专利名称：重组马铃薯y病毒组构建物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及适用于提供抗植物中病毒感染的保护作用的重组马铃薯Y病毒组感染性核酸构建物，并且涉及含有所述构建物的重组病毒。更具体地说，本发明涉及含有HC-Pro基因(它的编码保守FRNK盒的序列包含一个替代)的重组马铃薯Y病毒组感染性构建物。优选地，精氨酸(Arg)被异亮氨酸(Ile)替代。
本发明进一步涉及利用上述构建物生产马铃薯Y病毒组的温性株(mild strain)的方法，并且涉及应用所述构建物保护植物以防病毒感染和在植物中瞬时表达外源核酸(基因)的方法。优选地，本发明涉及一种抗ZYMV感染的葫芦科植物(curcurbits)交叉保护方法。
葫芦科是一个大的植物科，它包括数个经济上重要的全世界栽培的品种，例如黄瓜、南瓜、罗马甜瓜、夏南瓜(zucchini pumpkin)、甜瓜和西瓜。全世界的葫芦科植物生产受数种蚜虫传播的病毒的影响，最流行的是两种马铃薯Y病毒组ZYMV(夏南瓜黄色花叶病毒)和WMV-2(西瓜花叶病毒2)和CMV(黄瓜花叶病毒)。ZYMV感染的植物显示这样的症状例如，叶脉消除，接着，受感染的系统叶(systemic leaf)上出现黄色花叶病，而且可能表现出枯萎和变形。在轻微感染的情况下，产品的产量和质量都受影响，在严重感染时，可能完全损失，引起显著的经济损失。
控制措施包括植物检疫、彩色塑料覆盖物(引诱携带病毒的蚜虫)的应用和在植物周围产生疏水性屏障(例如喷油)。这些措施在大量感染时提供暂时的保护和有限的保护。
或者通过传统育种或者通过植物的遗传工程将得自病毒的核酸序列引入植物基因组来开发病毒抗性栽培品种也被用于保护植物以抗病毒感染。生产了呈现对ZYMV的抗性的南瓜杂交转基因近交系[TricoliD.M.,Carney K.J.,Russell McMaster P.F.,Groff D.W.,HaddenK.C.,Himmel P.T.,Hubbard J.P.,Boeshore M.L.和 QuemadaH.D.(1995)生物工程(Biotechnology),vol.13:1458],但这些只限于一个栽培品种。
交叉保护的现象(它是应用病毒的温性株来保护以抗由同一病毒的恶性株感染引起的损伤)提供了一种良好的控制病毒病的方法。
在葫芦科植物中，交叉保护(尤其抗ZYMV)是一种吸引人的控制选择。交叉保护在恶性病压力下是高度有效的。由葫芦科植物上ZYMV引起的病严重性和葫芦科植物的短植物生长周期(8～16周)使交叉保护成为葫芦科植物的一种优选的控制选择。
目前使用的用于葫芦科植物交叉保护的ZYMV的温性株是由Lecoq获得的[Lecoq H.,Lemaire JM.,Wipf-Scheible C.,(1991)Plant Dis.75:208～211]。该株被称为“ZYMV-WK”，很少被蚜虫传播，只引起轻微的叶斑，而且不会导致葫芦科植物中的果实畸形。通常通过机械接种在早期用温性株(ZYMV-WK)接种植物。
不存在该温性病毒的全长感染性克隆。
马铃薯Y病毒组具有一个由正义单链RNA构成的基因组，该RNA具有共价键连接的5＇末端病毒蛋白(Vpg)和3＇末端poly(A)尾。该病毒RNA作为单一的聚蛋白被表达，它接着通过三种病毒编码的蛋白酶被加工，产生八到十个基因，它们是整个马铃薯Y病毒组基因组的保守区。马铃薯Y病毒组通过蚜虫以非持久性方式从植物传播到植物，并且该过程依赖于两种病毒编码的蛋白质的存在，即外壳蛋白(CP)和辅助组分蛋白酶HC-Pro。HC-Pro是一种在蚜虫传播、聚蛋白加工、病毒复制、症状表达和病毒在植物内的运动中涉及的多功能蛋白质[MaiaI.G.,Haenni A.和Bernardi F.,(1996)普通病毒学杂志(Journal ofGeneral Virology)77:1335～1341]。
