一种高效分解纤维素的酶组合物的制作方法

专利名称：：一种高效分解纤维素的酶组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物领域，具体涉及一种能在高温、强酸的条件下有效分解纤维素的重组生物酶制剂，本发明还涉及该纤维素酶的载体和宿主菌细胞及其在工业、农业、食品和制药方面的应用。
背景技术：
：全球一年间由光合作用生产的纤维素达1000亿吨，是最丰富的可再生资源。通过纤维素酶将植物纤维分解用作工业原料，对人类将是一个重大的贡献，可以使人们摆脱对谷物粮食的绝对依赖，缓和世界资源紧缺的状况。纤维素是植物通过光合作用以二氧化碳和水为原料合成的地球上最丰富的可再生的生物质资源。根据维基百科全书(11://211.^^06￡^.0巧)介绍，纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖。无论一年生或多年生植物，尤其是各种木材都含有大量的纤维素。自然界中，植物体内约有50%的碳以纤维素的形式存在。棉花、亚麻、芋麻和黄麻部含有大量优质的纤维素，以棉花中的纤维素含量最高，达90%以上。木材中的纤维素则常与半纤维素和木质素共同存在。纤维素是一种复杂的多糖，有8000至10000个葡萄糖残基通过P—1，4—糖苷键连接而成。天然纤维素为无臭、无味的白色丝状物，在水中有高度的不溶性，同时也不溶于烯酸、稀碱和有机溶剂。纤维素酶能够分解纤维素成寡糖或葡萄糖。一般认为纤维素类物质经酶促作用分解成葡萄糖至少需要3种酶内切l，4-葡聚糖酶(endoglucanaseEC3.2丄4);外切纤维二糖水解酶(cellobiohydrolaseEC3.2丄91)和卩-葡萄糖苷酶(卩-D-glucosidaseEC3.2.1.21)，或exo-l，4-(3-D-glucosidaseEC3.2丄74)。首先由内切葡聚糖作用于微纤维的非结晶区，在纤维素长链分子的内部将长纤维分解成短纤维；纤维二糖水解酶再从非还原端依次分解产生纤维二糖和三糖，后者再被卩-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。葡萄糖是种用途广泛的工业原料，可用于生产酒精，维生素等重要的化工产品。天然纤维素结构紧密(木质素和半纤维素包裹纤维素)，需要进行高温酸性水解和纤维素酶作用才能最终分解成为单糖。因为高温酸性条件下，纤维素多聚体可溶性增加，粘度降低，酶反应面积增加。因此理想的纤维素酶需耐高温和耐酸性。目前市场供应的纤维素酶大多数来自于真菌或霉菌，其工作温度在70度以下，耐高温性能差且组成部分单一，如只是含有以下3种酶之一内切l，4-葡聚糖酶；外切纤维二糖水解酶和p-葡萄糖苷酶。最近几年各国科学家从极端嗜热古细菌(Hyperthermophilicarchaea)中陆续发现了能分解非淀粉糖类的耐咼温酶，例如来源于Pyrococcushorikoshii，Pyrococcusfuriosus，Thermococcussp.，Thermotogamaritime,andThermotoganeapolitana的葡萄糖苷酶；来源于Pyrococcushorikoshii，Thermotogamaritima，Thermotoganeapolitana的内切葡聚糖酶。Pyrococcushorikoshii是从海底火山口被分离出来，并已被测序。研究表明它能分解天然纤维素作为能量来源。以前的日本研究人员在此菌中主要分离出两种纤维素酶的活性内切1，4-葡聚糖酶和卩一葡萄糖苷酶。这两种酶虽然耐热耐酸，但这两种单酶对天然纤维素的分解能力不强，而且参照已有文献，它们主要作用于非结晶纤维素，对结晶型纤维素(天然纤维素的主要成分)分解能力很低。而且到目前为止，科学家在Pyrococcushorikoshii和其它古细菌中尚未找到一个耐热型的外切纤维二糖水解酶。热休克蛋白(Heatshockproteins,HSPs)是生物体对高温等外界刺激迅速作出的应激反应而产生一组结构上非常保守的特殊蛋白质，从而使生物体在热、冷、高盐、有机毒物、重金属离子、氧自由基、紫外线及缺血、缺氧、感染、基因损伤、组织创伤等不良环境和状态下生存下来。前折叠素(Prefoldin，PFD)是热休克蛋白的一种。它能与结构、大小、定位和最终功能都不相同的多肽链非特异性结合，通过分子伴侣蛋白(molecularchaperone)协同作用，催化介导蛋白质特定构象的形成，参与体内蛋白质的折叠、装配与转运，有极其重要的辅助酶构象形成和保护蛋白质稳定性的作用，与分子伴侣蛋白不同的是，前折叠素不需要ATP供应能量，能直接与蛋白质结合而稳定特定蛋白质构象，有可能诱导蛋白质与蛋白质之间的相互作用。大麦是生产啤酒和词料的主要原料，其胚乳细胞壁中的主要成分半纤维素和大麦胶由P一D—葡聚糖组成。由于大麦(3—葡聚糖链分子发生扭结，分子间结合不紧密，且溶解后黏度高，糖化时使麦汁黏度增高，卩—葡聚糖易被高分子蛋白质吸附，造成麦糟"板结"，从而导致麦汁和啤酒过滤困难，降低麦汁得率；大麦p—葡聚糖不能被酵母利用或分解，易引起啤酒混浊和凝胶沉淀，影响啤酒的稳定性，降低啤酒的品质和经济效益。大麦在发芽时，首先由卩一葡聚糖溶解酶断裂(3—葡聚糖与蛋白质间的酯键，进而为大麦P—葡聚糖酶同工酶EII进行专一性降解。卩一葡聚糖溶解酶对热稳定，在糖化过程中损失不大，而专一性降解(3—葡聚糖的内P—葡聚糖酶的热稳定性差，酶作用的最适温度为4045'C，55。C下失活，在65。C糖化5分钟，酶活性仅存1%，严重限制了糖化工艺的发展，是糖化和啤酒酿造的瓶颈步骤。为防止大麦P—葡聚糖造成过滤困难、啤酒混浊等问题，传统的制麦工艺宁可采用低温发芽也不主张轻易升高温度来縮短制麦周期；同时在糖化过程中控制麦芽粉碎度，采用低温浸渍，以防卩一葡聚糖酶失活或卩一葡聚糖从细胞壁中析出，尽可能用二次煮浸法来减轻或消除大麦P—葡聚糖造成的过滤困难、浑浊等问题。此外，大麦芽的价格远高于未发芽的大麦，使原料成本增加70%100%，浸出物含量减少10%，造成较大的损失，浪费原料，提高成本。