专利名称：：利用透明颤菌血红蛋白基因表达的重组钝齿棒杆菌及其应用的制作方法利用透明颤菌血红蛋白基因表达的重组钝齿棒杆菌及其应用
技术领域：
利用透明颤菌血红蛋白基因表达的重组钝齿棒杆菌及其应用，本发明涉及利用透明颤菌血红蛋白基因在钝齿棒杆菌中的表达，因而提高了重组钝齿棒杆菌菌体对氧的利用率，以提高L-精氨酸产量，属于基因工程
技术领域：
。技术背景L-精氨酸(L-arginine)是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，是合成蛋白质肌酸的重要原料，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物，具有多种独特的生理和药理作用。L-精氨酸在临床医药、食品、化妆品及有关生物研究领域中用途广泛。发酵法是目前L-精氨酸商业化生产比较有效和经济的方法。目前发现溶氧对于发酵法生产L-精氨酸有重要影响。氧气在好氧发酵生产L-精氨酸过程中，通常既是营养因素，又是环境因素，菌体的新陈代谢与氧气呼吸密切有关。氧气的供应不足可能会导致微生物细胞代谢转向所不需要的化合物的产生。解决该问题的传统方法一般都局限于提高细胞生长环境中的氧气传递性质，其中包括通入纯氧、通气/搅拌优化配置以及通过加入化学物质如正十二烷或全氟碳(FomneF66)来增加液相中氧气的溶解度；解决氧需求问题的另一途径则是利用基因工程技术来提高细胞自身对氧气的利用率。1988年，v如基因被成功克隆，并在大肠杆菌中得到表达。Irtreoscilla和大肠杆菌中表达的VHb都表明其在细胞中处于氧限条件下促进细胞生长、提高细胞培养密度和蛋白质合成能力。VHb这一特性在耗氧量大，溶氧易成为限制性因素的抗生素工业、基因工程菌高密度发酵和供氧受限制的动、植物细胞培养过程中具有良好的应用前景。借助胞内表达的VHb蛋白可望降低细胞生长和产物合成对溶氧的敏感程度，使过程适应较低的溶氧水平从而显著降低过程能耗。自从VHb在大肠杆菌中成功地进行表达以来，它已越来越多地应用到微生物发酵工业的许多领域，并取得了显著效果。1990年，Khosravi和Webster等人将VHb应用于a-淀粉酶的生产，发现VHb对a-淀粉酶产量的提高具有很大的作用。此外，在溶氧水平偏低的情况下将i^6基因转入青霉素酰化酶(pAC)基因工程菌中可以明显提高pAC的表达量。vg6基因不仅能在大肠杆菌中成功表达，在欧文氏菌(Erwinia)中也同样起作用。中国科学院上海生物工程研究中心通过实验证实，VHb在维生素C两步法生产中改善了欧文氏菌的生产状况，且在发酵过程中，通气状况越差，VHb的效果越明显。此外，VHb在链霉菌(Streptomyces)、酵母(Saccharomycescerevisiae)乃至真核生物霉菌(Acremoniumchrysogenum)中也都能成功表达，并大大改善发酵过程中的供氧矛盾，大幅度提高产物的产量。综上所述，透明颤菌血红蛋白能够从分子水平上控制vg6基因克隆菌对氧气的利用能力，因此能在限氧条件下促进细胞生长和产物合成，从而大幅度提高发酵过程中目的产物的产量和收率。针对钝齿棒杆菌中精氨酸合成途径复杂、发酵过程中需要消耗大量的氧气、通过氧化NAD(P)H或FADH形成NAD(P)或FAD产生能量ATP来维持细胞代谢，单纯依靠动力供氧难以满足其对氧气的需求的问题。本发明利用来源于透明颤菌、已经被广泛应用证明能提高工业微生物发酵过程中氧气利用效率、降低能耗的血红蛋白基因vg6来解决L-精氨酸发酵过程中的供氧问题。
