cys Leu Pro Ile Val Thr Ala Ile Gly Asp Leu Ile Gly Ile Leu Glu180 185 190ctg tat cgg cac tgg ggc aaa gaa gcc ttc tgt ctt agt cac cag gag 624Leu Tyr Arg His Trp Gly Lys Glu Ala Phe Cys Leu Ser His Gln Glu195 200 205gtt gca aca gca aat ctt gcc tgg gct tca gta gca ata cat cag gtg 672Val Ala Thr Ala Asn Leu Ala Trp Ala Ser Val Ala Ile His Gln Val210 215 220cag gta tgc aga ggc ctt gcc aaa cag aca gaa ttg aat gac ttc cta 720Gln Val Cys Arg Gly Leu Ala Lys Gln Thr Glu Leu Asn Asp Phe Leu225 230 235 240ctc gac gta tca aaa aca tat ttt gat aac ata gtt gca ata gat tct 768Leu Asp Val Ser Lys Thr Tyr Phe Asp Asn Ile Val Ala Ile Asp Ser245 250 255cta ctt gaa cac ata atg ata tat gca aaa aac ctg gtg aat gcc gat 816Leu Leu Glu His Ile Met Ile Tyr Ala Lys Asn Leu Val Asn Ala Asp260 265 270cgt tgt gca ctt ttc cag gtg gac cat aag aac aag gag tta tat tca 864Arg Cys Ala Leu Phe Gln Val Asp His Lys Asn Lys Glu Leu Tyr Ser275 280 285
gac cyt ttt gat att gga gag gaa aag gaa gga aaa cct gtc ttc aag912Asp Xaa Phe Asp Ile Gly Glu Glu Lys Glu Gly Lys Pro Val Phe Lys290 295 300aag acc aaa gag ata aga ttt tca att gag aaa gga att gct ggc caa960Lys Thr Lys Glu Ile Arg Phe Ser Ile Glu Lys Gly Ile Ala Gly Gln305 310 315 320gta gca aga aca ggg gaa gtc ctg aac att cca gat gcc tat gca gac1008Val Ala Arg Thr Gly Glu Val Leu Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Ala Asp325 330 335cca cgc ttt aac aga gaa gta gac ttg tac aca ggc tac acc acg cgg1056Pro Arg Phe Asn Arg Glu Val Asp Leu Tyr Thr Gly Tyr Thr Thr Arg340 345 350aac atc ctg tgc atg ccc atc gtc agc cga ggc agc gtg ata ggt gtg1104Asn Ile Leu Cys Met Pro Ile Val Ser Arg Gly Ser Val Ile Gly Val355 360 365gtg cag atg gtc aac aaa atc agt ggc agt gcc ttc tct aaa aca gat1152Val Gln Met Val Asn Lys Ile Ser Gly Ser Ala Phe Ser Lys Thr Asp370 375 380gaa aac aac ttc aaa atg ttt gcc gtc ttt tgt gct tta gcc tta cac1200Glu Asn Asn Phe Lys Met Phe Ala Val Phe Cys Ala Leu Ala Leu His385 390 395 400tgt gct aat atg tat cat aga att cgc cac tca gag tgc att tac cgg1248Cys Ala Asn Met Tyr His Arg Ile Arg His Ser Glu Cys Ile Tyr Arg405 410 415gta acg atg gaa aag ctg tcc tac cat agc att tgt act tca gaa gag1296Val Thr Met Glu Lys Leu Ser Tyr His Ser Ile Cys Thr Ser Glu Glu420 425 430tgg caa ggt ctc atg caa ttc acc ctt ccc gtg cgt ctc tgc aaa gaa1344Trp Gln Gly Leu Met Gln Phe Thr Leu Pro Val Arg Leu Cys Lys Glu435 440 445att gaa tta ttc cac ttt gac att ggt cct ttt gaa aac atg tgg cct1392Ile Glu Leu Phe His Phe Asp Ile Gly Pro Phe Glu Asn Met Trp Pro450 455 460gga att ttt gtc tac atg gtt cat cgg tcc tgt ggg aca tcc tgc ttt1440Gly Ile Phe Val Tyr Met Val His Arg Ser Cys Gly Thr Ser Cys Phe465 470 475 480gag ctt gaa aag ttg tgt cgt ttt att atg tct gtg aag aag aac tat1488Glu Leu Glu Lys Leu Cys Arg Phe Ile Met Ser Val Lys Lys Asn Tyr485 490 495
cgg cgg gtt cct tat cac aac tgg aag cat gcg gtc act gta gca cac1536Arg Arg Val Pro Tyr His Asn Trp Lys His Ala Val Thr Val Ala His500 505 510tgc atg tat gcc ata ctt cag aac aat cac acg ctt ttc aca gac ctt1584Cys Met Tyr Ala Ile Leu Gln Asn Asn His Thr Leu Phe Thr Asp Leu515 520 525gag cgc aaa gga ctg ctg att gcg tgt ctg tgt cat gac ctg gac cac1632Glu Arg Lys Gly Leu Leu Ile Ala Cys Leu Cys His Asp Leu Asp His530 535 540agg ggc ttc agt aac agc tac ctg cag aag ttc gac cac cct ctg gcc1680Arg Gly Phe Ser Asn Ser Tyr Leu Gln Lys Phe Asp His Pro Leu Ala545 550 555 560gct ctc tac tcc act tcc acc atg gag cag cac cac ttc tcc cag act1728Ala Leu Tyr Ser Thr Ser Thr Met Glu Gln His His Phe Ser Gln Thr565 570 575gtg tcc atc ctc cag ttg gaa ggg cac aat atc ttc tcc act ctg agc1776Val Ser Ile Leu Gln Leu Glu Gly His Asn Ile Phe Ser Thr Leu Ser580 585 590tcc agt gaa tat gag cag gtg ctt gag atc atc cgc aaa gcc atc att1824Ser Ser Glu Tyr Glu Gln Val Leu Glu Ile Ile Arg Lys Ala Ile Ile595 600 605gcc aca gac ctt gct tta tac ttt gga aac agg aag cag ttg gaa gag1872Ala Thr Asp Leu Ala Leu Tyr Phe Gly Asn Arg Lys Gln Leu Glu Glu610 615 620atg tac cag acc gga tca cta aac ctt aat aat caa tca cat aga gac1920Met Tyr Gln Thr Gly Ser Leu Asn Leu Asn Asn Gln Ser His Arg Asp625 630 635 640cgt gta att ggt ttg atg atg act gcc tgt gac ctt tgt tct gtg aca1968Arg Val Ile Gly Leu Met Met Thr Ala Cys Asp Leu Cys Ser Val Thr645 650 655aaa ctg tgg ccc gtt aca aaa ttg acg gca aat gat ata tat gca gaa2016Lys Leu Trp Pro Val Thr Lys Leu Thr Ala Asn Asp Ile Tyr Ala Glu660 665 670ttc tgg gct gag ggt gat gaa atg aag aaa ttg gga ata cag cct att2064Phe Trp Ala Glu Gly Asp Glu Met Lys Lys Leu Gly Ile Gln Pro Ile675 680 685cct atg atg gac aga gac aag aag gat gaa gtc ccc caa ggc cag ctt2112Pro Met Met Asp Arg Asp Lys Lys Asp Glu Val Pro Gln Gly Gln Leu690 695 700