目前倾向于使用外加酶糖化法，即减少麦芽用量，增大辅料投料比，并通过添加微生物酶制剂来进行糖化、制备麦芽汁。此法可大幅度降低原料成本，节约粮食且生产的啤酒质量与传统方法酿造的啤酒相近，具有明显的经济效益，每年可为啤酒行业降低成本20亿元。同时，新啤酒品种的开发，对制麦工艺提出了新的要求，这也急需开发高效的外源酶以弥补由于制备特种麦芽对糖化带来的不良影响。目前己有商品化的耐高温a—淀粉酶、糖化酶和蛋白酶制剂用于啤酒酿造工业，而市售的p—葡聚糖酶制剂多为用于饲料加工的粗酶制剂，酶的最适温度较低。用于啤酒工业的复合酶中的葡聚糖酶的耐高温性也较差，限制了啤酒糖化工艺和啤酒工业的发展。因此，为适应新时期啤酒工业和大麦种植业发展的需要，迫切需要开发耐高温的(3—葡聚糖酶制剂，以节约粮食，降低成本。如何利用生物技术综合利用自然界中存在的天然纤维素及半纤维素，并将这些天然产物转化为单糖，是人们寻找再生能源需要解决的关键问题，同时也是其他行业发展所需要解决的问题。目前研究开发的纤维素酶还不能满足将植物纤维转化成单糖作为再生能源的需求，因此开发具有高效水解纤维素的纤维素酶具有重要的意义。
发明内容本发明的目的在于提供新型的纤维素酶组合物，该酶组合物在高温，强酸的条件下，能够有效分解自然界的纤维素，并且在许多常温纤维素酶制剂难以作用的极端(如高温度，强酸性)环境下，仍然具有分解活性。本发明的另一个目的是利用基因工程技术用经济高效的热启动子载体和方便实用的细菌蛋白表达系统来生产耐热耐酸的纤维素酶组合物。为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是一种高效分解纤维素的酶组合物，它具有以下描述氨基酸序列之一的单组分和多组分的蛋白质或多肽(1)内切l，4葡聚糖酶氨基酸序列，序列l;(2)外切(3-葡萄糖苷酶氨基酸序列，序列3;(3)前折叠素蛋白，序列5和7;(4)以上三种酶的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且仍然具有纤维素酶活性的蛋白质。所述的纤维素酶组合物具有氨基酸序列2、4和6所描述的氨基酸序列，与每个组分具有至少80%的同源性。纤维素酶编码基因纤维素酶编码基因具有下述核苷酸序列之一(1)内切l，4葡聚糖酶编码基因核苷酸序列，序列2;(2)外切(3-葡萄糖苷酶编码基因核苷酸序列，系列4;(3)前折叠素蛋白编码基因核苷酸序列，序列6和8;(4)以上三种酶编码核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且仍然具有表达纤维素酶活性的突变基因；(5)在O.IXSSC，0.1%SDS，65度杂交洗膜的高严谨特异条件下，可与下列三种酶之一的任何一种酶的编码基因进行DNA序列杂交的核苷酸序列(a)内切l，4葡聚糖酶编码基因核苷酸序列，序列2;(b)外切(3-葡萄糖苷酶编码基因核苷酸序列，系列4;(c)前折叠素蛋白编码基因核苷酸序列，序列6和8。纤维素酶组合物编码基因的表达载体质粒pKJ3-endo，pKJ3-glucoandpKJ3-endo/gluco含有一个温度敏感型的热启动子，调控下游基因的表达，不需添加昂贵的诱导化学物。所述编码基因的细胞表达系统或基因工程菌，其宿主菌为Escherichiacoli,Bacillussubtilis，yeastandfilamentousfungi.它可以表达生产以下之一，之二，或者所有三种蛋白(1)内切1，4葡聚糖酶；(2)外切卩-葡萄糖苷酶；(3)前折叠素蛋白。纤维素酶编码基因的细胞表达系统或基因工程菌，使用此菌体生产纤维素酶的发酵工艺流程和提取工艺流程，使用此菌体在这种发酵工艺流程中进行培养，通过提取工艺流程分离提纯酶组分，可以生产具有单组分或多组分的纤维素酶组合物。所述的纤维素酶在纤维素降解中的应用。所述的纤维素酶编码基因在纤维素降解中的应用。本发明所含盖的单组分或多组分的纤维素酶组合物，在工业纸浆加工，纺织品处理，衣物洗涤，中药提取，生物石油生产，石油开采，生物降解废物及污水处理，农业动物饲料高温制粒加工，食品加工面包焙烤，啤酒酿造方面的广泛用途，它包括但不限制于以上应用领域。本发明涉及的2个纤维素酶蛋白(内切1，4.葡聚糖酶和外切P-葡萄糖苷酶)和1个辅助蛋白(前折叠素蛋白a和p亚基)均来源于古细菌Pyrococcushorikoshi。而本专利发明人通过对以上酶基因改造加以优化，并转入大肠杆菌进行热诱导表达，使得此耐酸和耐热的纤维素酶组合物大规模生产成为可能。第一个酶蛋白长为361个氨基酸，具体序列为序列ID#1(SEQIDNO:l)，命名为PH1171-361，是基于全长为458个氨基酸的内切1，4葡聚糖酶PH1171基因构建而成。第二个酶蛋白长为416个氨基酸，具体序列为SEQIDNO:2，命名为PH0366-416，是基于全长为423个氨基酸的外切P-葡萄糖苷酶PH0366基因构建而成。本发明人把它们分别连入pET蛋白表达质粒，并转化入大肠杆菌BL21(DE3)STAR.通过lmM，isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside(IPTG)在37度诱导表达6小时收集菌体。收获的菌体在24小时内用真空高压泵裂解，经离心去掉细胞壁碎片的裂解液在85度加热30分钟，再次离心后取上清即为粗制酶，纯度在60-80%以上。凝胶电泳分析显示长度短的蛋白构建体比全长蛋白在大肠杆菌中的表达产量显著增高。使用此酶液测活性，与全长蛋白比较而言，pll71-361不仅具有较高内切l，4葡聚糖酶活性，而且呈现出显著外切纤维素二糖酶活性。至于比361氨基酸短的蛋白构建体，本发明人没有检测到任何酶活性，可能与蛋白质不能正常折叠有关。对于第二个酶蛋白，其构建体p0366-416具有和全长蛋白类似的(3-葡萄糖苷酶活性。