一种具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展示系统及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体的说是一种具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展示系统及其制备和应用。以含有来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因gdh和冰核蛋白基因的质粒作为基础质粒，将编码目标蛋白葡萄糖脱氢酶的基因序列gdh-m中引入突变的碱基，构建葡萄糖脱氢酶突变体细菌表面展示质粒；从而展示在宿主细胞表面上，得到基于冰核蛋白的葡萄糖脱氢酶突变体细菌表面展示系统。本发明制备得到的葡萄糖脱氢酶展示菌株具有高稳定性和高特异性，得到的全细胞催化剂可应用于生物能源、食品发酵、淀粉糖、功能糖、生物医药、化工、环境检测、生物传感器和生物燃料电池等领域。
【专利说明】一种具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展 示系统及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体的说是一种具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱 氢酶细菌表面展示系统及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖脱氢酶（⑶H) (EC1. 1. 1. 47)广泛参与生物体中的葡萄糖代谢途径，特别是 芽孢杆菌在芽孢形成阶段的关键酶。借助于辅酶NAD (P) +，葡萄糖在GDH的催化下被氧化成 葡萄糖酸内酯，辅酶NAD (P) +则被还原为NAD (P) H。自二十世纪八十年代起，研究人员就已 经克隆了来源于芽孢杆菌的GDH，并在大肠杆菌中进行了高效表达。
[0003] 来源于芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶属于短链脱氢酶/还原酶家族（short-chain dehydrogenase/reductase，SDR)，是由四个相同的亚基组成的四聚体蛋白，单体的分子量 约为30kDa。野生型的GDH热稳定性和pH稳定性都不理想，因此，在实际应用上受到了一 定的限制。鉴于此，研究人员开始对编码GDH的基因进行体外定向进化的研究，Makino和 Nagao等人采用化学诱变的方法对来源于Bacillus megaterium IWG3的葡萄糖脱氢酶进行 了突变，得到了多株热稳定性提高的突变体，其中E96A的热稳定性最高，与野生型相比提 高了约ZCTC^Baik等人米用DNA重排技术突变来源于Bacillus licheniformis IF012200, Bacillus megaterium IF015308, Bacillus subtilis IF013719 和 Bacillus megaterium IWG3的一个突变体F20 (Q252L)，获得了一个热稳定性显著提高的突变体DN46 (E170K/ Q252L)，DN46在66°C的半衰期为540分钟，而F20仅为1. 3分钟。⑶Η的三维结构研究表 明，突变体通过增强疏水作用和减小离子的排斥作用显著增强了亚基与亚基之间的相互作 用力，稳定了酶的三维结构，从而提高了酶的稳定性。在此基础上，Vazquez-Figueroa等人 对来自于Bacillus subtilis的葡萄糖脱氢酶进行了有理设计，得到了多个突变体，其中 K170/L252突变体的Tm值和野生型相比提高了 34. 7°C。
[0004] 在底物特异性方面，GDH对其天然底物β -D-葡萄糖的特异性并不高，对结构类似 的木糖、半乳糖、甘露糖都有较弱的催化作用。研究人员在GDH三维结构研究的基础上，突 变了巨大芽孢杆菌ΙΑΜ1030中IV-GDH的C-末端区域的氨基酸残基，得到了多个突变体，它 们对其底物特异性都有很大的影响。
[0005] 综上所述，研究者广泛采取随机突变、DNA重排等基因工程的手段，在一定程度上 提高了 GDH的稳定性和底物特异性，但是这些方法需要将表达的突变蛋白进行纯化，然后 再测定其酶活性，上述过程费时费力，需要昂贵的仪器设备，过程复杂且不易操作，尤其不 适用于高通量的突变体筛选。
[0006] 微生物表面展示技术是利用基因工程的手段将外源蛋白通过融合适当的锚定蛋 白而表达在微生物细胞的表面，例如OmpA、冰核蛋白（ice-nucleation protein，INP)和凝 集素等都可以作为锚定蛋白。这种技术被广泛用于蛋白质工程，疫苗设计，疾病诊治，工业 和环保等领域。由于被展示的蛋白在细胞表面具有相对独立的空间结构和生物学活性，能 够直接与底物进行充分的反应，而且表面展示文库具有高通量、高灵敏度的特点，因此微生 物表面展示技术在研究蛋白质生物学功能方面具有很大的应用前景。Tan等利用OprI作为 锚定蛋白将聚（R)的3-羟基丁酸酯（PHB)解聚酶突变体展示在大肠杆菌的表面，筛选得到 酶活性提高的突变体，研究了参与底物识别的关键氨基酸残基。由此可见，微生物表面展示 技术是用来研究蛋白功能和特性的一个非常简单、有效的手段。INP是丁香假单胞菌等菌株 的外膜蛋白，可催化过冷却水结冰。外源蛋白可与INP融合，通过糖基磷脂酰肌醇而锚定在 细菌表面。全长的冰核蛋白包括N端、C端和中间重复序列。与其他锚定蛋白相比，外源蛋 白可以在宿主细胞中稳定的表达，而且能够高效的展示在细菌表面。