夏南瓜黄色花叶病毒(ZYMV)是马铃薯Y病毒组的一员，它在全世界大批生产的葫芦科植物中引起破坏性的流行病。构建了ZYMV的全长克隆(从它产生了感染性转录物)[Gal On A.,Antignus Y.,Rosner A.和Raccah B.(1991)普通病毒学杂志72:2639～2643]。
发现了，在CP的N端区内保守DAG(天冬氨酸-丙氨酸-甘氨酸；Asp-Ala-Gly)三联体中位置10处用苏氨酸(Thr)替代丙氨酸(Ala)残基有效地消除了ZYMV的蚜虫传播性[Gal On A.,Antignus Y.,Rosner A.和Raccah B.(1992)普通病毒学杂志73:2183～2187]。此外，在ZYMV的感染性克隆的HC-Pro基因中位置309处用Ala替代Thr引起蚜虫传播性但未改变病毒积累和症状发展[Huet H.,Gal On A.,MeiriE.,Lecoq H.和Raccah B.(1994)普通病毒学杂志75:1407～1414]，不过比ZYMV的CP内DAG三联体中的替代效果更小。
意外地发现了，在马铃薯Y病毒组HC-pro基因的保守FRNK盒中的氨基酸替代使得能构建感染性马铃薯Y病毒组构建物，当引入植物时，它引起很小的或者不引起症状发展，并且它不引起植物中的病毒积累。因此，该感染性构建物是一种独特的马铃薯Y病毒组构建物，它对于植物交叉保护和植物内外源核酸的瞬时表达来说都是特别优越的。它比现有的任何保护方法具有改善的抗ZYMV恶性株感染的保护能力，明显更安全，而且比天然病毒对环境更无害，不引起各种葫芦科植物中的症状发展，并且是稳定的(通过植物传代数代后未发现回复体病毒)。
本发明涉及适用于植物交叉保护的重组马铃薯Y病毒组感染性核酸(优选为cDNA或RNA)构建物，它包括全长克隆，其特征在于它的HC-Pro基因保守FRNK盒序列包含一个替代(优选是Arg的替代)。优选地，该构建物进一步包含一个替代，它有效地消除了蚜虫传播性，例如在CP的N端区内保守DAG三联体中位置10处Ala残基的替代或者在ZYMV内HC-pro中的位置309处Thr的替代。
本发明的重组构建物可能适用于植物交叉保护(尤其抗ZYMV的恶性株)和植物内外源核酸的瞬时表达，其中，全长克隆在任何位置具有插入它的DNA或RNA的序列，或者其中，从全长克隆除去了任何病毒基因(缺损RNA)。该全长克隆可以是任何马铃薯Y病毒组(优选为ZYMV)的全长克隆。本发明还涉及一种提供抗植物中病毒感染的保护作用的方法，它包括用重组马铃薯Y病毒组感染性构建物通过机械接种或通过轰击来接种植物。
本发明还涉及将外源核酸引入植物的方法，它包括用全长克隆感染植物，或者用全长克隆(从该全长克隆除去了任何病毒基因)与全长克隆或含有全长克隆的病毒一起共感染植物。
本发明还涉及一种生产马铃薯Y病毒组的温性株的方法，它包括用前面权利要求任一项中定义的重组马铃薯Y病毒组感染性构建物接种植物，再收集生产的子代，而且涉及按该方法产生的病毒。
本发明进一步涉及用于植物接种或用于在植物中瞬时表达外源核酸的组合物，该组合物包含作为活性组分的重组构建物或含有该重组构建物的病毒。
本发明涉及适用于植物交叉保护和适用于在植物中瞬时表达外源核酸的重组马铃薯Y病毒组感染性核酸构建物。本发明进一步涉及用于植物接种或用于在植物中瞬时表达外源核酸的组合物，该组合物包含作为活性组分的重组构建物或含有该重组构建物的病毒。