使本发明具有工业价值的关键发现在于，当把PH1171-361和PH0366-416混合后以结晶纤维素为底物，不仅产生更多的多糖还原端，而且有大量单糖/葡萄糖产生。这是任何以往的发明专利和研究文献都没有提到的，也不能从单个酶的活性预测出来。一种可能性为本发明的两种蛋白构建体有新的活性构像，它们产生了全长蛋白之间不存在的协同作用。这在后续试验结果中得以支持这种推测。当把具有稳定和诱导蛋白构像功能的前折叠素(包括a和P亚基)加入反应系统中，酶活性得到了进一步的增强。pET表达系统需添加IPTG化学诱导物启动蛋白在细菌中的表达，成本较高。为了使本发明的性能特异纤维素酶组合更加经济高效的表达，以满足工业化生产的要求，以已广泛应用的热启动子载体pGW7为基础，设计了一个新载体pKJ3，把在pET蛋白表达系统中经过验证的纤维素酶组合基因(内切1，4葡聚糖酶PH1171-361和外切P-葡萄糖苷酶PH0366-461)转入pKJ3新载体系统，构建pKJ3/1171-361禾PpKJ3/PH0366-461表达质粒。同时，又设计了一个含有SD序列的桥梁片段，把以上2个纤维素酶基因连接起来，这样一来2个酶可以在一个热启动子的调控下即一个菌体中同时表达，使得整个纤维素酶生产系统更加科学高效。以同样的方法，把纤维素酶辅助蛋白(前折叠素蛋白a和(3亚基)，克隆进入另外一个热启动子载体pKJ3，这样2个亚基蛋白也可以在一个菌体(E.ColicontainingpKJ3/prefA&B)中同时表达。这个基因工程菌可以与纤维素酶基因工程菌(E.colicontainingpKJ3/1171-361&PH0366-461)混合加入发酵液，所收获的蛋白酶同时含有纤维素酶及其稳定性辅助蛋白，不但具有高效分解纤维素的能力，而且耐酸和耐高温。本发明所提供耐热耐酸纤维素酶组合，命名为ROBUSTthermophilicandacid-resistantCELLULASEcomplex.本发明相对于现有技术的有益效果是1.把2个多糖分解酶基因(L内切l，4葡聚糖酶，beta-endoglucanase;2.外切p-葡萄糖苷酶，exo-beta-gliicosidase有机结合在1个载体上表达，以结晶纤维素为底物，不仅产生更多的多糖还原端，而且有大量单糖/葡萄糖产生。这是任何以往的发明专利和研究文献都没有提到的，也不能从单个酶的活性预测出来。2.把具有稳定和诱导蛋白构像功能的前折叠素(包括a和卩亚基)加入到2个多糖分解酶的反应系统中，通过蛋白协同作用酶活性得到了进一步的增强。3.把2个不同的基因通过同一个热启动子进行表达，蛋白表达效率提高，产量提高，效果明显。4.本发明利用古细菌基因为原始模板优化组合所得的特殊纤维素酶制剂较传统的常温(37度)和耐热(70度)纤维素酶更加耐热耐酸。在工业(纸浆加工，纺织品处理，衣物洗涤，中药提取，生物石油生产，石油开采，生物降解废物及污水处理)，农业(动物饲料高温制粒加工)，食品加工(面包培烤)，啤酒酿造等诸多方面有更广泛用途，经济效益明显。5.目前研究开发的纤维素酶，活性低不耐高温，不能满足将植物纤维转化成单糖作为再生能源的需求，因此本发明所生产的纤维素酶制剂因其具有高效水解纤维素的能力，对生物乙醇等再生能源的生产潜力巨大，在技术和应用上都具有重要的意义。图1为嗜热古细菌Pyrococcushorikoshii的基因组DNA经过限制性内切酶的HINDIII酶切分析图，DNA样品在0.7%琼脂糖凝胶电泳图表明Pyrococcushorikoshii的基因组DNA提取质量好，可用于通过PCR反应进行后续的目标基因扩增；本电泳图中第1条泳道是DNA分子量标记，从上到下依此为23130bp'9416bp,6557bp，4361bp,2322bp，2027bp.第2和4条泳道均为未酶切的基因组DNA.第3和5条泳道均为经过HindlII酶切的基因组DNA;图2为含有2个纤维素酶基因的表达质粒pKJ3-endo/gluco示意图；图3为含有2个前折叠素基因的表达质粒pKJ3-prefA/B示意图。具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制9本发明的范围。具体实施步骤本发明的实验方法所用的材料包括大肠杆菌，ECOLIBL21DE3STAR来自于INVITROGEN公司，宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化。基因组DNA纯化试剂盒来自于QIAGEN公司，FlexiGeneDNAKit(250)51206,或GentraPuregeneTissueKit。质粒DNA纯化试剂盒购自QIAGEN公司，QIAprepSpinMiniprepKit(250)(cat#27106)。DNA片断纯化试剂盒购自QIAGEN公司，QIAquickGelExtractionKit(50)(cat#28704)。克隆载体来自于Promega公司，TA载体是pGEM-TEASYVECTORSYSTEM。pET蛋白表达载体来自于Novagen公司。表达载体，pKJ3来自pGW7。在该载体中，目标基因克隆到thermalpromoter强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供热诱导(42。C)启动来诱导表达。以下酶来自于NEB公司限制性内切酶，DNA聚合酶，DNA连接酶。所有的DNA和蛋白质操作参照如下指南萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T(金冬雁，黎孟枫等译).分子克隆实验指南[M].第2版.北京:科学出版社1992。实施例1纤维素酶基因的获得本发明中的基因片段就是取自于一种嗜热古细菌PyrococcushorikoshiiOT3(JCM9974)，它从以下单位购买Riken(theInstituteofPhysicalandChemicalResearch),JAPAN。这个嗜热古细菌的整个基因组DNA已经测序完毕。嗜热菌pyrococcushorikoshiiOT3在95。