发明内容本发明的目的是提供一株透明颤菌血红蛋白基因表达的重组钝齿棒杆菌，该重组菌能表达透明颤菌血红蛋白VHb，因而提高了重组钝齿棒杆菌菌体对氧的利用率，来提高发酵法生产L-精氨酸的产量。本发明的技术方案一株透明颤菌血红蛋白基因表达的重组钝齿棒杆菌，其分类命名为,屯齿棒杆菌(Co7"ekcten'wwcrewa加w)SYPA/pJCl画toc-vg6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M208132。所述的重组钝齿棒杆菌，其构建所用的表达载体pJCl-toc-vg6，采用toc启动子。所述的重组钝齿棒杆菌，是首次扩增了来自透明颤菌血红蛋白基因vgZ)。所述的重组钝齿棒杆菌，能表达透明颤菌血红蛋白VHb，因而提高了重组钝齿棒杆菌菌体对氧的利用率，来提高发酵法生产L-精氨酸的产量。所述重组钝齿棒杆菌的构建方法，将来自于透明颤菌血红蛋白基因vg6，构建钝齿棒杆菌表达载体pJCl-toc-vg6;将该表达载体pJCl-toc-v^)电转入钝齿棒杆菌SYPA中，获得了重组钝齿棒杆菌(Co7恥6""e;n'wwcrewafww)(1)获得toC启动子根据GenBank公布的氯霉素乙酰转移酶基因Mf序列，设计引物，通过PCR技术从质粒pAC中扩增出o^序列，引物设计如下pCml100F五coRI:5，陽CGCGA4rrCTTCGAATTTCTGCCATTCATC-3，pCml100R倫dIII:5，-CGCii^ZJGCGGTGCTTTTGCCGTTACG-3'以pAC为模板，以pCmllOOF五coRI和pCmll00R历"dIII为引物，PCR获得含有&0^与/^'"(1111两个酶切位点的0^片段，与pMD18-T连接，构建克隆载体pMD18-T-c^，将克隆载体pMD18-T-c^转化至co//JM109受体菌，涂布于含氨苄青霉素Amp、异丙基-P-D-硫代半乳糖苷IPTG、半乳糖类似物X-gal的LB琼脂平板上，37"C培养过夜后，平板上长出许多蓝色、白色菌落；随机挑取白色克隆，酶切鉴定后测序，用EcoRI与///"dill双酶切得到含有&oRI与历"dlll两个酶切位点的c^片段，与同样酶切的pEtac连接，转化大肠杆菌JM109后在—那霉素抗性LB平板筛选得到转化子，获到质粒pEtac，"根据pEtac的全序列及cW的序列，设计引物扩增-toc-c^-基因；引物设计如下PtacF~I:5'-AAAACrGC4GGGAGCTTATCGACTGCACG-3'PT7Ri^I:5'-AAAACrGC4GATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC画3'以pEtac-c^为模板，PtacF尺"I，PT7R尸Wl为引物，高保真PCR获得基因片段-toc-pramofer-c^-r7^Tm'"ator-，与同样酶切的pJCl连接转化，涂布卡那霉素抗性平板，挑取转化子，酶切验证，即获得重组质粒pJCl-toc-^"(2)构建钝齿棒杆菌表达载体pJCl-toc-vg6:根据GenBank中公布的透明颤菌血红蛋白基因vgZ>核苷酸序列设计引物如下F五coRI:5，-ACCCG6^r7UATGTTGGATCAACAGAC-3'R历"孤5，-ACCCG"GCmTATTCAACAGCTTGAG-3'以质粒pYG013为模板，反应体系为取DNA模板1(iL，10xExPCR缓冲液5pL，上、下游引物各lpL，dNTPs4pL，ExTaqDNA聚合酶0.5pL，总反应体积为50^iL;PCR扩增参数为94"C变性1.5min，55"C复性1min，72"C延伸1min，28个循环；所得片段胶回收后与克隆载体pMD18-T连接，转化Eco"JM109,挑取阳性转化子；提取质粒酶切鉴定，并将重组质粒命名为pMD18-T-vg6，并测序；将pMD18-T-vg6双酶切，胶回收v^)片段，将其与经相同酶切线性化的表达载体pJCl-toc连接，得到重组表达质粒pJCl-toc-vg6;(3)重组钝齿棒杆菌SYPA/pJCl-toc-Vg6的获得提取质粒pJCl-toc-vg6，用电转法转化钝齿棒杆菌SYPA，涂布于含10pg/mL卡那霉素的含葡萄糖LB平板，36h后长出转化子，即获得重组钝齿棒杆菌SYPA/pJCl-fac-vg6。