专利名称：一种l-精氨酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种L-精氨酸的制备方法，尤其涉及一种通过基因 重组技术改进大肠杆菌积累精氨酸的能力，并利用改进的大肠杆菌 发酵生产L-精氨酸的方法。
背景技术：
L-精氨酸是生物代谢途径中一种重要的氨基酸，也是一种工业 上用途广泛的氨基酸，可用于食品及制药等行业，生产氨基酸注射 液、保肝护肝剂等，有防提高人体免疫力、防治心血管疾病等作用， 并有可能是治疗肿瘤的一种潜在药物成分。
L-精氨酸发酵生产所用的菌种主要有谷氨酸棒杆菌、黄色棒杆 菌、钝齿棒杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌等。这些菌种一般通过筛选 抗精氨酸类似物的菌种以及诱变得到，也有些使用抗其它药物的突 变体或基因重组技术改造的菌株。
细菌的精氨酸生物合成途径是由L-谷氨酸开始，经过八步酶催化 反应最终生成L-精氨酸。精氨酸合成途径的酶一般都是受到严格调 控的，酶基因的转录会受到精氨酸或精氨酸与阻遏物复合物的阻遏， 酶蛋白的催化活性也会受到精氨酸的反馈抑制。
基因工程改造菌种多采用大肠杆菌，其中一般是在重组的大肠杆 菌中引入一种编码细菌精氨酸生物合成途径的酶的基因以提高某种酶的活性，或者引入经过人工突变的酶基因，其中酶与精氨酸结合 的位点得到改变，使精氨酸的抑制作用减弱或消除，从而大肠杆菌 积累L-精氨酸的能力得到提高。
在细菌的代谢过程中，合成途径的各步的酶通常都会受到精氨酸 的不同程度的反馈抑制。在大肠杆菌中，精氨酸抑制其合成途径的 关键酶是第一步的乙酰谷氨酸合成酶，它同时受精氨酸阻遏表达及 活性抑制，其余各步的酶受精氨酸的抑制作用较小。
在谷氨酸棒杆菌中，精氨酸合成途径的关键酶是第二歩的乙酰谷 氨酸激酶，它受到精氨酸的阻遏和抑制。而在谷氨酸棒杆菌中第一 歩的乙酰谷氨酸合成酶和第五歩的鸟氨酸乙酰转移酶实际上是由同 一个酶完成的，它基本上不受阻遏也不受抑制。
在细菌中还普遍存在一个精氨酸操纵子的调节基因argR，在不同 的细菌中有不同的功能，在大肠杆菌中，argR是一个负调控基因， 它会抑制细胞中精氨酸的合成。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种耗时短、安全可靠、环保 型、过程简单、产量高的L-精氨酸的制备方法。
本发明要解决的技术问题是通过以下技术方案实现的 本发明通过对大肠杆菌进行基因重组改性，敲除了大肠杆菌中
的argR基因，改性后的大肠杆菌能大量发酵生产L-精氨酸。所述大 肠杆菌的改性方法包括如下歩骤
(1)构建含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体(2 )将含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体转化到大肠杆菌中， 筛选阳性转化子。
在上述制备方法中，所述改性大肠杆菌的培养条件优选是在
通气条件下培养16-72小时，pH值控制在6.5-7.5，温度30-37°C 。
在上述制备方法中，步骤(1)具体包括如下步骤
利用聚合酶链反应PCR的方法，以谷氨酸棒杆菌DNA为模板， 扩增乙酰谷氨酸合成酶基因，PCR用的上游引物 CTACATATGGCAGAAAAAGGCATTAQSEQNO:l)，其中5'端加入 了 Ndel限制酶切位点；下游引物CTAGGATCCTTAAGTG CTGTACGCGGAGT(SEQNO:2)，其中5'端加入了 BamHI限制酶切 位点；PCR条件94。C30秒；60°C 30秒；72。C90秒；扩增30个 循环，得到乙酰谷氨酸合成酶基因；
将乙酰谷氨酸合成酶基因用Ndel和BamHI双酶切，与用同样 双酶切的质粒载体pET-9a连接，得到含有乙酰谷氨酸合成酶基因的 表达载体，称为pET-argJ。
在上述制备方法中，歩骤(2)具体包括如下步骤 选取表达载体pET-argJ上的卡那霉素抗性基因作为选择标记，
将乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因一起整合到大肠杆菌
基因组中的重组单元；
PCR上游引物序列为(SEQ NO:3):
6GTCACTGGAGCGATATCATACAGAGAGAGTTCTGAACCT GAAGGCAGTTGGGTTTTTAACAGTAGTGCAMTAGCTCACGCT GTAGGTATCTCAG;
