专利名称：瓜氨酸用于治疗营养缺乏状况的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及瓜氨酸(I)
或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与在不是由于肠功能不全而导致的病理学状态的情况下蛋白质合成减少相关的营养缺乏状况。
在本发明的范围内，“L-瓜氨酸”是指商购可得的产品(尤其是由Sigma提供的)，或者来源于植物(尤其是西瓜(Citrullus lanatus))的尤其以果汁、果肉或提取物形式存在的天然产品。
“肠功能不全”是指肠，尤其是小肠的一种病理学状况，其中营养物的吸收相对于正常而言是降低的，所述营养物吸收减少与能够确保该吸收的肠细胞的数量和/或功能性的降低相关，这种肠细胞数量和/或功能性的降低本身归因于这些细胞的物理去除(尤其是通过手术或通过辐射)，或者这些细胞的病理学机能障碍。
特别地，本发明涉及L-瓜氨酸在制备药物中的用途，所述药物用于在处于营养缺乏状况的患者中增加异常低的肌内蛋白质合成，所述营养缺乏状况与在不是由于肠功能不全而导致的病理学状态的情况下蛋白质合成减少相关。
更特别地，本发明涉及上面提及的L-瓜氨酸在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自下列的病症或病理学状态 -与摄入缺乏相关的蛋白质-能量营养不良， -癌症，除了导致肠功能不全的肠癌外， -肌肉除神经支配， -化学疗法，除了在肠水平上有作用的那些化学疗法外， -糖尿病， -肥胖症， -失重(apesanteur)， -骨折后固定的肢， -常规手术，除了肠消化道手术外，和 -营养障碍。
在本发明的背景下能够治疗的病症或病理学状态在Couet等人的文章(Couet C.，Attaix D.Lemuscle.Leverve X，Cosnes J，ErnyP，Hasselmann M，编者.Traitéde nutrition artificielle del′adulte. ParisMariette Guéna，1998261-274)中作了举例说明。
本发明还涉及前面提及的病症或病理学状态的治疗性治疗方法，其包括给患者施用有效剂量的瓜氨酸或其盐。
本发明涉及用于治疗前面提及的病症或病理学状态的L-瓜氨酸。
更特别地，本发明涉及L-瓜氨酸在制备药物中的用途，所述药物用于治疗患营养缺乏状况的患者，所述营养缺乏状况与在不是由于肠功能不全而导致的病理学状态的情况下蛋白质合成减少相关。
因此，本发明的目标在于用于治疗患营养缺乏状况的患者的L-瓜氨酸，所述营养缺乏状况与在不是由于肠功能不全而导致的病理学状态的情况下蛋白质合成减少相关。
根据另一个实施方案，本发明涉及上面提及的L-瓜氨酸在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物包含作为活性成分的L-瓜氨酸或其药学上可接受的盐，其与药学上可接受的载体相联合。
瓜氨酸的“药学上可接受的盐”尤其是指例如瓜氨酸的苹果酸盐、瓜氨酸的α-酮戊二酸盐、瓜氨酸的柠檬酸盐或瓜氨酸的α-酮异己酸盐。
药学上可接受的载体对于本领域技术人员来说是熟知的。
本发明尤其涉及上面提及的L-瓜氨酸在制备药物组合物中的用途，其特征在于，对于大约0.1g/kg/天至大约0.5g/kg/天，尤其是大约0.25g/kg/天的剂量方案而言，L-瓜氨酸的单位剂量为大约2g至大约20g，尤其是大约10g。
更特别地，本发明涉及上面提及的L-瓜氨酸在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物以干的形式或水溶液的形式存在。
更特别地，本发明涉及上面提及的L-瓜氨酸在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物以可通过口服、皮下、经肠或肠胃外途径施用的形式存在。
通过经肠途径的施用尤其相应于通过鼻胃管或鼻肠管、通过胃切开术或空肠造口术来进行的施用；通过肠胃外途径的施用尤其相应于通过中央、外周或皮下静脉内灌注来进行的施用。
更特别地，本发明涉及上面提及的L-瓜氨酸在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物还包含一种或多种用于治疗与营养缺乏相关的恶病质的其他化合物，例如亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鸟氨酸以及它们的各种可使用的盐例如α-酮戊二酸盐或α-酮异己酸盐，这些物质单独地存在，或者在用于肠胃外营养的营养混合物中，或在用于经肠营养的混合物或用于口服营养的混合物中。
