用内切葡聚糖酶处理纺织品的方法
【专利说明】用内切葡聚糖酶处理纺织品的方法
[0001] 序列表的引用
[0002] 本申请包含一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在 此。 发明领域
[0003] 本发明涉及尤其在生物磨砂和生物抛光工艺中，用于通过将纺织品用一种具有内 切葡聚糖酶活性的分离的多肽进行处理来制造纺织品的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 纤维素酶或纤维素分解酶是涉及纤维素水解的酶。已知涉及三种主要类型的纤维 素酶，即内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β -葡糖苷酶。
[0006] 纤维素酶存在广泛的工业应用。在纺织工业中，在牛仔布精加工中使用纤维素酶 以使用生物磨砂工艺在牛仔布上建立流行的石洗外观。还将纤维素酶用于例如使用生物抛 光工艺来清洁绒毛和预防球粒在棉布衣表面上的形成。
[0007] WO 9629397披露了在工业应用例如洗衣组合物中具备用于以下的性能的酶制品： 用于新制造的纺织品的生物抛光，用于对纤维织物或衣服提供磨损的样子，并且用于处理 纸浆。WO 9629397中的SEQ ID No:20是粪生粪壳菌纤维素酶的部分序列。
[0008] WO 2010/076388披露了在低温下具有实质性性能的真菌内切葡聚糖酶；该内切 葡聚糖酶被用于处理纤维素材料，尤其在纺织工业上，例如在生物精加工或生物磨砂中。
[0009] WO 2008/151999披露了用于在单浴中处理纺织品的组合的漂白剂清洁、生物抛光 和染色的一步工艺，其中这个使用纤维素酶的生物抛光步骤可在与染料相同的浴中进行。 [0010] 在本领域中对新用于获得具有良好磨损效果和/或在生物抛光工艺中降低的起 球形成趋势（尤其在低温下）的纤维素纺织品织物的内切葡聚糖酶和方法存在持续需要。
[0011] 本发明目标是满足这些需要。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明涉及一种用于通过将纺织品用选自下组的一种具有内切葡聚糖酶活性的 分离的多肽进行处理而处理纺织品的方法，该组由以下各项组成：
[0014] (a) -种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80%序列一致性的多肽；
[0015] (b) -种由在中、中-高、高、或非常高严谨度条件下与⑴SEQ ID NO: 1的成熟多 肽编码序列或（ii) (i)的全长互补链杂交的多核苷酸编码的多肽；
[0016] (c) -种由与SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列具有至少80%序列一致性的多核 苷酸编码的多肽；
[0017] (d) -种在一个或多个（例如若干个）位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的 SEQ ID NO: 2的成熟多肽的变体；以及
[0018] (e) -个（a)、（b)、（c)或（d)的多肽的片段，该片段具有内切葡聚糖酶活性；
[0019] 其中该方法是在15°C -65°C的温度范围下进行。
[0020] 在一个实施例中，该多肽获得自粪壳菌属，优选地获得自粪生粪壳菌。在一个实施 例中，该方法在4-8的pH范围下进行。
[0021] 在一个实施例中，该处理纺织品的方法是生物磨砂工艺。
[0022] 在一些实施例中，该生物磨砂工艺可进一步包括选自下组的一种或多种酶，该组 由以下各项组成：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、果胶酶、半纤维素酶以及纤维素酶。
[0023] 在一些实施例中，该处理纺织品的方法是生物抛光工艺。在一些实施例中，该方法 是在一个浴中用一种染料进行的。在一些实施例中，该方法是在一个浴中用过氧化氢酶进 行的。
[0024] 在一些实施例中，该处理纺织品的方法是一种用于制造纺织品的方法。在一些实 施例中，该纺织品被从织物制备为衣服。
[0025] 在一些实施例中，该纺织品是含纤维素的或纤维素的纺织品。
[0026] 本发明的优点是，该方法可在低温下进行，例如50°C以下，以使得在纺织品制造工 艺中节省能源。本发明的方法可进一步显示与染色步骤的良好兼容性。
[0027] 发明详细说明
[0028] 如在此使用的，单数形式"一个"、"一种"以及"该"包括复数个指示物，除非上下 文中另外明确指明。因此，例如提到"一种过氧化物酶"包括使用一种或多种过氧化酶。一 种方法的"一个步骤"意指至少一个步骤，并且它可以是一个、两个、三个、四个、五个或甚至 更多个方法步骤。
[0029] 如在此使用的，相对于对纺织品的多个酶处理的术语"顺序的"意指第二个指定的 酶处理是在执行第一个指定的酶处理之后执行的。顺序的处理可由中间的洗涤步骤分开。 顺序的酶处理是在"相同的浴或不同的浴中执行。"在相同的浴中"意指实质地相同的液体 而没有中间的洗涤。单浴顺序的处理可包括在处理之间的PH调节、温度调节，和/或添加 盐、活化剂、介导物等等，但不应包括洗涤或漂洗。
[0030] 如在此使用的，相对于对纺织品的多个酶处理的术语"同时的"意指第二个指定的 酶处理是与第一个指定的酶处理同时执行（即至少部分地与其重叠）。同时的酶处理必定 "在相同的浴中"执行而没有中间的洗涤步骤。
[0031] 定义
[0032] 内切葡聚糖酶：术语"内切葡聚糖酶"意指一种内切-1，4-(1，3 ;1，4)-β-D-葡聚 糖4-葡聚糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纤维素、纤维素衍生物（如羧甲基纤维素和羟 乙基纤维素）、地衣多糖中的1，4-β-D-糖苷键以及混合的β-1，3葡聚糖如谷类β-D-葡 聚糖或木葡聚糖中的及含有纤维素组分的其他植物材料中的β_1，4键的内切水解。可以 通过测量底物粘度的降低或由还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖 酶活性（张（Zhang)等人，2006,生物技术进展（Biotechnology Advances) 24:452-481)。 内切葡聚糖酶活性还可根据高斯（Ghose)，1987,纯粹与应用化学（Pure and Appl. Chem. )59:257-268的264页的VI部分的程序，使用羧甲基纤维素（CMC)作为底物来确定。
[0033] 出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定内切葡聚糖酶活性。在一方面，本 发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至 少90%、至少95%、或至少100%的内切葡聚糖酶活性。