本发明的构建物包含全长马铃薯Y病毒组克隆，它包括HC-pro基因内保守FRNK盒序列中的一个替代，优选应用具有大侧链的氨基酸或得自疏水基的氨基酸(Ile)替代(FRNK盒中的)Arg。FRNK盒中的该替代强烈影响症状发展的严重性但不引起病毒在植物中的积累。优选地，本发明的构建物还包括一个替代，它有效地消除蚜虫传播性，例如，在CP的N端区内保守DAG(Asp-Ala-Gly)三联体中位置10处Ala残基被Thr替代或者在ZYMV的HC-pro中位置309处Thr被Ala替代。
构建了ZYMV的恶性株的全长感染性克隆并置于下列启动子的控制之下噬菌体启动子，例如T7 RNA聚合酶启动子[Gal On A.,AntignusY.,Rosner A.和Raccah B.(1991)普通病毒学杂志72:2639～2643],细菌启动子或在植物内有效的启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子[Gal On A.,Meiri E.,Huet H.,Hua W.J.,Raccah B.和GabaV.(1995)普通病毒学杂志76:3223～3227]。
在本文提出的工作中，首次暗示FRNK盒在症状发展中的重要性，意外地未引起植物内病毒的积累。由于马铃薯Y病毒组的HC-Pro基因内FRNK盒的高度保守的序列，不仅在ZYMV中用Ile替代位置180的Arg(本文描述的工作中所阐述的)，马铃薯Y病毒组的FRNK盒中的任意替代都应当对症状发展有影响。
基于马铃薯Y病毒组的高度保守的基因组、组构和基因功能，可总结出HC-pro基因中的保守FRNK盒在所有马铃薯Y病毒组中具有相同的功能(也许作为受体)。因此，在任何马铃薯Y病毒组中的FRNK盒内的替代都应当对症状发展具有类似的效果。经济上重要的马铃薯Y病毒组的成员例如有BCMV(豆科普通花叶病毒)、BYMV(豆科黄色花叶病毒)、BtMV(甜菜花叶病)、MWMV(摩洛哥西瓜花叶病)、OYDV(葱属黄矮病)、PRSV(番木瓜环斑病)、PStV(花生条纹)、PepMoV(胡椒属斑驳病)、PVMV(胡椒叶脉斑驳病)、CGVBV(豇豆属绿脉结病)、GEV(基本眼点(ground eyespot))、ISMV(鸢尾属恶性花叶病)、JGMV(石茅高粱花叶病)、LYSV(欧洲韭黄条纹)、LMV(莴苣属花叶病)、MDMV(玉米矮花叶病)、PPV(Plum box)、PVA(马铃薯A)、PVV(马铃薯V)、PVY(马铃薯Y)、SbMV(大豆花叶病)、SCMV(甘蔗花叶病)、SPFMV(甘薯羽毛状斑驳病)、TEV(烟草病毒病)、TVMV(烟草叶脉成斑)、TBV(郁金香碎色病毒)、TuMV(芜菁花叶病)、WMV-2(西瓜花叶病毒-2)、YMV(薯蓣花叶病)、ZYFV(夏南瓜黄斑)。
感染性克隆可以是RNA转录物或cDNA构建物，不过，感染性转录物的应用是效率更小的体外方法。
按本发明，一种提供抗植物中病毒感染的保护作用的方法包括用重组马铃薯Y病毒组感染性构建物接种植物，例如，通过机械接种或者通过轰击。
包含作为活性组分的本发明构建物的组合物可被用于优越的植物交叉保护(尤其抗ZYMV的恶性株感染)和用于在植物中瞬时表达外源核酸。用于将所述构建物引入植物(通过轰击感染它们)的组合物是一种含水的组合物，它包含大致等量的构建物、盐(例如硝酸钙)和粒子(例如钨、金)。用于通过机械接种将所述构建物引入植物的组合物包括受感染的植物组织。
本发明的构建物可被进一步用作在植物中瞬时表达外源核酸即基因的载体。本发明的构建物是高度感染性的，在受感染植物中不诱发症状，而且不被蚜虫传播。
包含作为活性组分的该克隆的组合物的应用提供了一种将外源核酸瞬时表达入受感染植物的有效的、安全的和对环境无害的方法。因此，该构建物的进一步应用可能是在马铃薯Y病毒组的缺损RNA分子内表达外源序列或基因。缺损RNAs是这样的病毒RNA基因组它们缺失某些病毒基因，但它们与完全辅助病毒(全长亲代病毒)一起能促进它们包含的序列的表达。缺损RNAs得自辅助病毒基因组，但仍然需要存在完全辅助病毒用于在植物细胞中复制。本发明的构建物可能具有从全长克隆除去的基因，于是就可起支持经由马铃薯Y病毒组缺损RNA表达外源基因的作用，即，通过用全长克隆(从它除去了任何病毒基因)与全长克隆或含有全长克隆的病毒一起共感染植物来表达。
