argJ基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了argJ基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，确定了谷氨酸棒杆菌中瓜氨酸代谢途径上argJ基因编码的N-鸟氨酸乙酰转移酶活性受到瓜氨酸的抑制，分别在谷氨酸棒杆菌、钝齿棒杆菌和北京棒杆菌中过表达argJ基因，可以提高N-鸟氨酸乙酰转移酶的活性，改进瓜氨酸的生成能力。发酵实验表明，棒杆菌中过表达argJ基因后，与原始菌相比，瓜氨酸产量明显提高，且发酵产物单一，副产物少。
【专利说明】argJ基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用
【背景技术】
[0001] L-瓜氨酸（Citrulline)是一种重要的非蛋白质α -氨基酸，由于是在1914年第 一次从西瓜中提取分离出来，所以命名为瓜氨酸。是参与人体尿素循环（urea cycle)的重 要中间代谢物，对于人类和哺乳类动物解除氨毒有重要作用。L-瓜氨酸还参与一个极为重 要的信使分子一N0的生成，同时在医药方面，瓜氨酸可作为异体排斥效应的指示剂、治疗肝 脏昏迷和应用于诊断类风湿关节炎，在生化方面瓜氨酸也有重要的应用，可以作为一种高 效抗氧化剂，保护DNA和酶免受自由基氧化。
[0002] L-瓜氨酸的生产方法目前主要有化学合成法、提取法、酶法和发酵法。相比化 学法产物不纯、污染环境，提取法得率低、成本高，酶法活性不高、转化率低等问题，微生物 发酵法作为最具优势的氨基酸生产方式被广泛应用，因为发酵法生产瓜氨酸成本低廉， 产品纯度好，安全性高。目前生物法合成瓜氨酸的主要菌种包括 Arthrobacter paraffineus^ E scherichia^ Corynebacteria glutamicum 棒杆菌CbiTfldacieria 在氨基酸发酵产业广泛应用，用于生产多种氨基酸，如 谷氨酸、精氨酸、赖氨酸等。谷氨酸棒杆菌具有生长迅速、易培养、耐受性强、发酵条件成熟 等特点，成为最具潜力的瓜氨酸生产菌种。
[0003] 随着谷氨酸棒杆菌C 腫ATCC 13032全基因组测序的完成及相关氨基 酸代谢途径的基因和关键酶的深入研究(瓜氨酸代谢途径如图1所示)，给通过代谢工程和 基因工程定向改变相关基因提供了大量的信息和技术支持，进而优化代谢途径，提高所需 的目的氨基酸产量。
[0004] 在谷氨酸棒杆菌中，L-瓜氨酸的合成以L-谷氨酸为底物，经5种酶的催化而生 成。微生物中根据乙酰基团参与方式的不同，L-瓜氨酸的代谢途径可以分为两种模式：线 性途径和循环途径。谷氨酸棒杆菌中采用循环途径，即乙酰鸟氨酸在由基因编码 的鸟氨酸乙酰转移酶的作用下形成鸟氨酸的同时，乙酰基团被转移到谷氨酸形成乙 酰谷氨酸，这种乙酰基团的循环利用称为经济循环途径。代谢途径上的相关酶有的会受到 中间产物或终产物的反馈抑制，通过基因工程的手段，可解除这种反馈抑制，进而提高酶活 和产物的生成量。
【发明内容】
[0005] 本发明提供arg/基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，本发明在研究过程中发现， 在代谢过程中，基因表达的鸟氨酸乙酰转移酶受到目的产物瓜氨酸的抑制，因此通 过基因工程手段过表达arg/基因，提高鸟氨酸乙酰转移酶活性，进而降低瓜氨酸对此酶 的抑制作用，从而提高瓜氨酸的合成能力。
[0006] 本发明采用的技术方案为： arg/基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用。
[0007] 所述arg/基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，本发明首次发现瓜氨酸对鸟氨 酸乙酰转移酶活性有抑制作用，30 mM瓜氨酸能够降低谷氨酸棒杆菌鸟氨酸乙酰转移酶 酶活50%。将arg/基因通过基因工程手段导入到微生物中进行过表达，提高Λ/-鸟氨酸乙酰 转移酶活性，从而提高L-瓜氨酸产量。
[0008] 所述基因是来自谷氨酸棒杆菌C ATCC 13032的基因，基 因序列如SEQ. No. 1。
[0009] 所述arg/基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，包括如下步骤： 1) 构建含有arg/基因的重组表达质粒； 2) 将步骤1)构建的质粒电转到微生物中，筛选阳性转化子； 3) 将步骤2)筛选得到的阳性转化子进行发酵生产L-瓜氨酸。所述微生物优选为谷氨 酸棒杆菌、钝齿棒杆菌或者北京棒杆菌中的一种。