C静置培养16小时(具体培养方法见日本微生物保藏中心目录)。基因组DNA通过QIAampDNAminiKit试剂盒(Qiagen.com，Valencia,CA,USA.Cat存51304)提取。发明人根据嗜热菌pyrococcushorikoshiiOT3的基因组DNA序列设计如下引物，通过聚合酶链反应得到不同长度的2种纤维素酶基因和前折叠素(Prefoldin，PFD)2个亚基基因。1.1内切l，4葡聚糖酶PH1171全长基因和部分序列缺失的优化基因构建体通过如下引物获得，它们均带有A^e/(上游)andBawHI(下游)酶切位点(已用下划线标出)。(A)全长基因(编码458个氨基酸)上游引物5'-TTCTTTCATATGGAGGGGAATACTATTCTTAAAATC-3'，下游引物5'-AGATTTGGATCCCTACCTGGGAGCCCTTCTTAA-3'。(B)次长基因(编码430个氨基酸；信号序列缺失)上游引物5,TTCTTT^^^GAAAATACAACATATCAAACACCGACT，下游引物5，-AGATTTGGATCCCTACCTGGGAGCCCTTCTTAA-3'。(C)次短基因(编码388个氨基酸；信号序列和C端缺失)上游引物5，-TTCTTTCATATGGAAAATACAACATATCAAACACCGACT-3，，下游引物5，-AGATTTGGATCCCTAAGAACTTTTGGAACAACTATC-3'。(D)最短基因(编码361个氨基酸；具有酶活的最短基因片断)上游引物:5，-TTCTTTCATATGATTAATGTCACCAGTGGAGA-3'，下游引物PCR扩增条件94°C3分钟，l个循环；94°C30秒，60°C30秒，72°C1.5分，循环35次；72°C10分，l个循环。经过扩增的片段通过琼脂糖凝胶电泳确认其长度，提纯，经限制性内切酶Ndel和BamHI处理，连入同样经此二酶处理的pETlla载体，转化进大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。重组质粒从转化的单克隆菌株提取后，经由酶切和T7和SP6引物测定DNA序列鉴定确认含有插入正确DNA序列。重组质粒分别命名为pETll(PH1171-458)，pETll(PH1171-430)，pETll(PH1171-388)，和pETll(PH1171-361)。单克隆工程菌株则通过IPTG诱导，菌体裂解，凝胶电压泳和蛋白染色确认有效表达目标蛋白。1.2外切(3-葡萄糖苷酶PH0366采用同样的方法使用以下引物通过聚合酶链反应得到P-葡萄糖苷酶全长基因和部分缺失序列构建体，连接到pETlla表达载体中，并用来转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。重组质粒分别命名为pETll(PH0366-423)和pETll(PH0366-416)。(A)全长基因(编码423个氨基酸)上游引物5,_丁TCTTTCATATGCCTCTTAAGTTCCCCGAAATG-3，，下游引物5，-AGATTTGGATCCCTAAAGTTGAAGTTCTGGTAGG陽3'。(B)优化基因(编码416个氨基酸)上游引物5，-TTCTTTCATATGTTTCTCTTTGGTACCGCAA-3，，下游引物5，-AGATTTGGATCCCTAAAGTTGAAGTTCTGGTAGG-3'。1.3前折叠素蛋白基因a亚基PH0527和)3亚基PH05321.其表达质粒的构建分两步进行，PCR反应条件同上。首先，分别克隆了单个基因a亚基基因用上游引物5，-TTCTTTCATATGATAAGGATGGCTCAGAA-3，和下游引物5，-AGATTTGGATCCCTACTTCTTAACCTTAAAGC-3'以P.horikoshii基因组DNA为模版扩增得到，经过Ndel/BamHI酶切后连入经同样酶切处理的pET23b，命名为pET23(PH0527)。2.亚基基因用上游引物5，-TTCTTTCATATGCAGAACATTCCTCCCCA-3'和下游引物5，國AGATTTOIfiQAeTCAGCCAGCGGTAGGCGGCC-3，以P.horikoshii基因组DNA为模版扩增得到，经过Ndel/SalI酶切后连入经同样酶切处理的pET23c，命名为pET23(PH0532)。其次，我们把两个亚基克隆到同一载体中。以pET23(PH0532)为模板，用上游引物5，-TTCTTTGAATTCGAAATAATTTTGTTTAACT-3，禾口下游弓l物5'-AGATTTGTCGACTCAGCCAGCGGTAGGCGGCC-3，来扩增。该扩增片断在基因PH0532的上游不仅引进了EcoRI酶切位点，而且包含了核糖体结合序列(SD序列)。该片断经EcoRI/Sa11酶切后连入经同样酶处理的pET23(PH0527)，命名为pET(prefA&B)。此质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)star，并通过IPTG诱导表达蛋白，菌体裂解，凝胶电压泳和蛋白染色确认a和p亚基同时表达。实施例2纤维素酶基因的阳性克隆鉴定2.1内切l，4葡聚糖酶生物活性测定法用平板影印法将含有插入片段的转化子(pET/PH1171-458全长基因或它的优化构建体)分别影印到一个含有0.5。/。羧甲基纤维素(carboxylmethylcellulose,CMC)和lmMIPTG的LB琼脂培养基平板上(SIGMA公司，C-5678),同时将同样转化子影印到另外一个含有100pg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基平板上，将2个平板置于37度培养箱中培养20小时，把长有菌落的氨苄青霉素的LB琼脂培养基平板置于4度培养箱中保存。另外一个含有CMC的LB琼脂培养基平板用氯仿蒸气体熏蒸裂解细胞，再用0.5%刚果红溶液染色20分钟，用1M的NaCl溶液脱色20分钟，然后观察有无水解圈。