PCR下游引物序列为(SEQN0:4):
TCACTATAGG;
以表达载体pET-argJ为模板，用以上两条序列进行PCR扩增； PCR反应条件为94°C 30秒；72°C 4分钟；扩增30个循环，得到 两端带有argR基因同源重组序列、包含乙酰谷氨酸合成酶基因和卡 那霉素抗性基因的重组单元；
将重组单元导入到大肠杆菌感受态细胞中；
筛选重组单元插入到大肠杆菌argR基因位点的阳性转化子。
对于改性后的大肠杆菌，可以采用生产精氨酸类似的方法进行 发酵培养，并在培养液中纯化L-精氨。培养所需的碳源一般可以使 用糖类，如葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖及淀粉水解产物等。氮源可 以使用无机氮源如铵盐、氨水等，也可使用有机氮源如蛋白胨、大 豆水解物、玉米桨等。另外还需要适量的微量元素类物质，如镁离 子、铁离子、钙离子、酵母提取物及维生素B1等。
从发酵液中分离纯化L-精氨酸的方法可以采用浓縮结晶法、离子 交换树脂吸附法以及其它己知的方法。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明利用PCR技术扩增了来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰谷氨酸合成酶基因，构建了 大肠杆菌表达载体，导入大肠杆菌中，利用同源重组方法，使乙酰
谷氨酸合成酶基因表达单元定点插入整合到大肠杆菌的argR基因位 点，使得外源基因在整合的同时破坏了argR基因的结构，即相当于 敲除了 argR基因。插入的基因表达单元表达谷氨酸棒杆菌来源的乙 酰谷氨酸合成酶，完成精氨酸合成途径第一步由谷氨酸到乙酰谷氨 酸的催化功能而不受终产物L-精氨酸的反馈抑制。
利用这种改性大肠杆菌进行发酵，能够产生并在培养基中积累 L-精氨酸，通过分离纯化步骤收集L-精氨酸。
本发明的大肠杆菌改性方法避免了将整个表达载体导入大肠杆 菌带来的基因拷贝数过高，使基因过度表达，从而干扰代谢途径中 其它酶基因的表达。可提高菌种的遗传稳定性。
图1为pET-argJ的结构图谱。
具体实施例方式
实施例l:含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体的构建
利用PCR的方法，以谷氨酸棒杆菌(ATCC 13032) DNA为模 板，扩增乙酰谷氨酸合成酶基因。PCR用的上游引物
了 Ndel P艮制酶切位点；下游引物CTAGGATCCTTAAGTG CTGTACGCGGAGT(SEQNO:2)，其中5'端加入了 BamHI限制酶切 位点。PCR条件94。C30秒；60。C30秒；72。C90秒。扩增30个 循环。得到长度为1.2kb的DNA片段，此即为谷氨酸棒杆菌的乙酰谷氨酸合成酶基因。将此PCR产物用NdeI和BamHI双酶切、纯化 后的DNA片段与用同样双酶切的质粒载体pET-9a (购自Novagen 公司)连接，连接产物转化用氯化钙处理的大肠杆菌DH5a感受态 细胞。转化后的细胞涂布到含有10pg/mL卡那霉素的固体LB平板 培养基上。固体LB培养基成分为1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯 化钠，2%琼脂。37"C培养16-20小时后，挑取数个转化子单菌落， 分别培养、提取质粒DNA，用T7通用引物进行DNA序列测定。筛 选序列正确的质粒，即为含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体， 将其命名为pET-argJ。 pET-argJ的结构图谱见图1。 实施例2:将乙酰谷氨酸合成酶基因表达单元引入大肠杆菌
本发明中所用的出发菌株为大肠杆菌，是通过诱变筛选得到的 L-精氨酸生产菌株。实施例1中构建的表达载体pET-argJ上带有完 整的可在大肠杆菌中表达来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰谷氨酸合成酶 基因的表达单元。为了方便转化子的筛选，我们需要一个选择标记， 因此选取表达载体pET-argJ上的卡那霉素抗性基因作为选择标记， 将乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因一起作为整合到大肠 杆菌基因组中的重组单元。