[0010] 所述arg/基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，详细操作步骤如下： 1) 构建含有arg/基因的重组表达质粒pXMJ19-ar^/ (叹）： 以谷氨酸棒杆菌DNA为模板，利用PCR方法扩增出arg/基因0V-鸟氨酸乙酰转移酶基 因)，引物为 argJ-cg-￥ ：5, -CGCGGATCCGGACTAGTCCCTAACCAGCAAACACAAC-3?, argJ-cg-R ：5, -CCGGAATTCGCTCTAGATCAGCGAGGACATTTGCG-3?〇
[0011] PCR 反应程序为：98°C预变性 10 min，98 °C 10 s，60 °C 15 s，72 °C 78 s，30 个 循环，72 °C lOmin。
[0012] 得到的arg/基因与三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP)混合，在TaqDNA聚合酶作用 下进行加 A反应，纯化后与pMD18 simple-T相连接，16°C连接12h，热击转化入经氯化钙处 理的万.cWiDH5a感受态细胞中，转化后的细胞涂布到含有氨苄青霉素1〇〇 yg/mL的固 体LB培养基(培养基配方：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，2 %琼脂粉，pH 7.0，121°C灭菌15 min)上。37°C培养8-12h，挑取多个转化子单菌落，提取质粒并测序，将 测序正确的质粒用价〇R I、BamH I双酶切得到鸟氨酸乙酰转移酶基因，与用同样双酶 切的PXMJ19质粒连接，得到含有鸟氨酸乙酰转移酶基因的重组表达质粒pXMJ19-ar^/ (eg) 2) 将重组质粒电击转化入微生物中；具体步骤为： 将重组表达质粒pXMJ19-ar^/(cg)电击到微生物中，菌液涂布在含有氯霉素10μ g/mL 的固体LB培养基上，30°C培养36-48h，挑取阳性克隆。
[0013] 一种L-瓜氨酸高产菌株，是将arg/基因通过基因工程手段导入到谷氨酸棒杆菌 C ATCC13032-Aar冰中得到的基因工程菌。将得到的基因工程菌首先于LB平 板培养基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，2 %琼脂粉，pH 7.0)活化菌种后， 在含有碳源、氮源、无机盐和精氨酸的发酵培养基上培养，温度28?37°C，好氧发酵36飞Oh。
[0014] 所述的发酵培养基组分及含量如下：葡萄糖4(T80g/L，K2HP043H20 0.5?lg/L， ΚΗ2Ρ04 0·5?lg/L，MgS047H20 0.25 g/L，（NH4)2S04 20?40 g/L，MnS04H20 5?20 mg/L，FeS047H20 5?20 mg/L，ZnCl2 lmg/L，CuS04 0.2 mg/L，生物素 5(Tl00yg/L，维生素 B1 5(T200yg/L， 精氨酸l〇(T200 mg/L，溶剂为水，初始pH 5·(Γ7·5。
[0015] 这些工程菌株具有极强的遗传稳定性，培养基成本低廉，发酵过程简单易控。经过 60h的好氧发酵，最终发酵产物单一，副产物少，瓜氨酸产量高。
[0016] 有益效果：本发明首次发现瓜氨酸对鸟氨酸乙酰转移酶活性有抑制作用，通 过基因工程手段在微生物中过表达基因，提高乙酰鸟氨酸转移酶活性，进而降低 L-瓜氨酸对此酶的抑制作用，增强L-瓜氨酸的合成能力。得到的高产瓜氨酸的棒杆菌工程 菌，具有极强的遗传稳定性，培养基成本低廉，发酵过程简单易控。经过60h的好氧发酵，最 终发酵产物单一，副产物少，瓜氨酸产量高。因此这些工程菌株可用于进行瓜氨酸的生产， 市场前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为谷氨酸棒杆菌中瓜氨酸的代谢途径示意图。
[0018] 图2重组质粒pXMJig-arg/ (eg)构建流程图。
[0019] 图 3 arg/基因的扩增图，2-arg/基因片段 Μ - 2000 DNA Marker。
【具体实施方式】