按本发明，一种将外源核酸引入植物的方法包括用全长克隆(已在其中插入了DNA或RNA的任意序列)感染植物或者用全长克隆(已从它除去了任何病毒基因)与全长克隆或含有全长克隆的病毒一起共感染植物。
按本发明，一种生产马铃薯Y病毒组的温性株的方法包括用重组马铃薯Y病毒组感染性构建物接种植物，再收集生产的子代。
将通过下列试验和图进一步描述和阐释所述发明。这些试验和图不是用来限制本发明的范围，而是仅仅为了阐述和阐明它。
图1是ZYMV感染性cDNA的四种构建物(a～d)的示意图。
图1是ZYMV感染性cDNA的四种构建物(a～d)的示意图。空心条和有条纹的条分别表示FLC中的ZYMV-NAT和ZYMV-WK序列。给出了相关的限制酶和氨基酸变化。右边，示出了南瓜中的症状严重性，即，从很严重(+++++)到轻微(+)。示出了用于诱变的引物的序列。
实施例1-ZYMV的全长克隆(FLC)ZYMV的全长克隆(FLC)中突变体的构建代表ZYMV-WK株的HC-Pro序列[Huet H.,Gal On A.,Meiri E.,LecoqH.和Raccah B.(1994)普通病毒学杂志75:1407～1414]的构建物被置于感染性FLC中的T7 RNA启动子之下。为了用那些构建物达到更高的感染率，以得自pZYHC(-)克隆的适当片段[Huet H.,Gal On A.,MeiriE.,Lecoq H.和Raccah B.(1994)普通病毒学杂志75:1407～1414]置换了得自35SZYMVNOS cDNA的FLC的片段BstⅪ/AgeⅠ[Gal OnA.,Antignus Y.,Rosner A.和Raccah B.(1991)普通病毒学杂志72:2639～2643与Gal On A.,Meiri E.,Huet H.,Hua W.J.,Raccah B.和Gaba V.(1995)普通病毒学杂志76:3223～3227]。应用引物5＇-ATGTTCATAAATAAGCGCTCTAG3＇(在氨基酸Ile下划线,以黑体表示Eco47Ⅲ的单一限制位点)在亚克隆pksM16B[Gal On A.,Antignus Y.,Rosner A.和Raccah B.(1991)普通病毒学杂志72:2639～2643]的ssDNA模板上引入定点诱变。通过BamHⅠ/BstEⅡ双消化携带突变的克隆pksM16B,将获得的片段(1.4kb)引入35SZYMVNOS cDNA[Gal OnA.,Meiri E.,Huet H.,Hua W.J.,Raccah B.和Gaba V.(1995)普通病毒学杂志76:3223～3227]中的相同位点上。ZYMV AGl的植物、机械接种或轰击接种和症状外观应用处于子叶期的温室生长的夏南瓜(Curcurbita pepo.L.cvMa’ayan)、黄瓜(Cucumis sativus L.cv.Bet Alpha；Shimshon；Delila)、甜瓜(Cucumis melo L.cv.Arava)和西瓜(Citrullus lanatusSchad cv.Malali)植物。将接过种的植物保持在约25℃连续光照下的生长室内。每天检查植物的直观症状发展。