[0034] 典型地，该内切葡聚糖酶具有至少两个功能结构域、一个碳水化合物结合模块 (CBM)和一个催化模块。该催化模块被定义为一种氨基酸序列，其能够酶促裂解纤维素，如 具有内切葡聚糖酶活性。该催化模块不被认为是一种碳水化合物-结合模块。一种"接头 序列"连接这两个功能模块。
[0035] 碳水化合物-结合模块：术语"碳水化合物-结合模块"（CBM)被定义为一种可以 结合至底物的氨基酸序列。例如，CBM被描述于布莱斯顿（Boraston)等人，生物化学杂志 (2004) 382, 769-781和被描述于多姆等人，约翰N.萨德勒和迈克尔H.彭纳（Eds. )，ACS专 题论文集系列第618号，1995。认为结合至底物的CBM增加该酶的催化活性部分的功效。
[0036] 该术语CBM现在普遍采用；然而，术语"纤维素-结合结构域"（CBD)被用来描述 CBM的子集，其特异性地结合至纤维素底物。结合上下文，具有内切葡聚糖酶活性的多肽的 CBM或CBD可互换地使用。
[0037] 家族45或家族GH45或CEL45 :术语"家族45 "或"家族GH45 "或" CEL45 "在 此意指根据亨利萨特（Henrissat)B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分 类(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities)，生物化学杂志（Biochem.J. )280:309-316 ;和亨利萨特B.和贝洛赫 (Bairoch)A.，1996,修正糖基水解酶的基于序列的分类（Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志 316:695-696 属于糖昔水解酶 家族45的多肽。碳水化合物结合模块经常与催化模块编码酶（如糖基水解酶）相关联。纪 廉（Guill6n)D，桑切斯（Sdinchez) S，罗德里格斯-萨诺贾（Rodriguez-Sanoja)R.碳水化合 物-结合结构域：生物角色的多重性（Carbohydrate-binding domains:multiplicity of biological roles)。应用微生物学&生物技术二月2010:85(5):1241。可得到于：EDS基 础索引，伊普斯威奇，MA。
[0038] 粪生粪壳菌Cel45纤维素酶（缩写为Sf Cel45)及SEQ ID N0:2的成熟肽（SEQ ID NO: 2的第22至294位氨基酸）。结合结构域已知可以与纤维素结合和相互作用。认为 发现于Sf Cel45中的碳水化物结合结构域在某种程度上负责发现于本发明中的酶在应用 中的特殊性能。
[0039] 等位基因变体：术语"等位基因变体"意指占据同一染色体基因座的基因的两种或 更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多 态性。基因突变可以是沉默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0040] CDNA :术语"cDNA"是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分 子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。 早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的 步骤进行加工，包括剪接。
[0041] 编码序列：术语"编码序列"意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编 码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、 GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种 基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0042] 控制序列：术语"控制序列"意指对编码本发明的成熟多肽的多核苷酸进行表达所 必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是原生的（即，来自 相同基因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序 列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止 子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序 列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列 可以提供有多个接头。
[0043] 表达：术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修 饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0044] 表达载体：术语"表达载体"是指包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地与提供了 其表达的控制序列相连接的线性或环状DNA分子。
[0045] 片段：术语"片段"意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个 或多个（例如，若干个）氨基酸的多肽或催化结构域；其中，该片段具有溶菌酶活性。在一个 方面，一个片段包括SEQ ID NO: 2的成熟多肽的氨基酸数目的至少85%、90%、以及95%。
[0046] 高严谨度条件：术语"高严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而 言，遵循标准 DNA 印迹（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0.3% SDS、200 微 克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料 最终使用0. 2X SSC、0. 2% SDS，在65°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0047] 宿主细胞：术语"宿主细胞"意指任何细胞类型，该细胞类型对于用包含本发明的 多核苷酸的核酸构建体或表达