钙离子结合位点氨基酸残基突变改善环糊精葡萄糖基转移酶产β-环糊精能力的方法
【专利摘要】具有高产β-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶)的突变体及突变方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明采用定点突变方法提高CGT酶的产β-环糊精能力，提供了提高Bacillus?circulans?STB01CGT酶产β-环糊精能力的突变方案，将CGT酶中钙离子结合位点处第315位丙氨酸突变为精氨酸(Arg)或天冬氨酸(Asp)，获得突变体A315R和A315D。相比于野生CGT酶，这两种突变体具有更高的产β-环糊精能力，更适合β-环糊精的工业化生产。
【专利说明】钙离子结合位点氨基酸残基突变改善环糊精葡萄糖基转移酶产β-环糊精能力的方法
【技术领域】
[0001]具有高产β-环糊精能力的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及其方法，本发明属于基因工程和酶工程领域。具体的说本发明是利用定点突变技术改善环糊精葡萄糖基转移酶的产物特异性。
【背景技术】
[0002]由于环糊精的环状中空圆锥形结构具有内疏水、外亲水的特性，能与多种疏水性物质形成包合物，因此，在医药、化工、食品、材料和分析化学等领域有着广泛应用，其中α-、β-和Y-环糊精最为常见。
[0003]目前，环糊精通常由环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶)作用淀粉而合成。CGT酶是一种多功能型酶，能催化环化反应、偶合反应、歧化反应和水解反应，其中环化反应是其工业应用的基础。已知野生CGT酶环化反应的产物均是α -、β -和Y -环糊精的混合物，不利于产物的分离纯化，增加了环糊精的生产成本，因此，有必要改善其产物特异性。研究发现，钙离子结合位点普遍存在于CGT酶中，且可能与CGT酶的产物特异性密切相关。
[0004]本发明主要是将来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans) STBOl的CGT酶中钙离子结合位点处第315位氨基酸残基进行突变，以改善CGT酶的产物特异性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供提高B.circulans STBOICGT酶产β -环糊精能力的突变方案。
[0006]本发明的另一个目的是提出具有更高环糊精生产能力的突变体A315R和A315D及其构建方法。
[0007]本发明的技术方案:
[0008]来源于B.circulans STBOl的CGT酶的突变体A315R和A315D，是将CGT酶中钙离子结合位点处第315位Ala分别突变为Arg和Asp。相比于野生CGT酶，突变体A315R和A31?具有更高的β-环糊精生产能力。
[0009]所述的突变体A315R和Α31?的制备方法，是根据B.circulans STBOICGT酶基因序列，分别设计相应突变位点的引物，对CGT酶基因进行突变，并且鉴别出Ala315密码子已经变成Arg315、Asp315密码子的突变基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。
[0010](I)定点突变
[0011]利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体pST/cgt为模板进行定点突变。
[0012]引入Arg315密码子的突变引物为:
[0013]正向引物:5’ -GCAGCCGATTACCGCCAGGTGGATG-3 ’，下划线为突变碱基，[0014]反向引物:5’ -GTCATCCACCTGGCGGTAATCGGCTG-3，，下划线为突变碱基；
[0015]引入Asp315密码子的突变引物为:
[0016]正向引物:5’ -GCAGCCGATTACGACCAGGTGGATG-3 ’，下划线为突变碱基。
[0017]反向引物:5’ -GTCATCCACCTGGTCGTAATCGGCTG-3，，下划线为突变碱基。
[0018]PCR 反应体系均为:5 XPrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus) 10 μ L，dNTPs (各2.5πιΜ)4μ L，正向引物(10 μ Μ) I μ L，反向引物(10 μ Μ) I μ L,模板 DNAl μ L，PrimeSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/ μ L) 0.5 μ L,加入双蒸水 32.5 μ L。 [0019]PCR反应扩增条件均为:PCR扩增条件均为:98°C预变性4min ;随后98 °C 10s，55°C 15s，72°C 8min 进行 35 个循环；最后 72°C保温 lOmin。
[0020]将PCR产物经过DpnI消化2h后,转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将突变质粒转入表达宿主B.subtilis WB600感受态细胞中。各培养基中均添加5 μ g/mL硫酸卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0021](2)突变体的表达与纯化