如Gal-On等(1995)前述那样进行轰击接种。通过应用到预先撒有金刚砂的子叶上的汁液接种(100mg/ml)进行了被重组病毒感染的植物的机械接种。交叉保护试验如Lecoq等(1991)所述测试了通过ZYMV-AG1株的交叉保护。用35S-AG1以0.1μg/μl轰击处于充分伸展的子叶期的南瓜苗。一周后，按Antignus Y.,Raccah B.,Gal-On A.和Cohen S.(1989)寄生植物(Phytoparasitica)17:287～289中描述的方法通过5～7只蚜虫(桃蚜)/植物在温室中感染它们。子代病毒体中突变的测定为了确认病毒RNA中突变的存在，从感染的叶组织提取了全部mRNA。按Huet等(1994)描述的那样进行了RT-PCR合成。酶联免疫吸附测定法评估ZYMV效价摘取7～10d.p.i.南瓜ZYMV和黄瓜ZYMV感染的植物叶片，按Antignus等(1989)描述的那样将均化的组织进行ELISA。
以前，序列比较已证实在恶性田间株(ZYMV-JV)和温性田间株(ZYMV-WK)之间、在HC-pro基因的455个氨基酸的序列中有四个氨基酸改变了。替代包含两个取代即天冬氨酸(Asp)148和Arg 180的ZYMV-WK的HC-Pro的片段(BstⅪ/BstEⅡ片段)，减小了南瓜植物中病毒的症状表现而不引起病毒积累。为了辨别Asp 148或Arg 180这两个取代哪一个引起症状发展，通过定点诱变以Ile替代了FRNK盒中的Arg 180(图1，克隆d)。
包含了以Ile替代Arg 180的工程化病毒被称为ZYMV-AG1。该新的株不引起黄瓜(三个不同品种)、甜瓜和西瓜中的症状发展。病毒确实积累到与野生型ZYMV-JV同样高的水平。因此，认为第二个氨基酸差异(位置148上的Asp)对于把症状从温性改变成恶性来说不是必要的。
为了检验温性病毒ZYMV-AG1中的氨基酸变化的存在，而且为了防止蚜虫传播，在位置550 nt(从HC-Pro基因的5＇开始)引入新的限制位点Eco47Ⅲ，并且相应地以DTG替代CP中的DAG基序(图1)。
该新的工程化病毒(AGl)和野生型恶性株(JV)在不同葫芦科植物的系统感染的叶中积累到相似水平(表1)。所以，可总结出，将氨基酸Arg 180更换成Ile的点突变强烈影响症状发展的严重性，但不影响ZYMV病毒在植物中的运动和复制。由马铃薯Y病毒组FRNK盒中的点突变得出的惊人结果阐明了该工作中首次得到了不能从仅仅已知的序列比较(它示出了恶性田间株和温性田间株之间的氨基酸变化)推导的结果。
通过感染数百棵南瓜植物和几十棵黄瓜植物测试了ZYMV-AG1中的氨基酸Arg 180更换成Ile的稳定性(表2)。HC-Pro中Ile 180突变的存在是通过测序证实的(未示出信息)。用ZYMV-AG1机械接种的葫芦科植物或者通过用ZYMV-AG1株进行粒子轰击接种的葫芦科植物甚至在植物的整个生长期确实显示温性症状表象(表2)。通过测序或者间接通过用限制酶Eco47Ⅲ消化RT-PCR扩增的片段证实了病毒体基因组中Ile 180突变的存在(图1)。从病毒积累的水平可见，工程化ZYMV-AG1株的复制和运动都保持较高(与野生型ZYMV一样)。这些结果启示在病毒突变的基因组中，未施加引起回复的选择性压力。
在交叉保护试验中研究了新生产的温性株(ZYMV-AG1)保护以抗ZYMV的恶性株(JV)攻击接种的能力。大多数受保护的植物在用恶性株攻击后确实显示轻度症状(96％保护)。用ZYMV-AG1株感染并在一周后用JV株攻击的47棵植物中的两棵在接种约一个月之后表现出严重症状(表3)。
在小规模田间试验中研究了保护作用，其中，使受保护的植物暴露于田间接种。大约40％未保护的对比植物被感染了，而受保护的植物都未显示严重症状。因此，在受保护的植物中未观察到果实损坏(表3)。以前的研究表明在典型的交叉保护现象中，保护株和攻击病毒株二者密切相关[Perring T.M.,Farrar C.A.,Blua M.J.,Wang H.L.和Gonsalves D.(1995)作物保护(Crop Protect ion)14no.7,601～606]。这是对株与株之间进行交叉保护的首次报导，其中，所述株具有相同的序列(包括外壳蛋白序列)，仅仅在非结构蛋白(所述HC-Pro)中有一个氨基酸不同。2)甜瓜中的交叉保护种植了甜瓜(Cucumis melo L.cv.Ofir)苗，应用ZYMV-WK和重组病毒ZYMV-AG1感染。在种植前将这些病毒喷到甜瓜苗上。然后，将这些苗与未处理的(对比)苗一起种植。
