专利名称：一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及能够生产瓜氨酸的一种从土壤中筛出的微生物菌株粪肠球菌 {Enterococcus faecal001及其培养发酵生产瓜氨酸及含有精氨酸脱亚氨酶的菌体，并将该菌体用于生物制备瓜氨酸的方法，属于食品生物技术领域。瓜氨酸广泛应用于食品、化妆品、医药等行业。
背景技术：
瓜氨酸具有提高免疫系统功能，维护关节运动的机能，平衡正常的血糖水平，含丰富的抗氧化剂吸收有害的自由基，帮助保持胆固醇的正常水平。它也可以使人的血管获得松弛，用于增强男性性功能，以及治疗性功能障碍。还可以维护健康的肺功能以及提高脑力清晰度，降低压力和克服沮丧情绪，有帮助脑神经细胞具贮藏与调回讯息的功能。随着生物技术和遗传工程研究的迅速发展，生物化学制品市场也得到了持续增加，世界年销售额高达几十亿美元。因此对很多生物制品如酶类，疫苗，抗体等的保存受到越来越多的重视。瓜氨酸清除羟基的功能得到了很好的利用，研究表明瓜氨酸对DNA和酶具有抗羟基保护。瓜氨酸作为抗氧化剂，可以用于化妆品，保健食品，食品添加剂以及营养强化剂，同时还可对厌氧物质提供保护。因此，人们对瓜氨酸越来越重视，并寄希望于开发出新型的功能食品和功能药物。至今为止，瓜氨酸的制造方法，主要有四种。第一，是从植物中提取的方法。来自天然，但提取率和含量低。第二，化学有机合成瓜氨酸的方法。该法可能会残留毒性物质，安全性有待考量， 且生成物分离精制操作复杂。第三，利用微生物酶法进行生产。酶法生产瓜氨酸即采用Sir印tococcM faecal is, Clostridium perfringens，Micrococcus pyogenes, Bacillus pyocyaneus ^^ 生物生产的精氨酸脱亚氨基，用该酶由精氨酸生产瓜氨酸。第四，发酵法进行生产。发酵法的优点是成本低，产量高，产物的纯度高，在产品的生产过程中没有有毒物质的产生，给产物后加工提供了方便，降低了成本，且适合大规模的生产。国外在瓜氨酸方面的研究较多，尤其是在日本、美国和欧洲。在瓜氨酸的制备方法上，国外主要采用发酵法和酶法生产，分离纯化多数使用离子交换等常用的分离方法。
发明内容
本发明的目的本发明在深入调查和研究了现有技术基础上，并从土壤中筛出多株生产瓜氨酸的菌株进行了研究，最终筛选到一株能高产瓜氨酸的微生物。其二，提供该菌株发酵生产或与精氨酸溶液的全细胞转化的方法，以得到高的转化率和较纯的瓜氨酸产品。再者，提供一种瓜氨酸分离纯化与精制的方法，以得到高纯度的瓜氨酸。
本发明的技术方案本发明提供一种来源于土壤高产瓜氨酸的菌株，是通过根据一定法则的菌类学性质、生物化学性质的分析和16sRNA序列的测定而得出其分类命名为 {Enterococcus /aecahi) SK23. 001。已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO :M 2011465。利用该微生物CCTCC NO =M 2011465为出发菌株，通过发酵生产瓜氨酸或通过发酵获得具有精氨酸脱亚氨酶活的静息细胞，然后作用于精氨酸转化合成瓜氨酸，步骤如下
(1)种子培养
种子培养基=L-Arg l-20g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-100g/L，无机氮源1. 0-10. Og/L以及加或不加少量无机盐等，调pH4. 0-7. 5 ；
种子培养条件菌株于30-37°C、100-300rpm的振荡速度下在种子培养基中培养5_30h 活化该菌株。(2)发酵培养
发酵培养基=L-Arg l-100g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-100g/L，无机氮源1. 0-10. Og/L以及加或不加少量无机盐等，调pH4. 0-7. 5 ；
发酵条件接种量1%_10%，30-37°C、转速180-500r/m的条件下在发酵培养基中发酵 5-72h，获得获得具有酶活的发酵液及湿菌体。(3)发酵后处理
发酵液经冷冻离心后收集上清液含瓜氨酸的发酵液及具有精氨酸脱亚氨酶活的湿菌体，并用0. 1%的生理盐水和PH6.0的0. lmol/L醋酸盐缓冲液清洗菌体，得静息细胞用于进行全细胞转化反应，经检测转化率在80%以上。(4)静息细胞将精氨酸转化生产瓜氨酸底物精氨酸浓度10_200g/L，静息细胞量 0. l-10g/L，在pH4. 0-8. 0、转化反应温度为30_70°C、转化反应时间l_60h的条件下转化制得瓜氨酸；
(5)瓜氨酸的分离纯化
将发酵液或转化后的反应液经脱色后利用强酸性阳离子交换树脂D001，进行瓜氨酸分
离纯化。本发明的有益效果本发明涉及一株从土壤中筛选而来的粪肠球菌 (.En terococcus faecal is ) SK23. 001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO =M 2011465，以此菌为出发酵菌株，以精氨酸为诱导物、以葡萄糖为碳源、酵母膏和蛋白胨为氮源等组成发酵培养基，发酵生产瓜氨酸，或通过发酵获得具有精氨酸脱亚酶酶活的静息细胞菌体并添加到5%-20%精氨酸溶液中转化合成瓜氨酸，经检测可知，转化率可达80%以上。本发明方法生产的瓜氨酸安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性产品，被广泛的应用于食品、化妆品、医药等行业。本发明能高效地生产瓜氨酸，适于进行大规模生产。生物材料样品保藏一株产瓜氨酸的菌株，其分类命名为粪肠球菌