ggg ttc tac aat gcc gtg gcc att ccc tgc tat aca acc ctt acc cag2160Gly Phe Tyr Asn Ala Val Ala Ile Pro Cys Tyr Thr Thr Leu Thr Gln705 710 715 720atc ctc cct ccc acg gag cct ctt ctg aaa gca tgc agg gat aat ctc2208Ile Leu Pro Pro Thr Glu Pro Leu Leu Lys Ala Cys Arg Asp Asn Leu725 730 735agt cag tgg gag aag gtg att cga ggg gag gag act gca acc tgg att2256Ser Gln Trp Glu Lys Val Ile Arg Gly Glu Glu Thr Ala Thr Trp Ile740 745 750tca tcc cca tcc gtg gct cag aag gca gct gca tct gaa gat2298Ser Ser Pro Ser Val Ala Gln Lys Ala Ala Ala Ser Glu Asp755 760 765<210>2<211>766<212>蛋白质<213>人<400>2Leu Thr Asp Glu Lys Val Lys Ala Tyr Leu Ser Leu His Pro Gln Val1 5 10 15Leu Asp Glu Phe Val Ser Glu Ser Val Ser Ala Glu Thr Val Glu Lys20 25 30Trp Leu Lys Arg Lys Asn Asn Lys Ser Glu Asp Glu Ser Ala Pro Lys35 40 45Glu Val Ser Arg Tyr Gln Asp Thr Asn Met Gln Gly Val Val Tyr Glu50 55 60Leu Asn Ser Tyr Ile Glu Gln Arg Leu Asp Thr Gly Gly Asp Asn Gln65 70 75 80Leu Leu Leu Tyr Glu Leu Ser Ser Ile Ile Lys Ile Ala Thr Lys Ala85 90 95Asp Gly Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Gly Glu Cys Asn Asn Ser Leu Cys100 105 110Ile Phe Thr Pro Pro Gly Ile Lys Glu Gly Lys Pro Arg Leu Ile Pro115 120 125Ala Gly Pro Ile Thr Gln Gly Thr Thr Val Ser Ala Tyr Val Ala Lys130 135 140Ser Arg Lys Thr Leu Leu Val Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Arg Phe145 150 155 160
Pro Arg Gly Thr Gly Leu Glu Ser Gly Thr Arg Ile Gln Ser Val Leu165 170 175Cys Leu Pro Ile Val Thr Ala Ile G1y Asp Leu Ile Gly Ile Leu Glu180 185 190Leu Tyr Arg His Trp Gly Lys Glu Ala Phe Cys Leu Ser His Gln Glu195 200 205Val Ala Thr Ala Asn Leu Ala Trp Ala Ser Val Ala Ile His Gln Val210 215 220Gln Val Cys Arg Gly Leu Ala Lys Gln Thr Glu Leu Asn Asp Phe Leu225 230 235 240Leu Asp Val Ser Lys Thr Tyr Phe Asp Asn Ile Val Ala Ile Asp Ser245 250 255Leu Leu Glu His Ile Met Ile Tyr Ala Lys Asn Leu Val Asn Ala Asp260 265 270Arg Cys Ala Leu Phe Gln Val Asp His Lys Asn Lys Glu Leu Tyr Ser275 280 285Asp Xaa Phe Asp Ile Gly Glu Glu Lys Glu Gly Lys Pro Val Phe Lys290 295 300Lys Thr Lys Glu Ile Arg Phe Ser Ile Glu Lys Gly Ile Ala Gly Gln305 310 315 320Val Ala Arg Thr Gly Glu Val Leu Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Ala Asp325 330 335Pro Arg Phe Asn Arg Glu Val Asp Leu Tyr Thr Gly Tyr Thr Thr Arg340 345 350Asn Ile Leu Cys Met Pro Ile Val Ser Arg Gly Ser Val Ile Gly Val355 360 365Val Gln Met Va1 Asn Lys Ile Ser Gly Ser Ala Phe Ser Lys Thr Asp370 375 380Glu Asn Asn Phe Lys Met Phe Ala Val Phe Cys Ala Leu Ala Leu His385 390 395 400Cys Ala Asn Met Tyr His Arg Ile Arg His Ser Glu Cys Ile Tyr Arg405 410 415Val Thr Met Glu Lys Leu Ser Tyr His Ser Ile Cys Thr Ser Glu Glu420 425 430Trp Gln Gly Leu Met Gln Phe Thr Leu Pro Val Arg Leu Cys Lys Glu435 440 445
Ile Glu Leu Phe His Phe Asp Ile Gly Pro Phe Glu Asn Met Trp Pro450 455 460Gly Ile Phe Val Tyr Met Val His Arg Ser Cys Gly Thr Ser Cys Phe465 470 475 480Glu Leu Glu Lys Leu Cys Arg Phe Ile Met Ser Val Lys Lys Asn Tyr485 490 495Arg Arg Val Pro Tyr His Asn Trp Lys His Ala Val Thr Val Ala His500 505 510Cys Met Tyr Ala Ile Leu Gln Asn Asn His Thr Leu Phe Thr Asp Leu515 520 525Glu Arg Lys Gly Leu Leu Ile Ala Cys Leu Cys His Asp Leu Asp His530 535 540Arg Gly Phe Ser Asn Ser Tyr Leu Gln Lys Phe Asp His Pro Leu Ala545 550 555 560Ala Leu Tyr Ser Thr Ser Thr Met Glu Gln His His Phe Ser Gln Thr565 570 575Val Ser Ile Leu Gln Leu Glu Gly His Asn Ile Phe Ser Thr Leu Ser580 585 590Ser Ser Glu Tyr Glu Gln Val Leu Glu Ile Ile Arg Lys Ala Ile Ile595 600 605Ala Thr Asp Leu Ala Leu Tyr Phe Gly Asn Arg Lys Gln Leu Glu Glu610 615 620Met Tyr Gln Thr Gly Ser Leu Asn Leu Asn Asn Gln Ser His Arg Asp625 630 635 640Arg Val Ile Gly Leu Met Met Thr Ala Cys Asp Leu Cys Ser Val Thr645 650 655Lys Leu Trp Pro Val Thr Lys Leu Thr Ala Asn Asp Ile Tyr Ala Glu660 665 670Phe Trp Ala Glu Gly Asp Glu Met Lys Lys Leu Gly Ile Gln Pro Ile675 680 685Pro Met Met Asp Arg Asp Lys Lys Asp Glu Val Pro Gln Gly Gln Leu690 695 700Gly Phe Tyr Asn Ala Val Ala Ile Pro Cys Tyr Thr Thr Leu Thr Gln705 710 715 720Ile Leu Pro Pro Thr Glu Pro Leu Leu Lys Ala Cys Arg Asp Asn Leu725 730 735
Ser Gln Trp Glu Lys Val Ile Arg Gly Glu Glu Thr Ala Thr Trp Ile740745 750Ser Ser Pro Ser Val Ala Gln Lys Ala Ala Ala Ser Glu Asp755 760 765<210>3<211>4389<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(3)..(2411)<400>3gc ttc gcc ctc gcc gcc gcg gcc gcg ctg ctc ttc ggc tcc gac atg47Phe Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ser Asp Met1 5 10 15gaa gat gga cct tct aat aat gcg agc tgc ttc cga agg ctg acc gag 95Glu Asp Gly Pro Ser Asn Asn Ala Ser Cys Phe Arg Arg Leu Thr Glu20 25 30tgc ttc ctg agc ccc agt ttg aca gat gaa aaa gtg aag gca tat ctt 143Cys Phe Leu Ser Pro Ser Leu Thr Asp Glu Lys Val Lys Ala Tyr Leu35 40 45tct ctt cac ccc cag gta tta gat gaa ttt gta tct gaa agt gtt agt 191Ser Leu His Pro Gln Val Leu Asp Glu Phe Val Ser Glu Ser Val Ser50 55 60gca gag aca gta gag aaa tgg ctg aag agg aag aac aac aaa tca gaa 239Ala Glu Thr Val Glu Lys Trp Leu Lys Arg Lys Asn Asn Lys Ser Glu65 70 75gat gaa tcg gct cct aag gaa gtc agc agg tac caa gat acg aat atg 287Asp Glu Ser Ala Pro Lys Glu Val Ser Arg Tyr Gln Asp Thr Asn Met80 85 90 95cag gga gtt gta tat gaa cta aac agc tat ata gaa caa cgg ttg gac 335Gln Gly Val Val Tyr Glu Leu Asn Ser Tyr Ile Glu Gln Arg Leu Asp100 105 110aca gga gga gac aaccag cta ctc ctc tat gaa ctg agc agc atc att383Thr Gly Gly Asp Asn Gln Leu Leu Leu Tyr Glu Leu Ser Ser Ile Ile115 120 125aaa ata gcc aca aaa gcc gat gga ttt gca ctg tat ttc ctt gga gag 431Lys Ile Ala Thr Lys Ala Asp Gly Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Gly Glu130 135 140