[0022]挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于LB培养基中，在37°C、200r/min下培养8~12h，以4% (v/v)接种量接种到TB培养基中，在37°C、200r/min下发酵48h。将发酵液于4°C、1000Orpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，分别得到突变体A315R和A31?酶制品。各培养基中添加5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0023]本发明的最终效果:构建了突变体A315R和A315D，均实现了 β _环糊精产物特异性的提高，比野生型CGT酶更利于β -环糊精的工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1野生CGT酶及其突变体在ρΗ6.0、50°C下作用于5%麦芽糊精溶液生产环糊精情况。A:野生CGT酶，B:突变体A315R，C:突变体A315D ; ，α-环糊精，籲，β-环糊精，▲，Y-环糊精
【具体实施方式】
[0025]实施例1:本例具体说明突变体A315R和A315D的制备
[0026](I)定点突变
[0027]利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体pST/cgt为模板进行定点突变。
[0028]引入Arg315密码子的突变引物为:
[0029]正向引物:5’ -GCAGCCGATTACCGCCAGGTGGATG-3，，下划线为突变碱基，
[0030]反向引物:5’ -GTCATCCACCTGGCGGTAATCGGCTG-3，，下划线为突变碱基；
[0031]引入Asp315密码子的突变引物为:
[0032]正向引物:5’ -GCAGCCGATTACGACCAGGTGGATG-3，，下划线为突变碱基。
[0033]反向引物:5’ -GTCATCCACCTGGTCGTAATCGGCTG-3，，下划线为突变碱基。
[0034]PCR 反应体系均为:5 XPrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus) 10 μ L，dNTPs (各2.5πιΜ)4μ L，正向引物(10 μ Μ) I μ L，反向引物(10 μ Μ) I μ L,模板 DNAl μ L，PrimeSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/ μ L) 0.5 μ L,加入双蒸水 32.5 μ L。
[0035]PCR反应扩增条件均为:PCR扩增条件均为:98°C预变性4min ;随后98°C 10s，55°C 15s，72°C 8min 进行 35 个循环；最后 72°C保温 lOmin。
[0036]将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将突变质粒转入表达宿主B.subtilis WB600感受态细胞中。各培养基中均添加5 μ g/mL硫酸卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0037](2)突变体的表达与纯化
[0038]挑取转入表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于LB培养基中，在37°C、200r/min下培养8~12h，以4% (v/v)接种量接种到TB培养基中，在37°C、200r/min下发酵48h。将发酵液于4°C、1000Orpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，分别得到突变体A315R和A31?酶制品。各培养基中添加5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0039]上清液在70%硫酸铵溶液中沉淀过夜。沉淀物经适量Start buffer (20mmol/LTris-HCl,pH8.0)溶解,HiTrap ANX FF(high sub, 5mL)柱用 Start buffer 平衡后上样，洗脱液为含有lmol/L NaCl的Start buffer，分布收集，得到纯化突变体A315R和A315D。
[0040]实施例2:本例具体说明酶活力分析
[0041](I)酶活力的测定
[0042]甲基橙法测定α-环化活力的方法:取适当稀释的酶液0.lmL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1% (w/v)可溶性淀粉溶液中，在4(TC下反应10min后，加入1.0mLl.0N的盐酸停止反应，再加入1.0mL用50mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙溶液，在16°C下保温20min，在505nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成I μ mol α -环糊精所需的酶量。
[0043]酚酞法测定环化活力的方法:取适当稀释的酶液0.lmL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1% (w/v)可溶性淀粉溶液的试管中，在40°C下反应IOmin 后，加入 3.5mL30mM NaOH 和 0.5mL 由 5mM Na2CO3 溶液配制的 0.02% (w/v)酚酞溶液停止反应，在室温下保温20min，在550nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成I μ mol β -环糊精所需的酶量。