采用表达载体上卡那霉素抗性基因启动子5'端序列作为PCR 物ATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAG; T7启动子上游序列作 为PCR下游引物GCGAAATTAATACGACTCACTATAGG，就可以 将包含乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因的重组单元扩增为了定点整合到大肠杆菌的argR基因上，需要在PCR上、下 游引物上再分别加上一段argR基因上、下游同源序列。
选取上游同源序列为 GTCACTGGAGCGATATCATACAGAGAGAGTTCTGAACCTGAA GGCAGTTGGGTTTTTAACAGTAGTGCAA;
选取下游同源序列为
ACAGCACCAAACTTGGTCAACATCCGC;
因此，加上了 argR同源序列的PCR上游引物序列为:
GGTATCTCAG(SEQ NO:3);
加上了 argR同源序列的PCR下游引物序列为:
TCACTATAGG(SEQ NO:4);
以实施例1中构建的质粒表达载体pET-argJ为模板，用以上两 条长序列PCR弓1物进行PCR扩增。采用高保真聚合酶Pyrobest DNA polymerase (Takara公司)，两步法进PCR反应。PCR反应条件为 94°C 30秒；72°C 4分钟。扩增30个循环。得到长度为3.3kb的DNA 片段，即为两端带有argR基因同源重组序列、包含谷氨酸棒杆菌的 乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因的重组单元。将PCR扩增得到的同源重组单元DNA用1%琼脂糖凝胶电泳分 离纯化，分离3.3kb的DNA片段，以清除残留的模板质粒DNA。 采用电激转化法将纯化的同源重组单元导入到大肠杆菌感受态细胞 中。按照实施例1中相同的方法涂布在含卡那霉素的LB平板培养 基上，37"C培养16-20小时。由于转化用的重组单元本身不能在大 肠杆菌中自主复制，所以必须是发生了同源重组整合到大肠杆菌基 因组中的转化子才能长出单菌落。虽然这种转化的效率很低，但仍 能获得少量转化子。
为了鉴定重组表达单元是否准确地插入到大肠杆菌的argR基因 位点，采用菌落PCR方法对所有转化子进行鉴定。采用argR基因 两端外围的序列作为引物(ATATGGCTCAGATCGACAGC和 AGCACCAGATTCTTCAATGG)，取少量转化子菌落为模板进行 PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，如果PCR产物大小为 0.8kb，则表明外源基因未能准确插入到argR基因中；如果PCR产 物大小为3.4kb，则证明带有谷氨酸棒杆菌的乙酰谷氨酸合成基因的 重组表达单元已经正确插入到大肠杆菌的argR基因位点，也就是说， 同时敲除了大肠杆菌的argR基因。通过PCR鉴定筛选，得到了正 确的转化子，即改性大肠杆菌菌株，从而完成了本发明。 实施例3:改性大肠杆菌菌株的摇瓶发酵产精氨酸试验
将实施例2所得改性大肠杆菌与普通大肠杆菌在相同条件进行 摇瓶发酵，比较它们的产L-精氨酸的能力。将两个菌种各自接一环 到5mL液体LB培养基中，32"C振荡培养过夜。次日，将种子液分别接种到50rnL摇瓶发酵培养基中。摇瓶发酵培养基成分葡萄糖
10%，硫酸铵5%，磷酸二氢钾0.5%，酵母浸粉0.5%，硫酸镁0.05 %，硫胺素0.1g/L，硫酸亚铁0.02g/L，碳酸钙1%， pH7.2;接种后 于220-240rpm， 32"培养72小时。培养基中积累的L-精氨酸的量 35g/L。如表1所示。
表1改性大肠杆菌菌株与亲本产酸量比较
菌株L-精氨酸产量(g/L)
普通大肠杆菌26
改性大肠杆菌菌株35
可见，改性大肠杆菌菌株产生L-精氨酸的能力明显提高。
12Untitled—ST25
SEQUENCE LISTING <110〉 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 〈120〉 一种L-精氨酸的制备方法 <130> <160〉 4
<170〉 Patentln version 3. 5
<210> 1
<211〉 26
<212〉 DNA 〈213>人工序列
<400> 1
ctacatatgg cagaaaaagg cattac 26
<210> 2
〈211〉 29
〈212〉 DNA
<213> 人工序列
〈400〉 2