tgc aat aat agc ctg tgt ata ttc acg cca cct ggg ata aag gaa gga479Cys Asn Asn Ser Leu Cys Ile Phe Thr Pro Pro Gly Ile Lys Glu Gly145 150 155aaa ccc cgc ctc atc cct gct ggg ccc atc act cag ggc acc acc gtc527Lys Pro Arg Leu Ile Pro Ala Gly Pro Ile Thr Gln Gly Thr Thr Val160 165 170 175tct gct tat gtg gcc aag tcc agg aaa aca ctg cta gta gaa gac atc575Ser Ala Tyr Val Ala Lys Ser Arg Lys Thr Leu Leu Val Glu Asp Ile180 185 190ctt gga gat gaa cga ttt cca aga ggt act gga ctg gaa tca ggg act623Leu Gly Asp Glu Arg Phe Pro Arg Gly Thr Gly Leu Glu Ser Gly Thr195 200 205cgt atc cag tct gtt ctt tgc tta cca att gtc act gca att ggt gac671Arg Ile Gln Ser Val Leu Cys Leu Pro Ile Val Thr Ala Ile Gly Asp210 215 220ttg att ggt att ctc gag ctg tat cgg cac tgg ggc aaa gaa gcc ttc719Leu Ile Gly Ile Leu Glu Leu Tyr Arg His Trp Gly Lys Glu Ala Phe225 230 235tgt ctt agt cac cag gag gtt gca aca gca aat ctt gcc tgg gct tca767Cys Leu Ser His Gln Glu Val Ala Thr Ala Asn Leu Ala Trp Ala Ser240 245 250 255gta gca ata cat cag gtg cag gta tgc aga ggc ctt gcc aaa cag aca815Val Ala Ile His Gln Val Gln Val Cys Arg Gly Leu Ala Lys Gln Thr260 265 270gaa ttg aat gac ttc cta ctc gac gta tca aaa aca tat ttt gat aac863Glu Leu Asn Asp Phe Leu Leu Asp Val Ser Lys Thr Tyr Phe Asp Asn275 280 285ata gtt gca ata gat tct cta ctt gaa cac ata atg ata tat gca aaa911Ile Val Ala Ile Asp Ser Leu Leu Glu His Ile Met Ile Tyr Ala Lys290 295 300aac ctg gtg aat gcc gat cgt tgt gca ctt ttc cag gtg gac cat aag959Asn Leu Val Asn Ala Asp Arg Cys Ala Leu Phe Gln Val Asp His Lys305 310 315aac aag gag tta tat tca gac cct ttt gat att gga gag gaa aag gaa1007Asn Lys Glu Leu Tyr Ser Asp Pro Phe Asp Ile Gly Glu Glu Lys Glu320 325 330 335gga aaa cct gtc ttc aag aag acc aaa gag ata aga ttt tca att gag1055Gly Lys Pro Val Phe Lys Lys Thr Lys Glu Ile Arg Phe ser Ile Glu340 345 350
aaa gga att gct ggc caa gta gca aga aca ggg gaa gtc ctg aac att1103Lys Gly Ile Ala Gly Gln Val Ala Arg Thr Gly Glu Val Leu Asn Ile355 360 365cca gat gcc tat gca gac cca cgc ttt aac aga gaa gta gac ttg tac1151Pro Asp Ala Tyr Ala Asp Pro Arg Phe Asn Arg Glu Val Asp Leu Tyr370 375 380aca ggc tac acc acg cgg aac atc ctg tgc atg ccc atc gtc agc cga1199Thr Gly Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Cys Met Pro Ile Val Ser Arg385 390 395ggc agc gtg ata ggt gtg gtg cag atg gtc aac aaa atc agt ggc agt1247Gly Ser Val Ile Gly Val Val Gln Met Val Asn Lys Ile Ser Gly Ser400 405 410 415gcc ttc tct aaa aca gat gaa aac aac ttc aaa atg ttt gcc gtc ttt1295Ala Phe Ser Lys Thr Asp Glu Asn Asn Phe Lys Met Phe Ala Val Phe420 425 430tgt gct tta gcc tta cac tgt gct aat atg tat cat aga att cgc cac1343Cys Ala Leu Ala Leu His Cys Ala Asn Met Tyr His Arg Ile Arg His435 440 445tca gag tgc att tac cgg gta acg atg gaa aag ctg tcc tac cat agc1391Ser Glu Cys Ile Tyr Arg Val Thr Met Glu Lys Leu Ser Tyr His Ser450 455 460att tgt act tca gaa gag tgg caa ggt ctc atg caa ttc acc ctt ccc1439Ile Cys Thr Ser Glu Glu Trp Gln Gly Leu Met Gln Phe Thr Leu Pro465 470 475gtg cgt ctc tgc aaa gaa att gaa tta ttc cac ttt gac att ggt cct1487Val Arg Leu Cys Lys Glu Ile Glu Leu Phe His Phe Asp Ile Gly Pro480 485 490 495ttt gaa aac atg tgg cct gga att ttt gtc tac atg gtt cat cgg tcc1535Phe Glu Asn Met Trp Pro Gly Ile Phe Val Tyr Met Val His Arg Ser500 505 510tgt ggg aca tcc tgc ttt gag ctt gaa aag ttg tgt cgt ttt att atg1583Cys Gly Thr Ser Cys Phe Glu Leu Glu Lys Leu Cys Arg Phe Ile Met515 520 525tct gtg aag aag aac tat cgg cgg gtt cct tat cac aac tgg aag cat1631Ser Val Lys Lys Asn Tyr Arg Arg Val Pro Tyr His Asn Trp Lys His530 535 540gcg gtc act gta gca cac tgc atg tat gcc ata ctt cag aac aat cac1679Ala Val Thr Val Ala His Cys Met Tyr Ala Ile Leu Gln Asn Asn His545 550 555
acg ctt ttc aca gac ctt gag cgc aaa gga ctg ctg att gcg tgt ctg1727Thr Leu Phe Thr Asp Leu Glu Arg Lys Gly Leu Leu Ile Ala Cys Leu560 565 570 575tgt cat gac ctg gac cac agg ggc ttc agt aac agc tac ctg cag aag1775Cys His Asp Leu Asp His Arg Gly Phe Ser Asn Ser Tyr Leu Gln Lys580 585 590ttc gac cac cct ctg gcc gct ctc tac tcc act tcc acc atg gag cag1823Phe Asp His Pro Leu Ala Ala Leu Tyr Ser Thr Ser Thr Met Glu Gln595 600 605cac cac ttc tcc cag act gtg tcc atc ctc cag ttg gaa ggg cac aat1871His His Phe Ser Gln Thr Val Ser Ile Leu Gln Leu Glu Gly His Asn610 615 620atc ttc tcc act ctg agc tcc agt gaa tat gag cag gtg ctt gag atc1919Ile Phe Ser Thr Leu Ser Ser Ser Glu Tyr Glu Gln Val Leu Glu Ile625 630 635atc cgc aaa gcc atc att gcc aca gac ctt gct tta tac ttt gga aac1967Ile Arg Lys Ala Ile Ile Ala Thr Asp Leu Ala Leu Tyr Phe Gly Asn640 645 650 655agg aag cag ttg gaa gag atg tac cag acc gga tca cta aac ctt aat2015Arg Lys Gln Leu Glu Glu Met Tyr Gln Thr Gly Ser Leu Asn Leu Asn660 665 670aat caa tca cat aga gac cgt gta att ggt ttg atg atg act gcc tgt2063Asn Gln Ser His Arg Asp Arg Val Ile Gly Leu Met Met Thr Ala Cys675 680 685gac ctt tgt tct gtg aca aaa ctg tgg ccc gtt aca aaa ttg acg gca2111Asp Leu Cys Ser Val Thr Lys Leu Trp Pro Val Thr Lys Leu Thr Ala690 695 700aat gat ata tat gca gaa ttc tgg gct gag ggt gat gaa atg aag aaa2159Asn Asp Ile Tyr Ala Glu Phe Trp Ala Glu Gly Asp Glu Met Lys Lys705 710 715ttg gga ata cag cct att cct atg atg gac aga gac aag aag gat gaa2207Leu Gly Ile Gln Pro Ile Pro Met Met Asp Arg Asp Lys Lys Asp Glu720 725 730 735gtc ccc caa ggc cag ctt ggg ttc tac aat gcc gtg gcc att ccc tgc2255Val Pro Gln Gly Gln Leu Gly Phe Tyr Asn Ala Val Ala Ile Pro Cys740 745 750tat aca acc ctt acc cag atc ctc cct ccc acg gag cct ctt ctg aaa2303Tyr Thr Thr Ieu Thr Gln Ile Leu Pro Pro Thr Glu Pro Leu Leu Lys755 760 765