[0007] Quikchange定点突变技术是通过设计含有突变位点的引物，利用PCR反应，以质 粒为模板，在高保真DNA聚合酶的作用下进行延伸，得到含有突变位点的DNA双链质粒，这 种质粒是未甲基化的，而大肠杆菌自身的质粒DNA是甲基化的，这样就可以通过Dpnl酶消 化去除原始模板，最后得到突变的质粒，经过转化得到突变的菌株。该技术操作简便，效率 高,现已成功用于各种突变体的构建。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展 示系统及其制备和应用。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0010] 一种具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展示系统，以含有来源于 枯草芽抱杆菌的匍萄糖脱氢*酶基因 gdh和冰核蛋白基因的质粒作为基础质粒，将编码目标 蛋白葡萄糖脱氢酶的基因序列gdh-m中引入突变的碱基，构建葡萄糖脱氢酶突变体细菌表 面展示质粒；从而展示在宿主细胞表面上，得到基于冰核蛋白的葡萄糖脱氢酶突变体细菌 表面展示系统。
[0011] 所述突变体，利用Quikchange定点突变方法，以质粒pTInaPbN-Gdh为模版，带有 突变碱基的正向和反向序列为引物，通过PCR反应得到突变体。（pTInaPbN-Gdh模版按照 如下文献构建 Bo Liang, Liang Li, Xiangjiang Tang, Qiaolin Lang, Hongwei Wang, Feng Li,Jianguo Shi,Wei Shen，Ilaria Palchetti，Marco Mascini，and AihuaLiu*，Microbial surface display of glucose dehydrogenase for amperometric D-glucose biosensor, Biosensors and Bioelectronics2013,45,19-24.)
[0012] 具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展示系统制备方法，以含有来 源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因 gdh和冰核蛋白基因的质粒作为基础质粒，利用 Quikchange定点突变方法，以质粒pTInaPbN-Gdh为模版，带有突变碱基的正向和反向序列 为引物，通过PCR反应得到突变体，也就是将编码目标蛋白葡萄糖脱氢酶的基因序列gdh-m 中引入突变的碱基，构建葡萄糖脱氢酶突变体细菌表面展示质粒；该质粒含有在葡萄糖脱 氢酶宿主细胞菌中表达和表面展示的所有元件，突变体与负责跨膜定位和转运的冰核蛋白 N端结构域的基因序列inaPb-N融合，从而展示在宿主细胞表面上，得到基于冰核蛋白的葡 萄糖脱氢酶突变体细菌表面展示系统。
[0013] 具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展示系统的应用，所述展示系 统得到的全细胞可应用于生物能源、食品工业、生物化工、生物传感或分析检测中。
[0014] 本发明的效果是：
[0015] 1.本发明利用冰核蛋白表面展示系统将葡萄糖脱氢酶突变体稳定地展示在细菌 的表面，从而解决了胞内酶提取过程复杂和稳定性低的难题。
[0016] 2.本发明将定向进化和细菌表面展示技术结合起来，实现了便捷有效的葡萄糖脱 氢酶突变体筛选方法。
[0017] 3.本发明通过Quikchange定点突变的方法得到四株热稳定性提高的突变体 Q252L/E170R、Q252L/E170R/V149K、Q252L/E170R/G259A 和 Q252L/E170R/V149K/G259A。
[0018] 4.本发明细菌表面展示的葡萄糖脱氢酶突变体热稳定性高。其中突变体Q252L/ E170R/V149K/G259A的热稳定性最好，在60°C条件下的半衰期是21天。
[0019] 5.本发明通过Quikchange定点突变的方法得到两株pH稳定性提高的突变体 Q252L/E170R/V149K 和 Q252L/E170R/V149K/G259A。
[0020] 6.本发明通过Quikchange定点突变的方法得到三株底物特异性提高的突变体 Q252L/E170R/G259A、Q252L/E170R/V149K 和 Q252L/E170R/V149K/G259A。
[0021] 7.本发明细菌表面展示的葡萄糖脱氢酶突变体特异性好，其中突变体Q252L/ E170R/V149K/G259A对其他糖类，如木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、核 糖和阿拉伯糖均无催化活性。
[0022] 8.本发明提供一种具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展示菌株 的制备方法。此方法简便高效，得到的菌株可用于生物能源、食品发酵、淀粉糖、功能糖、生 物医药、化工、环境检测、生物分析、生物传感器和生物燃料电池等领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为本发明实施例提供的葡萄糖脱氢酶基因的突变位点。
[0024] 图2为本发明实施例提供的全细胞GDH突变体的pH稳定性效果图。
[0025] 图3为本发明实施例提供的全细胞GDH突变体的温度稳定性效果图。
[0026] 本发明目的、功能及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
【具体实施方式】