[0044]溴甲酚氯法测定Y -环化活力的方法:取适当稀释的酶液0.lmL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的1% (w/v)可溶性淀粉溶液的试管中，在40°C下反应IOmin后，加入50 μ L1.0N的盐酸停止反应，再加入2mL0.2M柠檬酸缓冲液(ρΗ4.2)和100 μ L5mM溴甲酚氯溶液，在室温下保温20min，在630nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成I μ mol Y -环糊精所需的酶量。
[0045](2)酶活力比较
[0046]实验结果列于表1，结果发现，野生CGT酶具有较高环化活力；与野生酶相t匕，突变体A315R的α-环化活力降低了 86%，β-环化活力增加12%，Y-环化活力增加107%;突变体A315D的α-环化活力降低了 71%，β-环化活力增加10%，Y-环化活力增加72 %。突变体A315R和Α31?的总环化活力基本保持不变。而且，突变体A315R和A315D的环化活力占总环化活力的比例高于野生酶。
[0047]表1[0048]
【权利要求】
1.来源于环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans) STBOl的环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶)的突变体A315R和A315D，其特征是:将CGT酶中钙离子结合位点处第315位丙氨酸(Ala)分别突变为精氨酸(Arg)或天冬氨酸(Asp);相比于野生CGT酶，突变体A315R和A31?具有更高的β-环糊精生产能力。
2.权利要求书I中所述突变体A315R和Α31?的制备方法，其特征是根据B.circulansSTBOICGT酶基因序列，分别设计相应突变位点的引物，对CGT酶基因进行突变，经测序验证后将突变基因转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。
3.权利要求书2中所述突变体A315R和A315D的制备: (1)定点突变 利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体pST/cgt为模板进行定点突变。 引入Arg315密码子的突变引物为: 正向引物:5 ’ -GCAGCCGATTACCGCCAGGTGGATG-3 ’，下划线为突变碱基， 反向引物:5’ -GTCATCCACCTGGCGGTAATCGGCTG-3’,下划线为突夺碱某; 引入Asp315密码子的突变引物为: 正向引物:5 ’ -GCAGCCGATTACGACCAGGTGGATG-3 ’，下划线为突变碱基。 反向引物:5 ’ -GTCATCCACCTGGTCGTAATCGGCTG-3，，下划线为突变碱基。
PCR 反应体系均为:5XPrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus) 10 μ L, dNTPs (各 2.5mM)4 μ L，正向引物(10 μ Μ) I μ L，反向引物(10 μ Μ) I μ L，模板 DNAl μ L, PrimeSTAR HS DNAPolymerase (2.5U/ μ L) 0.5` μ L,加入双蒸水 32.5 μ L。 PCR反应扩增条件均为:PCR扩增条件均为:98°C预变性4min ;随后98°C 10s，55°C 15s，72°C 8min进行35个循环；最后72°C保温lOmin。 将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichia coli) JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将突变质粒转入表达宿主B.subtilis WB600感受态细胞中。各培养基中均添加5 μ g/mL硫酸卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。 (2)突变体A315R和A315D的表达 挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于LB培养基中，在37°C、200r/min下培养8~12h，以4% (v/v)接种量接种到TB培养基中，在37°C、200r/min下发酵48h。将发酵液于4°C、1000Orpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，分别得到突变体A315R和A31?酶制品。各培养基中添加5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
【文档编号】C12N15/75GK103740669SQ201310153421
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年4月26日 优先权日:2013年4月26日
【发明者】李兆丰, 顾正彪, 班宵逢, 程力, 洪雁 申请人:江南大学