根据另一个实施方案，本发明涉及药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含作为活性成分的L-瓜氨酸或其药学上可接受的盐；与之相联合的至少一种用于治疗与营养缺乏相关的恶病质的其他化合物，例如亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鸟氨酸以及它们的各种可使用的盐例如α-酮戊二酸盐或α-酮异己酸盐，这些物质单独地存在，或者在用于肠胃外营养的营养混合物中，或在用于经肠营养的混合物或用于口服营养的混合物中；以及药学上可接受的载体。
根据另一个实施方案，本发明涉及这样的产品，其包含 -L-瓜氨酸或其药学上可接受的盐，和 -至少一种用于治疗与营养缺乏相关的恶病质的其他化合物，例如亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鸟氨酸以及它们的各种可使用的盐例如α-酮戊二酸盐或α-酮异己酸盐，这些物质单独地存在，或者在用于肠胃外营养的营养混合物中，或在用于经肠营养的混合物或用于口服营养的混合物中， 以作为用于在治疗肠功能不全的情况下同时、分开或在时间上错开使用的联合产品(produit de combinaison)。
本发明借助于下面的实施例1和2以及
图1至3来进行举例说明。
附图描述 图1A显示了来自健康的(左边的柱)或营养缺乏的(右边的柱)大鼠并且在瓜氨酸存在下(黑色柱)或在瓜氨酸不存在下(对照-白色柱)进行温育的滑车上肌(epitrochlearis)的分数式蛋白质合成(synthèse protéique fractionnaire，FSR)，其根据实施例1的操作方式来测量。结果表示为％/小时。
图1B显示了来自健康的(左边的柱)或营养缺乏的(右边的柱)大鼠并且在瓜氨酸存在下(黑色柱)或在瓜氨酸不存在下(对照-白色柱)进行温育的滑车上肌的分数式蛋白质合成(FSR)，其根据实施例1的操作方式来测量。结果表示为％/对照。
图2A显示了显影1小时后的Western印迹，其中图解说明了在营养缺乏的老年大鼠的肌肉上P70S6激酶的激活，其根据实施例2中所描述的操作方式来测量。
图2B为图示，其中显示了在营养缺乏的老年大鼠的肌肉上P70S6激酶的激活，其根据实施例2中所描述的操作方式来测量。AL对照组；R经历饮食限制的组；R+AANE经历饮食限制并随后经历富含非必需氨基酸的标准饮食制度(régime)的组；R+CITR经历饮食限制并随后经历富含瓜基酸的标准饮食制度(5g/kg/天)的组。统计学检验ANOVA+Fisher PLSD检验*对AL，p＜0.05；¤对R，p＜0.05。
实施例1在体外在表面灌流的(périfusé)分离的肌肉上测量的瓜氨酸对于肌肉蛋白质合成的调节 1.1.材料和方法 动物的处理将年龄为3个月的Sprague-Dawley雄性大鼠(Charles River Laboratoires，L’Arbresles，France)(n＝20)在恒温环境(23℃±1℃)下置于单个的笼中，并经历12小时的光照/黑暗(8点至20点为黑暗)循环。
将大鼠驯化2周，在此期间测量自发的饮食消费。用含有17％的蛋白质，3％的脂质，59％的糖类以及21％的水、纤维、维生素和矿物质的标准饮食制度(A04，UAR，Villemoisson-sur-Orge，France)来饲喂大鼠。对于成年大鼠而言，在该时间段期间的平均饮食摄入量为28g/天。
在驯化期结束时，将大鼠随机分为2组由随意(ad libitum，AL)饲喂的大鼠组成的对照组，和在同一时间段期间经历饮食限制的组以50％的自发摄入物，用含5％蛋白质的饮食制度饲喂大鼠6周(Walrand S，Chambon-Savanovitch C，Felgines C，Chassagne J，Raul F，Normand B等人.Agingabarrier to renutrition？Nutritional and immunologic evidence in rats.Am J Clin Nutr2000；72816-824)。
经温育的分离的肌肉根据先前所使用的方法(Minet-Quinard R，Moinard C，Villie F，Vasson MP，Cynober L.Metabolic pathwaysimplicated in the kinetic impairment of muscle glutaminehomeostasis in adult and old glucocorticoid-treated rats.AmJ Physiol Endocrinol Metab 2004；287E671-E676)来对肌肉进行温育。使用滑车上肌，因为它最适合于此类研究。在剥离之后，将滑车上肌在3mL Krebs-Ringer缓冲液(119mM NaCl；4.8mM KCl；1.25mM MgSO4；25mM NaHCO3；1.24mM NaHPO4；1.0mM CaCl2；2mM HEPES，pH 7.4)中进行温育，该缓冲液还含有葡萄糖(8mM)、胰岛素(0.01U/ml)和牛血清白蛋白(BSA)(0.1％重量/体积)。