[0027] 本发明利用Quikchange定点突变方法，构建基于冰核蛋白的细菌表面展示系统， 将葡萄糖脱氢酶突变体展示在大肠杆菌的表面，具体为：
[0028] 1.利用Quikchange定点突变方法突变葡萄糖脱氢酶的特定位点；
[0029] 2.将葡萄糖脱氢酶突变体展示在大肠杆菌的表面；
[0030] 3.测定葡萄糖脱氢酶突变体展示菌株全细胞的酶活性、稳定性和底物特异性。
[0031] 实施例1
[0032] 葡萄糖脱氢酶突变体的获得：
[0033] 1.野生型葡萄糖脱氢酶展示载体的构建：将编码枯草芽孢杆菌（Bacillus subtillus)中葡萄糖脱氢酶的基因 gdh与含有INP的表达质粒pTInaPb-N连接，转 化大肠杆菌感受态DH5ci，挑取转化子，提取测序鉴定正确的转化子的质粒，命名为 pTInaPbN-Gdh，待用。
[0034] 2.单点突变体Q252L的构建
[0035] 突变PCR :以pTInaPbN-Gdh质粒DNA为模板，根据突变位点设计并合成引物（表 1)，进行PCR扩增，得到编码葡萄糖脱氢酶突变体的基因。
[0036] PCR反应体系为：无菌水32. 5 μ L，模板DNA1 μ L，5 X PrimeSTAR HS缓冲液 (Mg2+plus) 10 μ L，dNTP 混合液（各 2. 5mmol/L) 4 μ L，引物 Q252L 正向（20pmol/μ L) 1 μ L， 引物 Q252L 反向（20pmol/yL)lyL，TaKaRaPrimeSTAR HS DNA 聚合酶 0.5yL。反应条件 为：95°C预变性 5min，94°C 10s，60°C 15s，72°C 7.5min，18 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。
[0037] 1)酶切：将反应完成的PCR产物取出，按1 : 50的比列加入Dpnl酶，37°C酶切6 个小时。
[0038] 2)取出，转化至大肠杆菌DH5a感受态，在含有卡那霉素的LB平板上涂布，37°C过 夜培养。
[0039] 3)转化子长出后，挑取单克隆送去测序。
[0040] 3.双点突变体的构建：双点突变体Q252L/E170R的构建是在单点突变体Q252L基 础上，利用E170R的引物（表1)进行PCR反应，引入E170R的突变位点。
[0041] 4.三点突变体的构建：三点突变体Q252L/E170R/V149K和Q252L/E170R/G259A的 构建是在双点突变体Q252L/E170R基础上，分别利用V149K和G259A的引物（表1)进行 PCR反应，分别引入V149K和G259A的突变位点。
[0042] 5.四点突变体的构建：四点突变体Q252L/E170R/V149K/G259A的构建是在三点突 变体Q252L/E170R/V149K基础上，利用G259A的引物（表1)进行PCR反应，引入G259A的 突变位点。
[0043] 表lQuikchange定点突变方法所用到的PCR引物
[0044]
【权利要求】
1. 一种具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展示系统，其特征在于：以 含有来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因 gdh和冰核蛋白基因的质粒作为基础质粒， 将编码目标蛋白葡萄糖脱氢酶的基因序列gdh-m中引入突变的碱基，构建葡萄糖脱氢酶突 变体细菌表面展示质粒；从而展示在宿主细胞表面上，得到基于冰核蛋白的葡萄糖脱氢酶 突变体细菌表面展示系统。
2. 按权利要求1所述的具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展示系统， 其特征在于：利用Quikchange定点突变方法，以质粒pTInaPbN-Gdh为模版，带有突变碱基 的正向和反向序列为引物，通过PCR反应得到突变体。
3. -种权利要求1所述的具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展示系 统制备方法，其特征在于：以含有来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因 gdh和冰核蛋 白基因的质粒作为基础质粒，利用Quikchange定点突变方法，以质粒pTInaPbN-Gdh为模 版，带有突变碱基的正向和反向序列为引物，通过PCR反应得到突变体，也就是将编码目标 蛋白葡萄糖脱氢酶的基因序列gdh-m中引入突变的碱基，构建葡萄糖脱氢酶突变体细菌表 面展示质粒；该质粒含有在葡萄糖脱氢酶宿主细胞菌中表达和表面展示的所有元件，突变 体与负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因序列inaPb-N融合，从而展示在宿 主细胞表面上，得到基于冰核蛋白的葡萄糖脱氢酶突变体细菌表面展示系统。
4. 一种权利要求1所述的具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展示系 统的应用，其特征在于：所述展示系统得到的全细胞可应用于生物能源、食品工业、生物化 工、生物传感或分析检测中。
【文档编号】C12N15/63GK104120102SQ201310152468
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月27日 优先权日:2013年4月27日
【发明者】刘爱骅, 梁波, 唐湘江 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所