gca tgc agg gat aat ctc agt cag tgg gag aag gtg att cga ggg gag 2351Ala Cys Arg Asp Asn Leu Ser Gln Trp Glu Lys Val Ile Arg Gly Glu770 775 780gag act gca acc tgg att tca tcc cca tcc gtg gct cag aag gca gct 2399Glu Thr Ala Thr Trp Ile Ser Ser Pro Ser Va1 Ala Gln Lys Ala Ala785 790 795gca tct gaa gat tgagcactgg tcaccctgac acgctgtccc acctacagat 2451Ala Ser Glu Asp800cctcatcttg cttctttgac attcttttcc tttttttggg gggggtgggg ggaacctgca 2511cctggtaact ggggtgcaaa cctcttcaag aaggtaacat caaataaata agtcaagcag 2571aggacttcct gccaatctct tctgtgaggc atcatagaca ctgagcaacc aggaccaccc 2631ccacgttcag aaatcagctg gccaagtgac tccatttgac ttgcaaacca gccttttcta 2691ataggctaat attgctgagg ccttaaagga aatggacaaa aattatccag aaggggtact 2751tttccattgt atctttctaa taagggttta aaatggtact attatggtat tgtacttggg 2811ctttaacatc aatgttgctt tgatgttgtt ggatataaat aggaattttt acacattact 2871attgtgaatg gtgaatgttc atgtatgacc tacttgtaat taacttgagt tgtagtccac 2931agcctcagga caaatgtcgt tgaggttaca gagtaagaaa tgatggcaaa acgtcaaact 2991cttatttcag agcttcatga atttagttag actaaacata attctttaag ttcaacctaa 3051agggctgaga tcaataaatt taacactaga cgaagtagac ttcctgtctt tttgagaaga 3111gatgaggtat atgttacaat aaatctcaga acttcaagta gcagttcaaa agatgtcagt 3171ttttaaaatt gtttttgttg ttgtcttggc agttttactg aaccctttgc ataaagaaca 3231aaataaaagc tcggcattgt aattttttta atggacaagt cttatggata cgaagggtac 3291atttttcata atgattcctt tatattttca ctttgtgtca ttgcagaatt ttagactctc 3351attcacaatg aaaagtttat tttaaacatt gtttaattaa aataccatac agttctcttt 3411taaacatcaa accataaaaa gtgtattttg taattttact ctgacctgcc gcagtcacct 3471ctcacttatc tcttccacgt actgcacggt cgtatttcat gagctttctg tccatagcac 3531agaaacagag cagaaagtag tacaatcatg ttggaccttc tttctgttct ctttactctt 3591ctcacagatc agatcactcc atagaagcct gtgggtttcg atggtttctt ctatacacct 3651ttttggttga ccagtattac tatacaatgt aagtgtttta aaaaatacga aagtaatact 3711
ctgcacccct tcctacaaag atgataaagc agtcacttct ggcgcatttt aataatttaa 3771agatttttag tgcaatggca cggtaacctc caaacctgaa ttagacagag actcactcag 3831gaagtgacag gcccatcata tcaaataact tattcacttt tcatgtggca ggaaactgga 3891atatcgcttt taataaaatg gaaaaatatg cttctacata tttaccacca taggcgtttt 3951gttcatatga gcctggtttg tgcaaaatta aatcagaggc ttctacaaca tggtttattt 4011atgttgtagc aaagttggct ctacataaac attgttctta ttttaaaatt aacactatgt 4071gttcagtttt cttgtgggct tctgaaagtt gccatcttcc ctccgtggag ctccatttgc 4131tattttcatt atacactatg aggtaaaatg taataacaaa agagagagaa gtaccactgt 4191ggctagatat atacacacac atatatatat ggatggatgt aatatatgta gaacacacac 4251atagatgtat ataggataca cactcatgta tgtaaacgta tacatatgtg tatatatgat 4311acatacacat acacacacac gagagacaga aggaaagaga ggaagagaga agcaaacatg 4371taggaaaaaa tataaatc 4389<210>4<211>803<212>蛋白质<213>人<400>4Phe Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ser Asp Met Glu1 5 10 15Asp Gly Pro Ser Asn Asn Ala Ser Cys Phe Arg Arg Leu Thr Glu Cys20 25 30Phe Leu Ser Pro Ser Leu Thr Asp Glu Lys Val Lys Ala Tyr Leu Ser35 40 45Leu His Pro Gln Val Leu Asp Glu Phe Val Ser Glu Ser Val Ser Ala50 55 60Glu Thr Val Glu Lys Trp Leu Lys Arg Lys Asn Asn Lys Ser Glu Asp65 70 75 80Glu Ser Ala Pro Lys Glu Val Ser Arg Tyr Gln Asp Thr Asn Met Gln85 90 95Gly Val Val Tyr Glu Leu Asn Ser Tyr Ile Glu Gln Arg Leu Asp Thr100 105 110
Gly Gly Asp Asn Gln Leu Leu Leu Tyr Glu Leu Ser Ser Ile Ile Lys115 120 125Ile Ala Thr Lys Ala Asp Gly Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Gly Glu Cys130 135 140Asn Asn Ser Leu Cys Ile Phe Thr Pro Pro Gly Ile Lys Glu Gly Lys145 150 155 160Pro Arg Leu Ile Pro Ala Gly Pro Ile Thr Gln Gly Thr Thr Val Ser165 170 175Ala Tyr Val Ala Lys Ser Arg Lys Thr Leu Leu Val Glu Asp Ile Leu180 185 190Gly Asp Glu Arg Phe Pro Arg Gly Thr Gly Leu Glu Ser Gly Thr Arg195 200 205Ile Gln Ser Val Leu Cys Leu Pro Ile Val Thr Ala Ile Gly Asp Leu210 215 220Ile Gly Ile Leu Glu Leu Tyr Arg His Trp Gly Lys Glu Ala Phe Cys225 230 235 240Leu Ser His Gln Glu Val Ala Thr Ala Asn Leu Ala Trp Ala Ser Val245 250 255Ala Ile His Gln Val Gln Val Cys Arg Gly Leu Ala Lys Gln Thr Glu260 265 270Leu Asn Asp Phe Leu Leu Asp Val Ser Lys Thr Tyr Phe Asp Asn Ile275 280 285Val Ala Ile Asp Ser Leu Leu Glu His Ile Met Ile Tyr Ala Lys Asn290 295 300Leu Val Asn Ala Asp Arg Cys Ala Leu Phe Gln Val Asp His Lys Asn305 310 315 320Lys Glu Leu Tyr Ser Asp Pro Phe Asp Ile Gly Glu Glu Lys Glu Gly325 330 335Lys Pro Val Phe Lys Lys Thr Lys Glu Ile Arg Phe Ser Ile Glu Lys340 345 350Gly Ile Ala Gly Gln Val Ala Arg Thr Gly Glu Val Leu Asn Ile Pro355 360 365Asp Ala Tyr Ala Asp Pro Arg Phe Asn Arg Glu Val Asp Leu Tyr Thr370 375 380Gly Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Cys Met Pro Ile Val Ser Arg Gly385 390 395 400