提取产生水解圈的质粒，再转化进入EcoliBL21(DE3)STAR,用空载体做对照转化同时进行以下对比实验。在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基平板上随机挑取30个转化子用牙签点接到0.5%CMC和lmMIPTG的LB琼脂培养基平板上，做同样的水解圈实验。以二次确认阳性克隆含有纤维素酶基因并且表达有活性的纤维素酶。2.2(3-葡萄糖苷酶生物活性测定法以七叶苷(ESCULINHYDRATE)或lmg/mlX-GLUCAN替代0.5%CMC，其它步骤类同。再加入lmMIPTG于100ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基平板上，把含有片段的克隆子(pET/PH0366-423或416)裂解后转移到80-85'C培养箱中放置20分钟。蓝色克隆为阳性克隆。同样，也可以把菌落转移到MILIPOREHATFMEMBRANEFILTERPAPER,再用氯仿蒸气体熏蒸裂解细胞，把占有裂解细胞蛋白的HATFMEMBRANEFILTER用打空器转印至于浸有lmg/mLX-GLUCAN的3mm滤纸上，在80-85。C温育培养数分钟，如果显出蓝色克隆即为(3-葡萄糖苷酶基因的阳性克隆。2.3通过抗体免疫测定法鉴定纤维素酶基因的阳性克隆首先使用以下蛋白质作为抗原，制备兔抗血清，以收集抗体免疫筛选用的特异性抗体。用平板影印法将含有插入片段的转化子分别影印到一个含有0.5%CMC的LB琼脂培养基平板上(SIGMA公司，C-5678),同时将同样转化子影印到另外一个含有PolyvinylideneFluoride,orPVDF膜，再进行蛋白质印迹原位杂交，筛选阳性克隆。免疫原蛋白质来源如下1.卩-GlucanasefromAspergillusniger(SIGMA/BIOCEMICA，49101).BioChemika，powder,dark-brown，~1units/mg2.卩-glycosidase由以下大学赠送LaboratoryofMicrobiology,WageningenUniversity'HessenlinkvanSuchtelenweg4，NL-6703CTWageningen,TheNetherlands。3.prefoldin由以下大学赠送.DepartmentofBiotechnologyandLifeScience'TokyoUniversityofAgricultureandTechnology,2-24-16，Naka-cho，Koganei，Tokyo184-8588，Japan。实施例3纤维素酶优化构建体活性研究用实施例1中的多种工程菌菌株生产耐热重组蛋白的步骤类似。将保存于-7(TC的原始菌株划线培养在含有5(Hig/ml氨苄青霉素的LB平板上，于37。C培养过夜。选出单个菌落，接种于含有10(^g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37'C震荡培养。当菌液浓度的OD600介于0.4至0.7之间时，加入异丙基硫代-卩-D半乳糖苷(IPTG)至终浓度为lmM。在继续培养6小时后，离心收集菌体，弃培养液。用震荡方式将菌体均匀分散于适量100mMpH5.0的柠檬酸盐溶液中。悬浮菌体用超声波裂解(参考参数为超声仪Sonifier250强度设定4，30%循环，处理时间4分钟)。以7000g离心20分钟来沉淀细胞壁碎片。上清液在85°。加热30分钟，以10000g离心30分钟来沉淀变性大肠杆菌蛋白。所得上清液即为粗制酶液。其中目标蛋白纯度在60-80%以上。粗制蛋白可用硫酸铵沉淀，离子交换柱和分子筛过滤等方法富集，也可直接作为纤维素复合酶制剂成分使用。比较4种内切1，4葡聚糖酶构建体的活性将羧甲基纤维素溶于100mMpH5.0的柠檬酸钠溶液中使其终浓度达到1%。50(^1此溶液分别与50itd粗酶制剂PH1171-458，PH1171-430,PH1171-388或PH1171-361混合，并用矿物油覆盖。在98'C反应IO分钟。用常规比色测定法测定还原性末端集团的增加量(Lever，M，1972)。以全长酶PH1171-458的活性设为100%，则PH1171-430为97%，PH1171-388为193%，PH1171-361为244%。比较两种卩一糖苷酶构建体的活性对硝基苯基一(3—D-纤维素二糖苷溶于100mMpH7.5的拧檬酸钠溶液中是其终浓度达到10mM。190ml此底物溶液分别与10mlPH0366-423或PH0366-416粗酶液混合置于98°C。在十分钟内每隔30秒取1ml反应液用分光光度计在405nm处测量黄色产物对硝基苯船。取曲线的线性部分计算活性。如以PH0366-423活性为100%，则PH0366-416为115%。用类似的纯化方法本发明人得到了前折叠素的粗蛋白溶液。未检测到任何纤维素酶的活性。由于PH1171-361和PH0366-416具有最高活性，我们选定他们作为酶组合制剂的成分。我们分别测定了他们在不同温度和不同pH值的活性，以及在高温条件下的稳定性。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>PH0366-416,p—糖苷酶活性温度°C(pH5.5，反应时间10分钟)相对活性pH(98°C，反应时间10分钟)相对活性稳定性，小时(pH5.5，98°C)相对活性11091%444%0100%98100%5.5100%296%卯90%693%92%8072%789%1090%7045%838%1589%6024%916%2087%3710%107%实施例4纤维素酶组合制剂的活性本发明人研究了不同酶制剂成分对结品纤维素的降解活性。10mg结晶纤维素与lnmolPH1171-361，PH0366-416，PH0527-PH0532分别混合或与不同蛋白组合混合，加入lOOmMpH5.0柠檬酸钠溶液至总体积为1毫升。