在三周后，用野生型病毒(ZYMW-JV)机械法攻击一半植物，另一半未被攻击而用于测试自然感染。
开始试验30天后，研究了这样的参数例如，植物尺寸和野生型病毒感染的程度。未通过弱化病毒(WK)处理的、用ZYMV-JV感染的植物尺寸小，表现出明显的感染症状。用重组病毒(ZYMV-AG1)处理的植物未显示感染症状。3) 在植物中外源基因通过ZYMV-AG1克隆的表达为了在受感染的植物中表达外源基因，将PstⅠ位点插入ZYMV-AG1的NIb基因和CP基因之间。应用包含PstⅠ限制位点的引物通过PCR扩增GFP[绿色荧光蛋白(green flurocent protein)]报导基因和Bar基因[它赋予对非选择性除草剂“双丙氨酰膦”(商品名为BASTA)的抗性]，将这两种基因插入PstⅠ位点。
通过用包含GFP报导基因或Bar基因的ZYMV-AG1轰击将植物接种。
生化分析表明，GFP和Bar基因被高度而稳定地表达了。甚至在数代后，都未发现重组温性病毒的回复体，而且，所述报导基因和Bar的表达保持高而稳定。表达GFP的植物发光，还发现表达Bar基因的植物抗除草剂“双丙氨酰膦”。
表1．在葫芦科植物中ZYMV-JV株和ZYMV-AG1株之间病毒积累的比较试验试验植物的ZYMV-JV＃ZYMV-AG1＾ZYMV-WK～数目恶性 温性 温性编号 JV,AGI,WK ELISA OD(405)1s+ 11, 6, 6, 0.9*(0.41)**0.5(0.19) 0.7 (0.18)2s2, 9, 8,1(0.4) 0.7(0.48) -3s3, 10, 4, 0.3 (0.08)0.9(0.27) 1.33(0.13)4s9, 9, 9, 0.51 (0.4) 0.46(0.21) 0.59(0.3)5s9, 9, -0.56 (0.07)0.7(0.09) -6s9, 8, -0.82 (0.09)0.95(0.09)-7c6, 7, -0.7 (0.07)0.81(0.2) -# 在以色列的约旦流域(JV)发现的ZYMV的恶性株。＾ZYMV的工程化病毒。～由Lecoq等(1991)描述的ZYMV弱株。* 通过ELISA从11棵植物检测的0.D(405)的平均值。**标准偏差(括号中的)。+s和c分别是南瓜和黄瓜试验植物。
表2．ZYMV-AG1病毒在植物中的稳定性试验的植物数植物品种用35SAG1*直观症状#Ilu-180突变的轰击轻微|严重 分子分析南瓜402 3980 10黄瓜105 1030 5甜瓜 30 300 3总计537＾ 531+ 0 18* 接种后大约一个半月观察的和通过ELISA检测的直观症状。# 由Eco47Ⅲ限制酶通过RT-PCR的消化证实了Ilu突变的存在。＾轰击的植物总数。+ 感染的植物总数。
表3．在温室试验中，在南瓜中用温性株ZYMV-AGl(诱导)抗恶性株ZYMV-JV(攻击)的交叉保护作用。
试验的植物数试验 诱导 #攻击症状～果实损坏编号*ZYMV-AG1 ZYMV-JV轻微|严重a) 47 474521a) 14 - 15 0a) -5 5 5b) 15 15 1400b) 5- 5 0b) -5 5 5c) 43田间接种 43 0c) -6 66c)18健康的 - 田间接种 77a、b和c是三个独立的试验，a和b都是在温室中，c是在田间小试验区进行的，c是两个试验之和，其中，对保护的植物(AGI)进行田间接种。～表现果实损坏的植物数。# 通过蚜虫接种。