Ser Val Ile Gly Val Val Gln Met Val Asn Lys Ile Ser Gly Ser Ala405 410 415P1he Ser Lys Thr Asp Glu Asn Asn Phe Lys Met Phe Ala Val Phe Cys420 425 430Ala Leu Ala Leu His Cys Ala Asn Met Tyr His Arg Ile Arg His Ser435 440 445Glu Cys Ile Tyr Arg Val Thr Met Glu Lys Leu Ser Tyr His Ser Ile450 455 460Cys Thr Ser Glu Glu Trp Gln Gly Leu Met Gln Phe Thr Leu Pro Val465 470 475 480Arg Leu Cys Lys Glu Ile Glu Leu Phe His Phe Asp Ile Gly Pro Phe485 490 495Glu Asn Met Trp Pro Gly Ile Phe Val Tyr Met Val His Arg Ser Cys500 505 510Gly Thr Ser Cys Phe Glu Leu Glu Lys Leu Cys Arg Phe Ile Met Ser515 520 525Val Lys Lys Asn Tyr Arg Arg Val Pro Tyr His Asn Trp Lys His Ala530 535 540Val Thr Val Ala His Cys Met Tyr Ala Ile Leu Gln Asn Asn His Thr545 550 555 560Leu Phe Thr Asp Leu Glu Arg Lys Gly Leu Leu Ile Ala Cys Leu Cys565 570 575His Asp Leu Asp His Arg Gly Phe Ser Asn Ser Tyr Leu Gln Lys Phe580 585 590Asp His Pro Leu Ala Ala Leu Tyr Ser Thr Ser Thr Met Glu Gln His595 600 605His Phe Ser Gln Thr Val Ser Ile Leu Gln Leu Glu Gly His Asn Ile610 615 620Phe Ser Thr Leu Ser Ser Ser Glu Tyr Glu Gln Val Leu Glu Ile Ile625 630 635 640Arg Lys Ala Ile Ile Ala Thr Asp Leu Ala Leu Tyr Phe Gly Asn Arg645 650 655Lys Gln Leu Glu Glu Met Tyr Gln Thr Gly Ser Leu Asn Leu Asn Asn660 665 670Gln Ser His Arg Asp Arg Val Ile Gly Leu Met Met Thr Ala Cys Asp675 680 685
Leu Cys Ser Val Thr Lys Leu Trp Pro Val Thr Lys Leu Thr Ala Asn690 695 700Asp Ile Tyr Ala Glu Phe Trp Ala Glu Gly Asp Glu Met Lys Lys Leu705 710 715 720Gly Ile Gln Pro Ile Pro Met Met Asp Arg Asp Lys Lys Asp Glu Val725 730 735Pro Gln Gly Gln Leu Gly Phe Tyr Asn Ala Val Ala Ile Pro Cys Tyr740 745 750Thr Thr Leu Thr Gln Ile Leu Pro Pro Thr Glu Pro Leu Leu Lys Ala755 760 765Cys Arg Asp Asn Leu Ser Gln Trp Glu Lys Val Ile Arg Gly Glu Glu770 775 780Thr Ala Thr Trp Ile Ser Ser Pro Ser Val Ala Gln Lys Ala Ala Ala785 790 795 800Ser G1u Asp<210>5<211>3195<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(67) .. (2403)<400>5catccacaga gatgttacag ttgaagagat gggggtagag aagactttga aggaaaagaa 60tgtaga atg agg ata gaa gag agg aaa tcc caa cat tta aca ggt ttg108Met Arg Ile Glu Glu Arg Lys Ser Gln His Leu Thr Gly Leu1 5 10aca gat gaa aaa gtg aag gca tat ctt tct ctt cac ccc cag gta tta 156Thr Asp Glu Lys Val Lys Ala Tyr Leu Ser Leu His Pro Gln Val Leu15 20 25 30gat gaa ttt gta tct gaa agt gtt agt gca gag aca gta gag aaa tgg 204Asp Glu Phe Val Ser Glu Ser Val Ser Ala Glu Thr Val Glu Lys Trp35 40 45ctg aag agg aag aac aac aaa tca gaa gat gaa tcg gct cct aag gaa 252Leu Lys Arg Lys Asn Asn Lys Ser Glu Asp Glu Ser Ala Pro Lys Glu50 55 60
gtc agc agg tac caa gat acg aat atg cag gga gtt gta tat gaa cta300Val Ser Arg Tyr Gln Asp Thr Asn Met Gln Gly Val Val Tyr Glu Leu65 70 75aac agc tat ata gaa caa cgg ttg gac aca gga gga gac aac cag cta348Asn Ser Tyr Ile Glu Gln Arg Leu Asp Thr Gly Gly Asp Asn Gln Leu80 85 90ctc ctc tat gaa ctg agc agc atc att aaa ata gcc aca aaa gcc gat396Leu Leu Tyr Glu Leu Ser Ser Ile Ile Lys Ile Ala Thr Lys Ala Asp95 100 105 110gga ttt gca ctg tat ttc ctt gga gag tgc aat aat agc ctg tgt ata444Gly Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Gly Glu Cys Asn Asn Ser Leu Cys Ile115 120 125ttc acg cca cct ggg ata aag gaa gga aaa ccc cgc ctc atc cct gct492Phe Thr Pro Pro Gly Ile Lys Glu Gly Lys Pro Arg Leu Ile Pro Ala130 135 140ggg ccc atc act cag ggc acc acc gtc tct gct tat gtg gcc aag tcc540Gly Pro Ile Thr Gln Gly Thr Thr Val Ser Ala Tyr Val Ala Lys Ser145 150 155agg aaa aca ctg cta gta gaa gac atc ctt gga gat gaa cga ttt cca588Arg Lys Thr Leu Leu Val Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Arg Phe Pro160 165 170aga ggt act gga ctg gaa tca ggg act cgt atc cag tct gtt ctt tgc636Arg Gly Thr Gly Leu Glu Ser Gly Thr Arg Ile Gln Ser Val Leu Cys175 180 185 190tta cca att gtc act gca att ggt gac ttg att ggt att ctc gag ctg684Leu Pro Ile Val Thr Ala Ile Gly Asp Leu Ile Gly Ile Leu Glu Leu195 200 205tat cgg cac tgg ggc aaa gaa gcc ttc tgt ctt agt cac cag gag gtt732Tyr Arg His Trp Gly Lys Glu Ala Phe Cys Leu Ser His Gln Glu Val210 215 220gca aca gca aat ctt gcc tgg gct tca gta gca ata cat cag gtg cag780Ala Thr Ala Asn Leu Ala Trp Ala Ser Val Ala Ile His Gln Val Gln225 230 235gta tgc aga ggc ctt gcc aaa cag aca gaa ttg aat gac ttc cta ctc828Val Cys Arg Gly Leu Ala Lys Gln Thr Glu Leu Asn Asp Phe Leu Leu240 245 250gac gta tca aaa aca tat ttt gat aac ata gtt gca ata gat tct cta876Asp Val Ser Lys Thr Tyr Phe Asp Asn Ile Val Ala Ile Asp Ser Leu255 260 265 270
ctt gaa cac ata atg ata tat gca aaa aac ctg gtg aat gcc gat cgt924Leu Glu His Ile Met Ile Tyr Ala Lys Asn Leu Val Asn Ala Asp Arg275 280 285tgt gca ctt ttc cag gtg gac cat aag aac aag gag tta tat tca gac972Cys Ala Leu Phe Gln Val Asp His Lys Asn Lys Glu Leu Tyr Ser Asp290 295 300ctt ttt gat att gga gag gaa aag gaa gga aaa cct gtc ttc aag aag1020Leu Phe Asp Ile Gly Glu Glu Lys Glu Gly Lys Pro Val Phe Lys Lys305 310 315acc aaa gag ata aga ttt tca att gag aaa gga att gct ggc caa gta1068Thr Lys Glu Ile Arg Phe Ser Ile Glu Lys Gly Ile Ala Gly Gln Val320 325 330gca aga aca ggg gaa gtc ctg aac att cca gat gcc tat gca gac cca1116Ala Arg Thr Gly Glu Val Leu Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Ala Asp Pro335 340 345 350cgc ttt aac aga gaa gta gac ttg tac aca ggc tac acc acg cgg aac1164Arg Phe Asn Arg Glu Val Asp Leu Tyr Thr Gly Tyr Thr Thr Arg Asn355 360 365atc ctg tgc atg ccc atc gtc agc cga ggc agc gtg ata ggt gtg gtg1212Ile Leu Cys Met Pro Ile Val Ser Arg Gly Ser Val Ile Gly Val Val370 375 380cag atg gtc aac aaa atc agt ggc agt gcc ttc tct aaa aca gat gaa1260Gln Met Val Asn Lys Ile Ser Gly Ser Ala Phe Ser Lys Thr Asp Glu385 390 395aac aac ttc aaa atg ttt gccgtc ttt tgt gct tta gcc tta cac tgt 1308Asn Asn Phe Lys Met Phe Ala Val Phe Cys Ala Leu Ala Leu His Cys400 405 410gct aat atg tat cat aga att cgc cac tca gag tgc att tac cgg gta1356Ala Asn Met Tyr His Arg Ile Arg His Ser Glu Cys Ile Tyr Arg Val415 420 425430acg atg gaa aag ctg tcc tac cat agc att tgt act tca gaa gag tgg1404Thr Met Glu Lys Leu Ser Tyr His Ser Ile Cys Thr Ser Glu Glu Trp435 440 445caa ggt ctc atg caa ttc acc ctt ccc gtg cgt ctc tgc aaa gaa att1452Gln Gly Leu Met Gln Phe Thr Leu Pro Val Arg Leu Cys Lys Glu Ile450 455 460gaa tta ttc cac ttt gac att ggt cct ttt gaa aac atg tgg cct gga1500Glu Leu Phe His Phe Asp Ile Gly Pro Phe Glu Asn Met Trp Pro Gly465 470 475