在98。C反应60分钟后，于16000g离心十分钟。(A)残留的沉淀物(不溶纤维素)用1.5水洗3次，在60'C烘箱里千燥30分钟，然后称重。在对照实验中，10mg结品纤维素在无酶添加的情况下经上述步骤处理后残留量定为100%。(B)测量离心所得上清液里还原性糖基的含量。用常规比色测定法测定还原性术端集团的增加量(Lever，M，1972)。为方便比较，取反应生成的最多糖基量(三种蛋白协同作用的反应)定为100%。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>此外，本发明人用HPLC分析了不同酶制剂组合处理结晶纤维素生成的产物。我们在反应(6)，(7)和(8)中检测到葡萄糖单糖，在(5)，(7)和(8)中检测到纤维二糖，微量的葡萄糖在(3)中检测到，而微量的纤维二糖在(2)中检测到，结果证明以上2种酶和前折叠素蛋白的混合物产生了最大的纤维素分解能力。另外，通过同样的检测方法对酶组合物的组合比例进行优化，本发明人发现这个酶组合物中3种蛋白质的比例以1:1:0.1-1组成为佳。实施例5热启动子调控的纤维素酶表达质粒的构建载体名称pKJ3pKJ3是由美国ATCC保藏的原始质粒pGW7为基础改建而来，再加以自行构建成功的。使用了很强的PRPL双启动子，含有编码温度敏感性阻遏蛋白的c1857基因，在30-32'C时产生的阻遏蛋白能阻止PRPL的转录起始，细菌可以正常生长繁殖，42摄氏度时该阻遏蛋白发生构像变化而失活，基因开始转录而表达。载体含有2个抗性基因Amp和tetracycline,其载体大小4KB，其宿主为E.coli。经过生物活性法和抗体免疫法鉴定的阳性克隆PET-endo和PET-gluco可以提取DNA质粒作为模板，通过PCR方法把纤维素酶基因进行亚克隆进入热启动子载体，构建pKJ3-ENDO(BAMHIANDSALI)禾QpKJ3-GLUCO(BAMHIANDPSTI)。同样的方法，经过生物活性法和抗体免疫法鉴定以pKJ3为载体的阳性克隆，再通过PCR方法把2个纤维素酶基因进行连接克隆进入热启动子载体pKJ3，构建含有2个纤维素酶基因的表达质粒pKJ3-ENDO/GLUCO。同样的方法，经过抗体免疫法鉴定以pKJ3为载体的阳性克隆，再通过PCR方法把2个前折叠素基因进行连接克隆进入热启动子载体pKJ3，构建含有2个前折叠素基因的表达质粒:pKJ3-prefA/B。实施例6纤维素酶中的P-葡聚糖酶在啤酒糖化过程中的应用我们取纤维素酶组合中的P-葡聚糖酶检测其在啤酒糖化过程中的应用，这里的(3-葡聚糖酶由p-葡聚糖酶基因工程菌制得。它以E.COLIBL21(DE3)STAR为宿主含有pKJ3-ENDO表达质粒。酶蛋白提取方法与纤维素酶制备方法相同。实验方法如下取麦芽粉50g，加入200g水于500mL三角瓶，不同酶加量添加于上述醪液中<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注在升温至7(TC后添加，先用少量406(TC糖化用水溶解后添加。糖化步骤如下投料完毕——搅拌均匀——50。C下不停搅拌保温40min——升温至7(TC——加不同量酶制剂——搅拌下保温(20min)(碘液反应无颜色变化为止)——升温至76°C——保温过滤(中速滤纸)。并检测如下项目麦汁量——过滤完毕后总麦汁量(mL);过滤时间——过滤前lOOmL时所用时间(min);粘度——(cp);浊度——过滤麦汁的浊度(1EBC=4NTU)(校准)；糖度——折射仪(BX)。然后煮沸麦汁，分三次添加酒花0.2%，冷却至室温，过滤(中速滤纸)。检测过滤速度。检测结果发现过滤后麦汁测糖度发现卩-葡聚糖酶处理后的样品还原糖浓度升高17倍，粘度降低8倍，说明耐高温P葡聚糖酶可以促进麦汁和啤酒过滤，提高麦汁得率，提高啤酒的品质和经济效益。序列表序列1:内切l，4葡聚糖酶氨基酸序歹"endo-l，4-beta-glucanase)，长度为361个氨基酸1MINVTSGEETPIHLFGVNWFGFETP冊VVHGLWKR丽EDMLLQIKSLGFNAIRLPFCTES61VKPGTQPIGIDYSKNPDLRGLDS耶MEKIIKKAGDLGIFVLLDYHRIGCTHIEPLWYTE121DFSEEDFINTWIEVAKRFGKYWNVIGADLKNEPHSVTSPPAAYTDGTGATWGMGNPATDW181NLAAERIGKAILKVAPHWLIFVEGTQFTNPKTDSSYKWGYNAWWGGNLMAVKDYPVNLPR241NKLVYSPHVYGPDVYNQPYFGPAKGFPDNLPDIWYHHFGYVKLELGYSVVIGEFGGKYGH301GGDPRDVIWQNKLVDWMIENKFCDFFYWSWNPDSGDTGG工LQDDWTT工WEDKY腦LKRLM361D.序列2:内切1，4葡聚糖酶编码基因核苷酸序列，长度为1086个碱基1atgattaatgtcaccagtggagaggaaactcccati:catctctttggtgtaaactggttt61ggctttgaaacacctaatcs121cttcttcsgatcaasagctt181gtsaaaccaggaacacaacc241ctagatagcctscagattat301gtcttactcgactatcatag361gacttctcagaggaagactt421tactggsscgtaataggggc481gctgcttatacagstggtac5413scttggcggctgagsggat601ttcgtggaggggacacaatt661aacgcttggtggggaggaaa721wtssgctagt3tacsgccc781ggtcccgctssgggttttcc841gtaaaattagaactaggata901ggsggcgstccasgggatgt961aaattttgtgatttctttta1021ctacatggatgattggacaac1081gattga序列3:卩-葡萄糖苷酶氨基酸序列(beta-gliicosidase)，长度为416个氨基酸:1mflfgtatsshqiegnn冊nd丽yyeg工gklpyrsgkacn;lmtslgynay61rfs工ewsrlfpeenkfnedafmkyre工idl!