ctaggatcct taagtgctgt acgcggagt 29
<210〉 3
〈211> 95
〈212〉 DNA <213>人工序列
<400〉 3
gtcactggag cga'tatcata cagagagagt tctga.a.cctg aaggcagttg ggtttttaac 60 agtagtgcaa atagctcacg ctgtaggtat ctcag 95
<210〉 4
<211〉 96
〈212> 腿
<213> 人T.序列
〈400〉 4
tggcaggcag taaaccattt ccatt"ttggc attgcgtgta cgtacagcac caaacttggt 60 caacatccgc gcgaaattaa tacgactcac tatagg %
权利要求
1、一种L-精氨酸的制备方法，其特征是培养经过改性的大肠杆菌发酵生产L-精氨酸，所述大肠杆菌的改性方法包括如下步骤(1)构建含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体(2)将含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体转化到大肠杆菌中，筛选阳性转化子。
2、 如权利要求1所述的L-精氨酸的制备方法，其特征在于所述培养的条件是在通气条件下培养16-72小时，pH值控制在6.5-7.5， 温度30-37。C。
3、 如权利要求1所述的L-精氨酸的制备方法，其特征在于步骤 (1)包括如下步骤利用PCR的方法，以谷氨酸棒杆菌DNA为模板，扩增乙酰谷 氨酸合成酶基因，PCR 用的上游引物 CTACATATGGCAGAAAAAGGCATTAG其中5'端加入了 Ndel限 制酶切位点；下游引物CTAGGATCCTTAAGTG CTGTACGCGGAGT，其中5'端加入了 BamHI限制酶切位点；PCR 条件94。C30秒；6CTC30秒；72。C90秒；扩增30个循环，得到 乙酰谷氨酸合成酶基因；将乙酰谷氨酸合成酶基因用Ndel和BamHI双酶切，与用同样 双酶切的质粒载体pET-9a连接，得到含有乙酰谷氨酸合成酶基因的 表达载{本，称为pET-argJ。
4、 如权利要求1所述的L-精氨酸的制备方法，其特征在于步 骤(2)包括如下歩骤选取表达载体pET-argJ上的卡那霉素抗性基因作为选择标记， 将乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因一起整合到大肠杆菌 基因组中的重组单元；PCR上游引物序列为 GTCACTGGAGCGATATCATACAGAGAGAGTTCTGAACCTGAA GGCAGTTGGGTTTTTAACAGTAGTGCAAATAGCTCACGCTGTA GGTATCTCAG;PCR下游引物序列为TCACTATAGG;以表达载体pET-argJ为模板，用以上两条序列进行PCR扩增； PCR反应条件为94°C 30秒；72°C 4分钟；扩增30个循环，得到 两端带有argR基因同源重组序列、包含乙酰谷氨酸合成酶基因和卡 那霉素抗性基因的重组单元；将重组单元导入到大肠杆菌感受态细胞中； 筛选重组单元插入到大肠杆菌argR基因位点的阳性转化子。
全文摘要
一种L-精氨酸的制备方法，它是培养改性的大肠杆菌发酵生产L-精氨酸，所述大肠杆菌的改性方法包括如下步骤(1)构建含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体。(2)将含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体转化到大肠杆菌中，筛选阳性转化子。本发明使乙酰谷氨酸合成酶基因表达单元定点插入整合到大肠杆菌的argR基因位点，使得外源基因在整合的同时敲除了argR基因。利用这种改性大肠杆菌进行发酵，能够产生并在培养基中积累L-精氨酸，通过分离纯化步骤收集L-精氨酸。本发明的大肠杆菌改性方法避免了将整个表达载体导入大肠杆菌带来的基因拷贝数过高，使基因过度表达，从而干扰代谢途径中其它酶基因的表达。可提高菌种的遗传稳定性。
文档编号C12N15/70GK101586130SQ20091004048
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月23日 优先权日2009年6月23日
发明者宁异真, 张添元, 达 徐, 郑明英, 陆林芳, 雷剑芬 申请人:广东肇庆星湖生物科技股份有限公司