[0020] 菌株及质粒 本实施例所述的棒杆菌是： 谷氨酸棒杆菌C ATCC 13032-Aar^^郝宁实验室保存， 申请人:在此保证 二十年内免费向公众发放该菌株。构建方法参见文献：汤俊，郝宁，许晟，等.谷氨酸棒杆 菌ar冰基因缺失菌株的构建[J].南京工业大学学报：自然科学版，2013, 35 (6):86-90 ; 钝齿棒杆菌编号B6,购自上海工微所科技有限公司 北京棒杆菌编号B3,购自上海工微所科技有限公司 除了上述菌株以外的本发明所涉及的载体或者质粒均可通过商业途径购买得到。
[0021] 实施例1大肠杆菌DH5a感受态的制备与转化 (1) 挑取大肠杆菌DH5a单菌落，接入5 mL LB液体培养基中，37°C、200 r/min振荡培 养 12-14 h ; (2) 按1% (v/v)的接种量转接至50 mL新鲜LB培养基中，培养至0D6(i(i达到0. 4-0. 6 时，收集细胞，4°C、6000 r/min离心5 min,弃上清； (3) 用预冷的0.1 M CaCl2洗漆细胞，4°C，6000 r/min离心5 min,弃上清，保留菌泥； (4) 重复上述步骤（3); (5) 加入100 μ L CaCl2，悬浮菌泥，即为大肠杆菌感受态细胞； (6) 转化时，将5 μ L连接液或者5 μ L质粒加入感受态细胞中，轻轻混匀； (7) 冰浴 20 min ; (8) 42°C热击 90 s ; (9) 冰浴 2 min ; (11) 加入600 μ L LB培养基，放置于37°C培养箱，温育1 h; (12) 涂在相对应抗性的LB平板上，37°C培养12-16 h。进行质粒提取和酶切验证。
[0022] 实施例2重组表达质粒pXMJ19-ar^/ (叹）的构建 以谷氨酸棒杆菌C 腫ATCC13032基因组为模板，根据GenBank中C ATCC 13032的基因组序列信息设计引物（引物均由南京金斯瑞生物有限公司 合成） argJ-cg-￥ ：5, -CGCGGATCCGGACTAGTCCCTAACCAGCAAACACAAC-3?, arg/-cg-R :5' -CCGGAATTCGCTCTAGATCAGCGAGGACATTTGCG-3'。
[0023] PCR扩增arg/基因片段，PCR扩增反应体系为50uL，其中模板DNA10 ng，上下游引 物各 10 μΜ，dNTPIO yM，5XPrimeSTAR Buffer 10 yL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 1.25 U (TaKaRa)。PCR 反应程序为：98°C预变性 10 min，98 °C 10 s，60 °C 15 s，72 °C 78 s，30个循环，72 °C10min。PCR产物经凝胶电泳后用胶回收试剂盒(试剂盒购自上海捷 瑞生物工程有限公司）回收，此片段即为arg/基因片段。将回收后的arg/基因片段与三磷 酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP)混合，在TaqDNA聚合酶作用下进行加 A反应，纯化后与pMD18 simple-T相连接，16°C连接12h，热击转化入经氯化钙处理的凡co/i DH5a感受态细胞 中，转化后的细胞涂布到含有氨苄青霉素100 μ g/mL的固体LB培养基上。37°C培养8-12h， 挑取多个转化子单菌落，提取质粒并测序。验证正确的质粒经价〇R I、BamH I双酶切处理 后用胶回收试剂盒回收(试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司），然后用T4 DNA连接酶与 经同样双酶切处理回收的PXMJ19质粒相连接，16°C连接12h，得到重组质粒pXMJ19-ar^/ (cg)，热击转化入经氯化钙处理的万.co/i DH5a感受态细胞中，转化后的细胞涂布到含有 氨苄青霉素1〇〇 μ g/mL的固体LB培养基上。37°C培养8-12h，挑选多个转化子单菌落，分 别培养并提前质粒用价〇R I、BamH I做酶切验证，能切下1300bp片段的即为连上argj基 因的质粒pXMJ19-ar^/ (叹)，构建流程见图2。
[0024] 实施例3棒杆菌感受态的制备方法与转化 本实施例所述棒杆菌为：谷氨酸棒杆菌C ATCC 钝齿棒杆 菌或者北京棒杆菌。
[0025] 棒杆菌为革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，而且存在着限制修饰系统，因此电击转化是 将重组DNA转化入谷氨酸棒杆菌细胞中最方便、最高效的转化手段。它的原理是将高压电 场短暂地加到细胞上，使细胞形成一些瞬时的孔洞，从而允许质粒DNA通过孔洞进入细胞。