att ttt gtc tac atg gtt cat cgg tcc tgt ggg aca tcc tgc ttt gag1548Ile Phe Val Tyr Met Val His Arg Ser Cys Gly Thr Ser Cys Phe Glu480 485 490ctt gaa aag ttg tgt cgt ttt att atg tct gtg aag aag aac tat cgg1596Leu Glu Lys Leu Cys Arg Phe Ile Met Ser Val Lys Lys Asn Tyr Arg495 500 505 510cgg gtt cct tat cac aac tgg aag cat gcg gtc act gta gca cac tgc1644Arg Val Pro Tyr His Asn Trp Lys His Ala Val Thr Val Ala His Cys515 520 525atg tat gcc ata ctt cag aac aat cac acg ctt ttc aca gac ctt gag1692Met Tyr Ala Ile Leu Gln Asn Asn His Thr Leu Phe Thr Asp Leu Glu530 535 540cgc aaa gga ctg ctg att gcg tgt ctg tgt cat gac ctg gac cac agg1740Arg Lys Gly Leu Leu Ile Ala Cys Leu Cys His Asp Leu Asp His Arg545 550 555ggc ttc agt aac agc tac ctg cag aag ttc gac cac cct ctg gcc gct1788Gly Phe Ser Asn Ser Tyr Leu Gln Lys Phe Asp His Pro Leu Ala Ala560 565 570ctc tac tcc act tcc acc atg gag cag cac cac ttc tcc cag act gtg1836Leu Tyr Ser Thr Ser Thr Met Glu Gln His His Phe Ser Gln Thr Val575 580 585 590tcc atc ctc cag ttg gaa ggg cac aat atc ttc tcc act ctg agc tcc1884Ser Ile Leu Gln Leu Glu Gly His Asn Ile Phe Ser Thr Leu Ser Ser595 600 605agt gaa tat gag cag gtg ctt gag atc atc cgc aaa gcc atc att gcc1932Ser Glu Tyr Glu Gln Val Leu Glu Ile Ile Arg Lys Ala Ile Ile Ala610 615 620aca gac ctt gct tta tac ttt gga aac agg aag cag ttg gaa gag atg1980Thr Asp Leu Ala Leu Tyr Phe Gly Asn Arg Lys Gln Leu Glu Glu Met625 630 635tac cag acc gga tca cta aac ctt aat aat caa tca cat aga gac cgt2028Tyr Gln Thr Gly Ser Leu Asn Leu Asn Asn Gln Ser His Arg Asp Arg640 645 650gta att ggt ttg atg atg act gcc tgt gac ctt tgt tct gtg aca aaa2076Val Ile Gly Leu Met Met Thr Ala Cys Asp Leu Cys Ser Val Thr Lys655 660 665 670ctg tgg ccc gtt aca aaa ttg acg gca aat gat ata tat gca gaa ttc2124Leu Trp Pro Val Thr Lys Leu Thr Ala Asn Asp Ile Tyr Ala Glu Phe675 680 685
tgg gct gag ggt gat gaa atg aag aaa ttg gga ata cag cct att cct2172Trp Ala Glu Gly Asp Glu Met Lys Lys Leu Gly Ile Gln Pro Ile Pro690 695 700atg atg gac aga gac aag aag gat gaa gtc ccc caa ggc cag ctt ggg2220Met Met Asp Arg Asp Lys Lys Asp Glu Val Pro Gln Gly Gln Leu Gly705 710 715ttc tac aat gcc gtg gcc att ccc tgc tat aca acc ctt acc cag atc2268Phe Tyr Asn Ala Val Ala Ile Pro Cys Tyr Thr Thr Leu Thr Gln Ile720 725 730ctc cct ccc acg gag cct ctt ctg aaa gca tgc agg gat aat ctc agt2316Leu Pro Pro Thr Glu Pro Leu Leu Lys Ala Cys Arg Asp Asn Leu Ser735 740 745 750cag tgg gag aag gtg att cga ggg gag gag act gca acc tgg att tca2364Gln Trp Glu Lys Val Ile Arg Gly Glu Glu Thr Ala Thr Trp Ile Ser755 760 765tcc cca tcc gtg gct cag aag gca gct gca tct gaa gat tgagcactgg 2413Ser Pro Ser Val Ala Gln Lys Ala Ala Ala Ser Glu Asp770 775tcaccctgac acgctgtccc acctacagat cctcatcttg cttctttgac attcttttcc 2473tttttttggg gggggtgggg ggaaccgtca cctggtaact ggggtgcaaa cctcttcaag 2533aaggtaacat caaataaata agtcaagcag aggacttcct ggaattccaa tcccaacact 2593ttgggaggct gaggtgggtg gatcacctga ggtctagagt tcgagactgg actgggcaag 2653atggtgaaac tctgtctcta ctaaaaatac aaaaatacaa aattagctgg gtgtggtggt 2713tgcatgcctg tagttcggga ggctgaggta ggagaatcac ttgaacctgg ggggtggagg 2773ctgaagtgag ccaaggtcgt gtcagtgcac tccagcctag acaacagaac aagactctgt 2833ctcaaaaaaa aaaaaaagta tatcctacaa atgctaatta attttttccc actagctaat 2893tggtttatga ataagaaaga tgttaaaaaa tgatgacaaa tgcagtcggt tacagtggct 2953catgcctgtg atcccagcac tttgggaggc cgaggcgggt ggatcatgag gtcaagagat 3013cgagaccatc ctggccaaca tggtgaaacc ccgtctctac tgaaaaaaaa aaaaaattag 3073ctgggcgtgg tgtgcatagt ggtgtaattc cagctactct ggaggctgag gcaggagaat 3133cgcttgaacc caggaggcag aggttgcagt gagccaggat ggtggaattc ctgcagcccg 3193gg3195<210>6
<211>779<212>蛋白质<213>人<400>6Met Arg Ile Glu Glu Arg Lys Ser Gln His Leu Thr Gly Leu Thr Aspl 5 10 15Glu Lys Val Lys Ala Tyr Leu Ser Leu His Pro Gln Val Leu Asp Glu20 25 30Phe Val Ser Glu Ser Val Ser Ala Glu Thr Val Glu Lys Trp Leu Lys35 40 45Arg Lys Asn Asn Lys Ser Glu Asp Glu Ser Ala Pro Lys Glu Val Ser50 55 60Arg Tyr Gln Asp Thr Asn Met Gln Gly Val Val Tyr Glu Leu Asn Ser65 70 75 80Tyr Ile Glu Gln Arg Leu Asp Thr Gly Gly Asp Asn Gln Leu Leu Leu85 90 95Tyr Glu Leu Ser Ser Ile Ile Lys Ile Ala Thr Lys Ala Asp Gly Phe100 105 110Ala Leu Tyr Phe Leu Gly Glu Cys Asn Asn Ser Leu Cys Ile Phe Thr115 120 125Pro Pro Gly Ile Lys Glu Gly Lys Pro Arg Leu Ile Pro Ala Gly Pro130 135 140Ile Thr Gln Gly Thr Thr Val Ser Ala Tyr Val Ala Lys Ser Arg Lys145 150 155 160Thr Leu Leu Val Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Arg Phe Pro Arg Gly165 170 175Thr Gly Leu Glu Ser Gly Thr Arg Ile Gln Ser Val Leu Cys Leu Pro180 185 190Ile Val Thr Ala Ile Gly Asp Leu Ile Gly Ile Leu Glu Leu Tyr Arg195 200 205His Trp Gly Lys Glu Ala Phe Cys Leu Ser His Gln Glu Val Ala Thr210 215 220Ala Asn Leu Ala Trp Ala Ser Val Ala Ile His Gln Val Gln Val Cys225 230 235 240Arg Gly Leu Ala Lys Gln Thr Glu Leu Asn Asp Phe Leu Leu Asp Val245 250 255