在37℃下以95％O2∶5％CO2将肌肉预温育30分钟。然后，将肌肉转移至含有3mL温育介质(含有13C-苯丙氨酸(1mM)，有或没有2.5mM瓜氨酸)的管中并温育2小时。在温育结束时，收集肌肉，并保存于-80℃，直至通过质谱法来测量13C-苯丙氨酸的掺入以测定分数式蛋白质合成(FSR)(Guillet C，Boirie Y，Walrand S.An integrative approach toin-vivo protein synthesis measurementfrom whole tissue tospecific proteins.Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2004；7531-538)。此外，通过离子交换色谱法在温育介质中测定氨基酸的量。
1.2.结果 结果在图1中给出。
瓜氨酸不被肌肉所代谢，因为没有任何在代谢上与瓜氨酸相关的氨基酸被释放到温育介质中(结果未显示)。
这些结果证明，与文献的数据相一致，营养缺乏使成年大鼠中肌肉蛋白质合成减少(图1A白色柱(健康的年幼大鼠)与黑色柱(营养缺乏的年幼大鼠)相比较)。
上面提及的实验结果证明，施用L-瓜氨酸使得能够增加在呈现出肌肉蛋白质合成减少的营养缺乏的大鼠中的肌肉蛋白质合成(+27％，图1A，营养缺乏的年幼大鼠的白色柱和黑色柱的比较)。在经温育的分离的肌肉上离体进行的这项工作使得能够证明，L-瓜氨酸在肌肉水平上具有直接作用。从文献中的数据来看，该结果是出人意料的和完全无法预见的，因为只有亮氨酸(必需氨基酸)具有这样的特性(Crozier SJ，Kimball SR，Emmert SW，Anthony JC，Jefferson LS.Oral leucine administration stimulates protein synthesisinratskeletal muscle.J Nutr 2005；135376-382)。然而，L-瓜氨酸是其结构与亮氨酸非常不同的氨基酸；它不进入蛋白质的组成中，并且几乎不存在于饮食中。
实施例2体内研究，其证明了对于通过激活mTOR途径的蛋白质合成的直接作用 2.1.材料和方法 动物的处理使用40只年龄为19个月的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River，L’Arbresle，France)。在2周的驯化期期间，使用标准饮食制度(UARA04，Usine d′Alimentation Rationnelle，Villemoisson-sur-Orge)随意地饲喂这些动物。定期测量自发摄入物。在这段时间之后，使30只大鼠经历50％的饮食限制12周。在饮食限制期结束时处死10只大鼠作为对照组(R组)。在处死之前，将20只其他的大鼠再饲喂一周。等氮和等热量的饮食制度或者为富含瓜氨酸(5g/kg/天)的标准营养(n＝10，R+CIT组)，或者为富含非必需氨基酸(等摩尔比的Ala、Gly、His、Asp、Ser)的标准营养(n＝10，R+AANE组)。10只大鼠构成了对照组(A.L)；在处死之前，在整个研究期间随意地饲喂它们。然后处死大鼠。获取胫骨肌并快速在液氮中冷冻，随后贮存于-80℃直至对其进行分析。
蛋白质的提取和含量测定用研钵在液氮中研磨肌肉。将如此获得的粉末称量，然后接纳在10倍体积的增溶缓冲液中，该增溶缓冲液含有磷酸酶和蛋白酶的抑制剂的混合物。将样品在冷冻室中于轮(roue)上放置最少1小时。于+4以13000g离心30分钟后，将上清液分配成等分级分，然后保存于-80℃。
通过双金鸡宁酸方法来测定蛋白质的含量。
在含有β-巯基乙醇(5％)和Laemmli缓冲液(Laemmli样品缓冲液)的变性缓冲液中，在100℃的水浴中使每个样品的等分级分变性5分钟。
通过Western印迹来进行mTOR(哺乳动物的雷帕霉素靶标)途径激活分析，所述Western印迹显示了mTOR的各种靶标的磷酸化形式。蛋白质的完整性通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及随后的考马斯蓝染色来进行验证。
Western印迹技术将20μg变性的蛋白质分别置于10％和12％的聚丙烯酰胺凝胶上以研究p70S6K和rpS6(磷酸化的形式或者总的形式)。
-通过电泳来进行的蛋白质迁移在1×迁移缓冲液(25mM Tris、192mM甘氨酸、0.1％SDS)中，于20mA迁移2小时。