faecal is) SK23. 001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 2011465，保藏日期2011年12月12日。
具体实施例方式以下是(你terococc^s /aecahi) 123. 001进行发酵生产瓜氨酸的实施例，但本发明的技术范围并不限于所列出的几个实例，在不改变其要点的前提下，可做各种改变进行实施。另外，本发明的技术范围延及均等的范围。实施例1 SK23. 001菌株的发酵培养
在含葡萄糖1%、精氨酸1. 2%、酵母膏0. 5%，蛋白胨0. 5%，无机氮源0. 1%以及含或不含少量无机盐，调ρΗ6· 0的培养基中，37°C，190 rpm的条件下培养SK23. 001 22h，冷冻离心， 制得具有精氨酸酶活的静息细胞。实施例2转化反应
使用实施例1所得菌体按lg/L添加到含精氨酸质量浓度为50g/L的IOOmM醋酸缓冲液(HAc-NaAc、pH6. 0)中，在37°C下进行转化反应，合成瓜氨酸。实施例3瓜氨酸产量的测定
将实施例3中进行的反应液经灭酶(TCA沉淀)、稀释，通过安捷伦液相色谱仪，分别对精氨酸、瓜氨酸进行定量。分析条件如下仪器型号=Agillent 1100，色谱柱(250*4. 6)mm 5 μ m ODS HYPERSIL,柱温40°C。实施例4新型瓜氨酸产生菌的鉴定
将新型瓜氨酸生产菌送往中国典型培养物保藏中心测定该菌的形态特征、生理生化特性以及 16SrRNA 基因序列分析，鉴定为(^terococciAs faecal is) SK23-001o实施例5瓜氨酸的分离纯化
将转化所得的反应液经脱色后，利用强酸性阳离子交换树脂D001，用不同浓度的氨水进行洗脱，得到纯化的瓜氨酸。
权利要求
1.一株产瓜氨酸的菌株，其分类命名为粪肠球菌(你terococctts faecaliS^ix 001, 已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 2011465。
2.一种用权利要求1所述CCTCC NO =M 2011465菌株生物合成瓜氨酸的方法，其特征在于，以CCTCC NO =M 2011465为出发菌株，通过发酵生产瓜氨酸或通过发酵获得具有精氨酸脱亚氨酶活的静息细胞，然后作用于精氨酸转化合成瓜氨酸，步骤如下(1)种子培养种子培养基=L-Arg l-20g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-100g/L，无机氮源1. 0-10. Og/L，调ρΗ4· 0-7. 5，去离子水配制；种子培养条件=CCTCC NO =M 2011465菌株于30-37°C、100-300rpm的振荡速度下在种子培养基中培养5-30h活化该菌株；(2)发酵培养发酵培养基=L-Arg l-100g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-100g/L，无机氮源1. 0-10. Og/L，调ρΗ4· 0-7. 5，去离子水配制；发酵条件接种量1%_10%，30-37°C、转速180-500rpm的条件下在发酵培养基中发酵 5-72h，获得具有酶活的发酵液及湿菌体；(3)发酵后处理发酵液经冷冻离心后收集上清液获得含瓜氨酸的发酵液及含精氨酸脱亚氨酶湿菌体， 菌体用0. 1%的生理盐水和pH6. 0的0. lmol/L醋酸盐缓冲液清洗菌体，得静息细胞用于进行全细胞转化反应，经检测转化率在80%以上；(4)静息细胞将精氨酸转化生产瓜氨酸底物精氨酸浓度10-200g/L，静息细胞量 0. l-10g/L，在pH4. 0-8. 0、转化反应温度为30_70°C、转化反应时间l_60h的条件下转化制得瓜氨酸；(5)瓜氨酸的分离纯化将发酵液或转化后的反应液经脱色后利用强酸性阳离子交换树脂D001，进行瓜氨酸分离纯化。
全文摘要
一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法，属于食品生物技术领域。本发明涉及一株从土壤中筛选而来的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)SK23.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM2011465，以此菌为发酵菌株，以精氨酸为诱导物、以葡萄糖为碳源、酵母膏和蛋白胨为氮源等组成发酵培养基，发酵生产瓜氨酸，或通过发酵获得具有精氨酸脱亚氨酶酶活的静息细胞菌体并添加到5%-20%精氨酸溶液中转化合成瓜氨酸，经检测可知，转化率可达80%以上。本发明方法生产的瓜氨酸安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性产品，被广泛的应用于食品、化妆品、医药等行业。本发明能高效地生产瓜氨酸，适于进行大规模生产。
文档编号C12N1/20GK102433290SQ20121001203
公开日2012年5月2日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者张涛, 江波, 沐万孟, 王莹, 缪铭 申请人:江南大学