Ser Lys Thr Tyr Phe Asp Asn Ile Val Ala Ile Asp Ser Leu Leu Glu260 265 270His Ile Met Ile Tyr Ala Lys Asn Leu Val Asn Ala Asp Arg Cys Ala275 280 285Leu Phe Gln Val Asp His Lys Asn Lys Glu Leu Tyr Ser Asp Leu Phe290 295 300Asp Ile Gly Glu Glu Lys Glu G1y Lys Pro Val Phe Lys Lys Thr Lys305 310 315 320Glu Ile Arg Phe Ser Ile Glu Lys Gly Ile Ala Gly Gln Val Ala Arg325 330 335Thr Gly Glu Val Leu Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Ala Asp Pro Arb Phe340 345 350Asn Arg Glu Val Asp Leu Tyr Thr Gly Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu355 360 365Cys Met Pro Ile Val Ser Arg Gly Ser Val Ile Gly Val Val Gln Met370 375 380Val Asn Lys Ile Ser Gly Ser Ala Phe Ser Lys Thr Asp Glu Asn Asn38 390 395 400Phe Lys Met Phe Ala Val Phe Cys Ala Leu Ala Leu His Cys Ala Asn405 410 415Met Tyr His Arg Ile Arg His Ser Glu Cys Ile Tyr Arg Val Thr Met420 425 430Glu Lys Leu Ser Tyr His Ser Ile Cys Thr Ser Glu Glu Trp Gln Gly435 440 445Leu Met Gln Phe Thr Leu Pro Val Arg Leu Cys Lys Glu Ile Glu Leu450 455 460Phe His Phe Asp Ile Gly Pro Phe Glu Asn Met Trp Pro Gly Ile Phe465 470 475 480Val Tyr Met Val His Arg Ser Cys Gly Thr Ser Cys Phe Glu Leu Glu485 490 495Lys Leu Cys Arg Phe Ile Met Ser Val Lys Lys Asn Tyr Arg Arg Val500 505 510Pro Tyr His Asn Trp Lys His Ala Val Thr Val Ala His Cys Met Tyr515 520 525Ala Ile Leu Gln Asn Asn His Thr Leu Phe Thr Asp Leu Glu Arg Lys530 535 540
Gly Leu Leu Ile Ala Cys Leu Cys His Asp Leu Asp His Arg Gly Phe545 550 555 560Ser Asn Ser Tyr Leu Gln Lys Phe Asp His Pro Leu Ala Ala Leu Tyr565 570 575Ser Thr Ser Thr Met Glu Gln His His Phe Ser Gln Thr Val Ser Ile580 585 590Leu Gln Leu Glu Gly His Asn Ile Phe Ser Thr Leu Ser Ser Ser Glu595 600 605Tyr Glu Gln Val Leu Glu Ile Ile Arg Lys Ala Ile Ile Ala Thr Asp610 615 620Leu Ala Leu Tyr Phe Gly Asn Arg Lys Gln Leu Glu Glu Met Tyr Gln625 630 635 640Thr Gly Ser Leu Asn Leu Asn Asn Gln Ser His Arg Asp Arg Val Ile645 650 655Gly Leu Met Met Thr Ala Cys Asp Leu Cys Ser Val Thr Lys Leu Trp660 665 670Pro Val Thr Lys Leu Thr Ala Asn Asp Ile Tyr Ala Glu Phe Trp Ala675 680 685Glu Gly Asp Glu Met Lys Lys Leu Gly Ile Gln Pro Ile Pro Met Met690 695 700Asp Arg Asp Lys Lys Asp Glu Val Pro Gln Gly Gln Leu Gly Phe Tyr705 710 715 720Asn Ala Val Ala Ile Pro Cys Tyr Thr Thr Leu Thr Gln Ile Leu Pro725 730 735Pro Thr Glu Pro Leu Leu Lys Ala Cys Arg Asp Asn Leu Ser Gln Trp740 745 750Glu Lys Val Ile Arg Gly Glu Glu Thr Ala Thr Trp Ile Ser Ser Pro755 760 765Ser Val Ala Gln Lys Ala Ala Ala Ser Glu Asp770 775<210>7<211>458<212>DNA<213>人<400>7attcggcacg ggctgcggcc agagggtggt cgaacttctg caggtaactg ttactgagcc 60
cctgtggtcc aggtcatgac acagacacgc aatcagcagt cctttgcgct caaggtctgt 120gaaaagcgtg tgattgttct gaagtatggc atacatgcag tgtgctacag tgaccgcatg 180cttccagttg tgataaggaa cccgccgata gttcttcttc acagacataa taaaacgaca 240caacttttca agctcaaagc aggatgtccc acaggcccga tgaaccatgt agacaaaaat 300tccaggccac atgttttcaa aaggaccaat gtcaaagtgg aataattcaa tttctttggc 360agagacgcac cgggaaaggg tgaatttgca tgagaccttt ggccactctt ctgaaagtac 420aaatgctatg gtaggacagc tttttccgtc ggttaccc 458<210>8<211>21<212>蛋白质<213>人<400>8His Asp Xaa Xaa His Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Ala20<210>
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9ggaaacagct atgaccatg 19<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10actct ccaag gaatacag 18<210>11<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>11ctgtctctgc actaacac 18<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>12ttggcaaggc ctctgcat 18<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>13cctctatgaa ctgagcag 18<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>14gaaggcactg ccactgat 18<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物
<400>15tcgagctgta tcggcact 18<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>16agcgtgtgat tgttctgaa19<210>17<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>17tgctggccaa gtagcaag 18<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>18aaggtcacag gcagtcat 18<210>19<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>19gaagagtggc aaggtctc 18<210>20<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>20tcatgacctg gaccaccag 19<210>21<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>21ccttcttgaa gaggtttgc 19<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>22atgactgcct gtgacctt 18<210>23<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>23ctgctataca acccttacc 19<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物
<400>24gctaatattg ctgaggcc 18<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>25taagtgagag gtgactgc 18<210>26<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>26cctaaagggc tgagatca 18<210>27<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>27cgcagtcacc tctcactt 18<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>28tgtaaaacga cggccagt 18<210>29<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>29acaaaacgcc tatggtgg 18<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>30ttgatctcag ccctttagc 19<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>31tcatgtggca ggaaactg 18<210>32<211>484<212>DNA<213>人<400>32gcacgagacc agtattacta tacaatgtaa gtgttttaaa aaatacgaaa gtaatactct 60gcaccccttc ctacaaagat gataaagcag tcacttctgg cgcattttaa taatttaaag 120atttttagtg caatggcacg gtaacctcca aacctgaatt agacagagac tcactcagga 180agtgacaggc ccatcatatc aaataactta ttcacttttc atgtggcagg aaactggaat 240atcgctttta ataaaatgga aaaatatgct tctacatatt taccaccata ggcgttttgt 300tcatatgagc ctggtttgtg caaaattaaa tcagaggctt ctacacatgg tttatttatg 360ttgtagcaaa gttggctcta cataaacatt gttcttattt taaaattaac actatgtgtt 420