^trg工tplvtlhhftsplwfmkkggfxre121ekvaellekvklvatfnepmywppf工rspfkafkvaanll181kaha工ayellhgkfkvgivkn工piilpasdkerdrkaaekadnlf丽hflda工wsgkyrg241vfktyr工p②dadfigvnyytasevrhtwmplkfffevklad工serktqmgwsvypkgiy301malkkasrygrplyitengiatlddewrvefi工qhlqyvhka工edgldvrgyfywsfmdn361yewkegfgprfglvevdyqtferrprksayvygeiarske工kdel:lkryglpelql序列4:(3-葡萄糖苷酶编码基因核苷酸序列，长度为1251个碱基:1atgtttctctttggtaccgccatcagatagtagatggsat61gattggtggtactstgagc3gattggd33gctcccctscagatctggtaaggcttgcaat121cactgggaactttscsgggatgatattcaggcttgggctat3stgcttst181aggttctccatagagtggagcsggctsttctg33gatgct241accgggsgatt3tagscttgttattgacgatcccctggtg3013CCCt3C3CCscttt3ct3gccctctctggttcatgaagaasggtggcttccttagggag361ctgagctttt421Ct3CCttC3Stgsgccgstgtgatgggatatct3己cggct481tattggcccccdttC3tt己ggagtccsttt3ggt己gctgc3ai3cctgctt541C33ttgcct3tgsscttcttcatgggasattcaaagttggaatcgtaaag60133t3ttCCC3七33t3CtCCCagcgagtgacaaggagagggatagaaaagc661gctgataatttsttt33Ctggcactttttgggagtgggaa721tccccsaagt:tcsttggggtt33Ct3tt3C781acggccagcgtscttgg33tcctttaaa己ttcttctttgsggtgsaatta841gcggatattagcgagaggaagactcsaatgggatggagcgttt3tCC333aggaatatactgtsgtgcscaggcttc33tgataggatgctattasc3C3tgatctaaagcggggctacaaggaaaagcgtsctaaitccgtctaatggcctcacgtatatggataatcttttcagttgtatatstggcaactggagctggggsctttggagcaataagacgattacagta3CtC3C3t3gtggatagaggaatgagcctctggggtstggattctgaagggtaaaggattgggccagatgccsg3tstctataggagagtaatccagatattcctttctgccggagatctaacccctctgttgccaaaagatagtgttacgaaaccctgcttgcccctcsatccagttasggtatcaccsttggsggaasttgattggatgtggsgatsca_ta_a_cctga_aggssgacatgtactgsgtcttcttcgtggatggtatctttgt3cacgg33gttcggt33gCtC3CCCCC3aaccgattggttggttgstaatggggctatccttacctagg3ccgtsctttctttggatsc3t3tgggc3tcggsggg3ttgageLttgatg18901atggcccttacaggtstggaaggcctctttatattscggs961gcgscgcttgatgatgaatggsgagtggsattcst33ttc33C3CCtCC33tacgttC3t1021aaggctatcg33gscggcctggttacttctattggtcatttatggatsac1081tscgagtggsaagaggggtttgggcctsgatttggcctagtggaagttgatt3tcsaacc1141ttcg3g3g33ggcccaggaagsgtgcttacgtatacggag1201gsgatstggcctsccagaacttC33Cttt3序列5:前折叠素a蛋白氨基酸序列(PH0527prefoldinalpha),长度为151个氨基酸1mirmaqnnkeleklayeyqvlqaqaqilaqnlellnlakaevqtvretlenlkkieeekp61eilvpigagsflkgvivdknnaivsvgsgyaversideaisflekrlkeydeaikktqga121laelekrigevarkaqevqqkqsmtsfkvkk序列6:前折叠素蛋白a编码基因核苷酸序列(PH0527prefoldinalpha),长度为456个碱基1GTGATAAGGATGGCTCAGAACAATAAGGAGTTAGAAAAGCTCGCGTACGAGTACCAGGTT61TTACAAGCTCAAGCCCAAATCTTAGCCCAGAACCTTGAGCTTTTGAACTTGGCCAAGGCG121GAAGTTCAAACTGTTAGGGAGACGCTGGAGAACTTAAAAAAGATAGAGGAGGAGAAGCCC181GAAATACTAGTCCCAATAGGGGCTGGTTCATTTTTAAAGGGGGTAATAGTGGATAAGAAC241AACGCAATAGTGAGCGTGGGCTCAGGTTACGCAGTGGAGAGGAGTATAGATGAAGCCATA301AGCTTCCTGGAGAAGAGACTTAAAGAGTATGACGAAGCCATTAAGAAGACACAGGGAGCA361TTAGCGGAACTAGAAAAGAGGATCGGGGAGGTAGCAAGGAAGGCCCAGGAGGTACAGCAA421AAGCAAAGTATGACGAGCTTTAAGGTTAAGAAGTAG序列7前折叠素蛋白P氨基酸序列(PH0532prefoldinbelta);长度为117个氨基酸1mqnippqvqamlgqldtyqqqlqlviqqkqkvqadlneakkaleeietlpddaqiyktvg61tlivkttkekavqelkekietlevrlnalnrqeqkinekvkeltqkiqaalrpptag序列8前折叠素蛋白(3编码基因核苷酸序列(PH0527prefoldinbelta)，长度为354个碱基:1atgcagaacattcctccccaagttcaggcgatgcttggccaactcgatacgtatcagcaa61csgcttcaacttgtwtccagcag己agcagaaggttcaagctgacctaaatga3gct3己g121aaagcccttgaggagstagasscgcttccggatgatgctcsaatttacaagaccgttggs181scgctcatsgtcaagsccac33aggaga3ggccgtccagg3gctta3gg3sasgstcgw241accctagaggtaaggttaaatgccttgsaca.ggcaggaacagaagataaacgagaaggtt301aaggagctcactcagaagattcaagccgctctgaggccgcctaccgctggctga权利要求1.一种高效分解纤维素的酶组合物，其特征在于它具有以下描述氨基酸序列之一的单组分和多组分的蛋白质或多肽(1)内切1，4葡聚糖酶氨基酸序列，序列1；(2)外切β-葡萄糖苷酶氨基酸序列，序列3；(3)前折叠素蛋白，序列5和7；(4)以上三种酶的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且仍然具有纤维素酶活性的蛋白质。2.根据权利要求1所述的高效分解纤维素的酶组合物，其特征在于所述的纤维素酶组合物具有氨基酸序列2、4和6所描述的氨基酸序列，与每个组分具有至少80%的同源性。3.根据权利要求1所述的高效分解纤维素的酶组合物，其特征在于所述的纤维素酶编码基因。4.根据权利要求3所述的纤维素酶编码基因，其特征在于所述的纤维素酶编码基因具有下述核苷酸序列之一(1)内切l,4葡聚糖酶编码基因核苷酸序列，序列2;(2)外切(3-葡萄糖苷酶编码基因核苷酸序列，系列4;(3)前折叠素蛋白编码基因核苷酸序列，序列6和8;(4)以上三种酶编码核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且仍然具有表达纤维素酶活性的突变基因；(5)在O.IXSSC，0.1%SDS，65度杂交洗膜的高严谨特异条件下，可与下列二种酶之-的任何^种酶的编码基因进行DNA序列杂交的核苷酸序列(a)内切l，4葡聚糖酶编码基因核苷酸序列，序列2;(b)外切(3-葡萄糖苷酶编码基因核苷酸序列，系列4;(c)前折叠素蛋白编码基因核苷酸序列，序列6和8。5.根据权利要求3和4所述的纤维素酶组合物，其特征在于所述的纤维素酶组合物编码基因的表达载体质粒pKJ3-endo，pKJ3-gluco禾PpKJ3-endo/gluco含有一个温度敏感型的热启动子，调控下游基因的表达，不需添加昂贵的诱导化学物。6.根据权利要求3和4所述的纤维素酶组合物，其特征在丁所述编码基因的细胞表达系统或基因工程菌，其宿主菌为Escherichiacoli，Bacillussubtilis，yeast禾卩filamentousfungi，它可以表达生产以下之一，之二，或者所有三种蛋白(1)内切1，4葡聚糖酶；(2)外切(3-葡萄糖苷酶；(3)前折叠素蛋白。7.根据权利要求5和6所述的纤维素酶编码基因的细胞表达系统或基因工程菌，使用此菌体生产纤维素酶的发酵工艺流程和提取工艺流程，使用此菌体在这种发酵工艺流程中进行培养，通过提取工艺流程分离提纯酶组分，可以生产具有单组分或多组分的纤维素酶组合物。8.根据权利要求1或2所述的纤维素酶在纤维素降解中的应用。9.根据权利要求1或2所述的纤维素酶编码基因在纤维素降解中的应用。10.本发明所含盖的单组分或多组分的纤维素酶组合物，在工业纸衆加工，纺织品处理，衣物洗涤，中药提取，生物石油生产，石油开采，生物降解废物及污水处理，农业动物饲料高温制粒加工，食品加工面包焙烤，啤酒酿造方面的用途。全文摘要本发明涉及高效分解纤维素的酶组合物，它是一种能在高温和强酸的条件下，有效分解纤维素的重组生物酶，此酶组合物由来自于古细菌Pyrococcushorikoshii的2种酶和1种辅助蛋白构成1.内切1，4葡聚糖酶，2.外切β-葡萄糖苷酶，3.前折叠素蛋白；这个酶组合物中3种蛋白质的比例以1∶1∶0.1-1组成为佳。上述前两种酶的氨基酸残基序列经过缺失分析并优化后的酶基因与另一个含有辅助蛋白(前折叠素蛋白)的α和β2个亚基基因分别受一个温度敏感型的热启动子调控并在细菌中高效表达；辅助蛋白对2种酶有大幅度提高活性的作用；所以本发明纤维素酶组合物能够在高温和强酸性条件下高效分解纤维素成为单糖；其潜在用途在于分解纤维素类麦秸，为生物石油生产提供原料。文档编号C12N9/42GK101619309SQ200910040540公开日2010年1月6日申请日期2009年6月24日优先权日2009年6月24日发明者荣郑,郑春阳申请人:荣郑