-将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上然后，将凝胶转移到硝酸纤维素膜上。为此，将每一块凝胶放在盒中。在1×转移缓冲液(25mMTris、192mM甘氨酸、0.01％SDS、20％无水乙醇)中，在冷的状态下于120mA转移最少1小时30分。转移的质量通过丽春红染色来可视化。
-免疫检测将膜在合适的缓冲液[Tris缓冲液(Tris BufferSaline Tween 1X(TBST))1mM Tris，15mM NaCl，0.5％Tween 20，pH 8；1％脱脂奶粉，4％BSA]中预温育一小时以便使非特异性的位点饱和。然后，依据待研究的蛋白质的形式，将膜在杂交缓冲液中于4℃温育过夜。为了研究磷酸化的形式，将1X TBST缓冲液、1％脱脂奶、4％BSA与一抗相混合。为了研究总的形式，TBSA缓冲液(1X TBST、5％脱脂奶)用于与一抗(稀释至1/125e的总P70S6激酶#9202；稀释至1/250e的抗Phospho-P70 S6激酶(Thr 389)#9234；稀释至1/2000e的总rpS6(5G10)#2217；稀释至1/2000e的Phospho-rpS6(Ser240/244)#2215)相混合。在1X TBST溶液中漂洗几次后，在该同样的溶液中进行3次20分钟的洗涤。然后，将膜与偶联至过氧化物酶的二抗温育3/4小时。将膜在1X TBST中再漂洗2次，然后在该同样的溶液中进行3次至少20分钟的洗涤。使用ECL试剂盒，在暗室中进行在放射照相胶片上的显影。
2.2.结果 结果在图2中给出。
这些结果证明，饮食限制(R组)显著地降低了P70S6激酶的活性(-83％，相对于A.L.组的对照)。
补充有非必需氨基酸的饮食制度(R+AANE组)恢复了一部分该活性，但并不显著，所述活性仍显著地低于在对照中所观察到的活性(-45％，相对于A.L.对照组)。
相反地，以5g/kg/天的剂量补充有瓜氨酸的饮食制度(R+CIT组)显著地恢复了该活性(+417％，相对于R组)，所述活性并没有显著地不同于在对照(A.L.组)中所观察到的活性。
因此，这些结果证明，瓜氨酸对于通过激活mTOR系统的蛋白质合成具有直接活性。
权利要求
1.L-瓜氨酸(I)
或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与在不是由于肠功能不全而导致的病理学状态的情况下蛋白质合成减少相关的营养缺乏状况。
2.根据权利要求1的L-瓜氨酸在制备药物中的用途，所述药物用于在处于营养缺乏状况的患者中增加异常低的肌内蛋白质合成，所述营养缺乏状况与在不是由于肠功能不全而导致的病理学状态的情况下蛋白质合成减少相关。
3.根据权利要求1或2中任一项的L-瓜氨酸在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自下列的病症或病理学状态
-与摄入缺乏相关的蛋白质-能量营养不良，
-癌症，除了导致肠功能不全的肠癌外，
-肌肉除神经支配，
-化学疗法，除了在肠水平上有作用的那些化学疗法外，
-糖尿病，
-肥胖症，
-失重，
-骨折后固定的肢，
-常规手术，除了肠消化道手术外，和
-营养障碍。
4.根据权利要求1-3中任一项的L-瓜氨酸的用途，其特征在于，所述药物组合物包含作为活性成分的L-瓜氨酸或其药学上可接受的盐，其与药学上可接受的载体相联合。
5.根据权利要求1-4中任一项的L-瓜氨酸的用途，其特征在于，对于大约0.1g/kg/天至大约0.5g/kg/天，尤其是大约0.25g/kg/天的剂量方案而言，L-瓜氨酸的单位剂量为大约2g至大约20g，尤其是大约10g。
6.根据权利要求1-5中任一项的L-瓜氨酸的用途，其特征在于，所述药物组合物以干的形式或水溶液的形式存在。
7.根据权利要求1-6中任一项的L-瓜氨酸的用途，其特征在于，所述药物组合物以可通过口服、皮下、经肠或肠胃外途径施用的形式存在。
8.根据权利要求1-7中任一项的L-瓜氨酸的用途，其特征在于，所述药物组合物还包含一种或多种用于治疗与营养缺乏相关的恶病质的其他化合物，例如亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鸟氨酸以及它们的各种可使用的盐例如α-酮戊二酸盐或α-酮异己酸盐，这些物质单独地存在，或者在用于肠胃外营养的营养混合物中，或在用于经肠营养的混合物或用于口服营养的混合物中。
全文摘要
本发明涉及L-瓜氨酸(I)或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与在不是由于肠功能不全而导致的病理学状态的情况下蛋白质合成减少相关的营养缺乏状况。
文档编号A61K31/198GK101605538SQ200780042482
公开日2009年12月16日 申请日期2007年8月29日 优先权日2006年10月17日
发明者C·莫纳德, M·乔丹, S·沃尔兰德, L·塞诺伯 申请人:雷内笛卡尔巴黎第五大学, 百科达公司