cgtttttctt gtgggcttct gaaagttgcc atcttccctc cgtggagctc catttgctat 480tttc 484<210>33<211>404<212>DNA<213>人<400>33cttgaacaca tcatgatata tgcaaaaaat ctagtgaacg ccgaccgctg cgcgctcttc 60caggtggacc acaagaacaa ggagctgtac tcggacctgt ttgacattgg ggaggagaag 120gaggggaagc ccgttttcaa gaagaccaag gagatcagat tttccattga gaaagggatt 180gctggtcaag tggcaagaac gggagaagtc ctgaacattc ctgatgccta cgcagacccg 240cgctttaaca gggaggtgga cctgtacaca ggctatacca cgcggaacat tctgtgtatg 300cccatagtga gccgcggcat ttgattcggt gtggtgcaaa tggtttaaca agatcagcgg 360caggcctttc caagacggat gagaacaact tcaagatgtt ttgc 404<210>34<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>34Asp Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>35<211>62<212>DNA<213>人<400>35cagtcagcta gccgccatgg actacaagga cgacgatgac caagttgact gatgaaaagg 60tg62<210>36<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>36ccagaagggg tacttttcc19<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>37cattgtcctg aggctgtgg19<210>38<211>477<212>DNA<213>人<400>38tatcccaaaa gccgacggat ttgcactgta cttccttgga gagtgcaata atagcctgtg 60tgtgttcata ccacccggga tgaaggaagg ccaaccccgg ctcatccctg cggggcccat 120cacccagggt accaccatct ctgcctacgt ggccaagtct aggaagacgt tgttggtaga 180ggatatcctt ggggatgagc gatttcctcg aggtactggc ctggaatcag gaacccgcat 240ccagtctgtt ctttgcttgc ccattgtcac tgccattgga gacttgattg gcatccttga 300actgtacagg cactgggaca aagaggcctt ctgcctcagc catcaggagg ttgcaacagc 360caatcttgct tgggcttccg tagcaataca ccaggtgcag gtgtgtagag gtctcgccaa 420acagaccgaa ctgaatgact tcctactcga cgtatcaaag acatactttg ataacat477<210>39<211>755<212>DNA<213>人<400>39gaattccttt tgtatttatt tcttctctaa cttactttat ctttttaaat ggaataactc 60
tgatagaatt acagtgttaa tatttgtcta ctttatattt cacactctag aatatattaa 120atgcttagtc ttttgccgta agatagaaaa agctggttta aaatgagatc cacaagagac 180cttaccttct gatttgttgt tcttcctctt cagccatttc tctactgtct ctgcactaac 240actttcagat acaaattcat ctaatacctg ggggtgaaga gaaagatatg ccttcacttt 300ttcatctgtc aaacctgtaa aagaattgaa aagaataaaa ttcacctata caacatcctc 360atatcaatga aaggtatagt atcacaacac attatgctaa gacccagcaa cctctcatct 420aacggagaga gggctggaaa gagcgggaag gggaagctac tgcttagtgg gtacagagtt 480tctactggga gtgacagcaa agttttggaa ctagacaggt gaatactgcc caacattggg 540aatatacgta atgccactaa attgtacgct taaaacagca tttaaaatgg taaaaaacac 600catttttcat atatacgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt atgaccacaa taaaaaagaa 660tgcagttagt ttagcaattt taaactacat atattacatc atgttacata gctgtttcta 720gcaataaatt tcagagttac atatgaacca atgcc755<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>40gttagatgag aggttgctgg 20<210>41<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>41gtatgctaat ctcag 15<210>42<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物
<400>42caactcgaat tccttgacag attagcatac 30<210>43<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>43caactcgaat tccttgac 18<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>44gttgttcttc ctcttcagcc 20<210>45<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>45caactcgaat tccttgacaga21<210>46<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>46gatcgtcgac ctgtctctgc actaacac28<210>47<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物
<400>47gatcgtcgac aagcactcgg tcagccttcg 30<210>48<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>48gatcggatcc accatggact acaagg 2权利要求
1.编码PDE8多肽片段或类似物的多核苷酸，其中所述多核苷酸在适度严格条件下与SEQ ID NO1中所示的多核苷酸序列的互补序列杂交，所述适度严格条件包括在65℃下在2×SSC和0.1％ SDS的终洗涤；其中所述PDE8多肽片段或类似物保留PDE8生物活性。2.编码PDE8多肽片段或类似物的多核苷酸，其中所述多核苷酸在适度严格条件下与SEQ ID NO3中所示的多核苷酸序列的互补序列杂交，所述适度严格条件包括在65℃下在2×SSC和0.1％ SDS的终洗涤；其中所述PDE8多肽片段或类似物保留PDE8生物活性。
3.编码PDE8多肽片段或类似物的多核苷酸，其中所述多核苷酸在适度严格条件下与SEQ ID NO5中所示的多核苷酸序列的互补序列杂交，所述适度严格条件包括在65℃下在2×SSC和0.1％ SDS的终洗涤；其中所述PDE8多肽片段或类似物保留PDE8生物活性。
4.由权利要求1-3中任一项的多核苷酸编码的多肽。
5.权利要求1-3中任一项的多核苷酸，它是DNA分子。
6.权利要求5的多核苷酸，其中DNA是全部或部分化学合成的DNA分子。
7.一种特异地与权利要求1-3中任一项的多核苷酸杂交的反义多核苷酸。
8.一种包含根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸的表达构建物。
9.一种用根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸或权利要求8的表达构建物转化或转染的宿主细胞。
10.一种制备PDE8多肽片段或类似物的方法，该方法包括步骤在适合PDE8多肽片段或类似物表达的条件下生长根据权利要求9的宿主细胞；和从来自生长培养基的宿主细胞分离PDE8多肽片段或类似物。
11.一种与根据权利要求4的PDE8多肽片段或类似物能特异免疫反应的抗体。
12.根据权利要求11的抗体，它是单克隆抗体。
13.分泌根据权利要求12的抗体的杂交瘤。
14.能与根据权利要求11的抗体特异免疫反应的抗独特型抗体。
15.一种鉴定PDE8多肽片段或类似物的特异结合伙伴化合物的方法，包括步骤在允许化合物和PDE8多肽片段或类似物结合的条件下将权利要求4的PDE8多肽片段或类似物和化合物接触；检测化合物与PDE8多肽片段或类似物的结合；和鉴定作为PDE8多肽片段或类似物的特异结合配偶体的化合物。
16.根据权利要求15的方法，其中在步骤b)中检测PDE8多肽片段或类似物的活性的调节。
17.根据权利要求16的方法，其中在步骤b)中检测PDE8多肽片段或类似物的活性的抑制。
18.根据权利要求16的方法，其中在步骤b)中检测PDE8多肽片段或类似物的活性的增强。
19.一种鉴定编码PDE8多肽片段或类似物的多核苷酸的特异结合伙伴化合物的方法，包括步骤在允许化合物和多核苷酸结合的条件下将权利要求1-3中任一项的多核苷酸和化合物接触；检测化合物与多核苷酸的结合；和鉴定作为多核苷酸的特异结合配偶体的化合物。
20.根据权利要求19的方法，其中在步骤b)中检测多核苷酸编码的PDE8多肽片段或类似物的表达的调节。
21.根据权利要求20的方法，其中在步骤b)中检测多核苷酸编码的PDE8多肽片段或类似物的表达的抑制。
22.根据权利要求20的方法，其中在步骤b)中检测多核苷酸编码的PDE8多肽片段或类似物的表达的增强。
全文摘要
本发明提供了人PDE8多肽，编码该多肽的多核苷酸，包括该多核苷酸的表达构建体，用该表达构建体转化的宿主细胞；产生PDE8多肽的方法；反义多核苷酸；以及特异性与PDE8多肽起免疫反应的抗体。
文档编号C12N15/11GK1800399SQ20051011376
公开日2006年7月12日 申请日期1998年10月16日 优先权日1997年10月16日
发明者K·诺克内 申请人:艾科斯有限公司