权利要求
1．一种适用于植物交叉保护的重组马铃薯Y病毒组感染性核酸构建物，它包含全长克隆，其特征在于，它的HC-Pro基因保守FRNK盒序列包含一个替代。
2．权利要求1的重组构建物，其中，所述核酸是cDNA或RNA转录物。
3．权利要求1的重组构建物，其中，所述保守FRNK盒中的替代是Arg的替代。
4．权利要求3的重组构建物，其中，Arg被疏水基的氨基酸或具有大侧链的氨基酸替代了。
5．权利要求4的重组构建物，其中，Arg被Ile替代了。
6．权利要求1的重组构建物，它进一步包含一个有效地消除蚜虫传播性的替代。
7．权利要求5和6的重组马铃薯Y病毒组感染性核酸构建物，其中，所述马铃薯Y病毒组是ZYMV。
8．权利要求6和7的重组构建物，其中，所述有效地消除蚜虫传播性的替代是CP的N端区内保守DAG三联体中位置10处Ala残基的替代或者ZYMV内HC-pro中位置309处Thr的替代。
9．权利要求8的重组构建物，其中，该构建物是ZYMV-AGl。
10．适用于植物交叉保护的权利要求9的重组构建物，其中，所述交叉保护抗恶性ZYMV株。
11．进一步适用于在植物中瞬时表达外源核酸的、权利要求1～10的重组构建物，其中，所述全长克隆在任何位置具有插入它的DNA或RNA的序列，或者其中，从该全长克隆除去了任何病毒基因。
12．权利要求1～6和权利要求11的重组马铃薯Y病毒组感染性核酸构建物，其中，所述马铃薯Y病毒组选自BCMV、BYMV、BtMV、MWMV、OYDV、PRSV、PStV、PepMoV、PVMV、CGVBV、GEV、ISMV、JGMV、LYSV、LMV、MDMV、PPV、PVA、PVV、PVY、SCMV、SPFMV、TEV、TVMV、TBV、TuMV、WMV-2、YMV和ZYFV。
13．一种提供抗植物中病毒感染的保护作用的方法，它包括用前述权利要求任一项定义的重组马铃薯Y病毒组感染性构建物接种植物。
14．权利要求13的方法，其中，接种植物是通过机械接种或者通过轰击进行的。
15．一种将外源核酸引入植物的方法，它包括用权利要求11中定义的全长克隆感染植物，或者用权利要求1中定义的、已除去了任何病毒基因的全长克隆与全长克隆或含有全长克隆的病毒一起共感染植物。
16．一种生产马铃薯Y病毒组的温性株的方法，它包括用前述权利要求任一项定义的重组马铃薯Y病毒组感染性构建物接种植物，再收集生产的子代。
17．一种病毒，它包含权利要求1定义的和按权利要求16生产的重组构建物。
18．用前述权利要求定义的重组构建物按权利要求12的方法接种的产品。
19．权利要求18的产品，其中，该产品是葫芦科植物。
20．用于植物接种或者用于在植物中瞬时表达外源核酸的组合物，该组合物包含作为活性组分的、权利要求1～12的重组构建物或者权利要求17的含有重组构建物的病毒。
全文摘要
本发明涉及适用于植物交叉保护的重组马铃薯Y病毒组感染性核酸(优选为cDNA或RNA)构建物,它包含全长克隆,其特征在于,它的HC－Pro基因保守FRNK盒序列包含一个替代(优选为Arg的替代)。优选地,该构建物进一步包含一个有效地消除蚜虫传播性的替代。本发明进一步涉及一种利用上述构建物生产马铃薯Y病毒组的温性株的方法,还涉及一种应用所述构建物保护植物以防病毒感染和在植物中瞬时表达外源核酸(基因)的方法。优选地,本发明涉及一种交叉保护葫芦科植物以抗ZYMV感染的方法。本发明还涉及一种提供抗植物中病毒感染的保护作用的方法,它包括:用重组马铃薯Y病毒组感染性构建物通过机械接种或者通过轰击来接种植物。
文档编号C12N15/40GK1303433SQ99806606
公开日2001年7月11日 申请日期1999年3月30日 优先权日1998年4月7日
发明者A·盖尔－昂 申请人:以色列国农业部