[0026] (1)挑取棒杆菌单菌落，接种于含有5 mL LB的50mL摇管中，30°C、200 r/min振 荡培养12-14 h ; (2) 按5%。（v/v)接种量转接至50 mL含3%甘氨酸和0. 1% Tween80的新鲜LB培养基 中，培养至〇D6(i(i达到0· 9时，收集细胞，4?、6000 r/min离心5 min,弃上清； (3) 用预冷的20%甘油洗漆4-5遍，4°C，6000 r/min离心5 min,弃上清，保留菌泥； (4) 加入100 μ L 10%甘油，悬浮菌泥，即为谷氨酸棒杆菌感受态细胞。制备好的感受 态细胞可直接用于点电击转化或_80°C冰箱保存备用。
[0027] (5)将待转化的重组质粒pXMJ19-ar^/ (叹）（实施例2制备得到）10 μ L加入感 受态细胞中，轻轻混匀，冰浴15-20 min ; (6) 转入预冷的0. 1 cm电击杯中，冰浴10 min ; (7) 在BIO-RAD MicroPulser?电击仪中进行电转，电击条件为2 KV，4 ms ; (8) 立即向电击后的细胞中加入600 μ L LB培养基，转移至1.5 mL离心管中； (9) 46°C热击 6 min ; (10) 30°C摇床培养1.5-2 h，结束后低速离心浓缩菌体至100-200 μ L，涂布在含有氯 霉素10 μ g/mL的固体LB培养基上，30°C培养24 h以上，长出转化子。
[0028] 实施例4重组菌株的构建 谷氨酸棒杆菌ATCC13032进行ar冰基因的敲除，阻断瓜氨酸的去路，得到瓜氨酸生产 菌C ATCCnOSZ-Aa/^1^ (汤俊，郝宁，许晨，等.谷氨酸棒杆菌基因 缺失菌株的构建[J].南京工业大学学报：自然科学版，2013,35 (6):86-90)，瓜氨酸产量 2. 52g/L〇
[0029] 将实施例2中构建的基因重组质粒pXMJ19-ar^/(c^·)通过电击转化转入谷氨酸棒 杆菌C ^A/iaffii?ffl?ATCC13032- Aar冰中（详细步骤见实施例3)，菌液涂布在含有10 μ g/ mL氯霉素 LB平板上，30°C，培养36-48h，筛选具有氯霉素抗性的克隆CIT1(T19。
[0030] 将原始菌株瓜氨酸生产菌C WwiaffiicwMTCCnOS〗-Δ arW以及重组菌株 CITKT19在LB平板培养基上活化，30°C培养24h后，在30mL种子培养基中接入三环生长良 好的菌体，30°C，200rpm培养12h，然后按照3% (v/v)的接种量转接入4L发酵培养基，通空 气lv/vm，转速500rpm，30°C，氨水控pH6. 5,好氧发酵60h后，离心取上清液，通过高效液相 色谱测定发酵液中瓜氨酸产量，结果见表1。
[0031] 表 1
【权利要求】
1. arg/基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用。
2. 根据权利要求1所述arg/基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，其特征在于：将arg/ 基因通过基因工程手段导入到微生物中进行过表达，提高鸟氨酸乙酰转移酶活性，从而 提高L-瓜氨酸产量。
3. 权利要求1或2所述的arg/基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，其特征在于：所 述arg/基因是来自谷氨酸棒杆菌C ATCC 13032的arg/基因。
4. 根据权利要求2所述arg/基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，其特征在于包括如 下步骤： 1) 构建含有arg/基因的重组表达质粒； 2) 将步骤1)构建的质粒电转到微生物中，筛选阳性转化子； 3) 将步骤2)筛选得到的阳性转化子进行发酵生产L-瓜氨酸。
5. 根据权利要求4所述arg/基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用，其特征在于：所述 微生物为谷氨酸棒杆菌、钝齿棒杆菌或者北京棒杆菌中的一种。
【文档编号】C12N15/77GK104152483SQ201410406796
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】郝宁, 许琳, 母景瑞, 严明, 李艳, 刘兆星, 申朋, 许晟, 欧阳平凯 申请人:南京工业大学