用所述重组钝齿棒杆菌发酵生产L-精氨酸的方法出发菌株为重组钝齿棒杆菌SYPA/pJCl-toc-vg6;培养基组成摇瓶种子培养基以g/L计葡萄糖30，玉米浆20，(NH4)2S0420，KH2PO4l，MgS04'7H200.5，尿素1.5;pH7.07.2，121。C灭菌20min，装液量20mL/250mL;摇瓶发酵培养基以g/L计葡萄糖150，玉米浆4，(NH4)2S0420，KH2P041.5，MgS047H2O0.5，FeSO47H200.02，MnSO4H200.02，生物素8X1(T5，L-组氨酸5X1(T4，CaCO330;pH7.07.2,12rC灭菌10min，20mL/250mL三角瓶；罐上发酵培养基以g/L计葡萄糖150，玉米浆4，(NH4)2S0420，KH2P041.5，MgS047H200.5，FeS047H200.02，MnS04H200.02，生物素8X10-5，L-组氨酸5X10"，氨水控制pH7.07.2，12rC灭菌10min，装液量3L/5L发酵罐；培养条件种子培养于固体培养基平板中挑取钝齿棒杆菌单菌落接种于种子培养基中，150r/min，30。C培养15h;摇瓶发酵培养种子培养后，按5%接种量转接到发酵培养基中置往复式摇床，110r/min，30。C培养96h;5L发酵罐培养装液量3L，接种量5%10%，31°C，转速600r/min，通气量3L/min，用氨水连续流加控制pH为7.07.2，培养96h。本发明的有益效果钝齿棒杆菌(Coo^e6acfer/wmc^wafwm)SYPA是革兰氏阳性工业用菌株，尚未见钝齿棒杆菌的遗传表达体系的研究报道。本发明以氯霉素乙酰转移酶基因(c"O作为报告基因，成功构建了含有toc启动子的钝齿棒杆菌表达系统，并对其在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中的启动子活性进行研究后发现,在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中toc启动子均具有启动子功能，且在不诱导的条件下也存在一定的本底表达。在此基础上，成功构建了携带有来源于透明颤菌血红蛋白基因vg6的表达质粒pJCl-toc-vg6，并电转入钝齿棒杆菌SYPA。利用CO差光谱法对重组菌表达的透明颤菌血红蛋白进行了活性及定量检测。并对重组菌C.c.(pJCl-to-i^)的发酵特性进行了初步分析。结果显示，发酵过程中重组菌的产酸能力比原始菌提高了13.0%，菌浓提高了10.9%。图l重组质粒pJCl-toc-cW的构建。图2质粒pEtac-c^的酶切验证图。图3质粒pJCl-toc-c"f的酶切验证图。图4启动子强度的初步确定；Ctac(b):诱导前C.C.(pJCl-toocW);Ctac(a):诱导后C.C.(pJCl-toc-c"f)。图5重组质粒pJCl-toc-vg6的构建。图6质粒pJCl-toc-vg6的酶切验证图；1:DL2000Marker;2:-toc-vg6-PCR产物；3:pJCl/五coRI+Z/z'"dIII双酶切；4:pJCl-toc-vg6/五coRI+历"dIII双酶切；5:XDNA////"dIIImarker;图7钝齿棒杆菌SYPA的CO差光谱；图8重组钝齿棒杆菌C.C.(pJCl-toc-vg6)，IPTG诱导前的CO差光谱；图9重组钝齿棒杆菌C.C.(pJCl-toc-VgZ>)，IPTG诱导后的CO差光谱；生物材料样品保藏一株透明颤菌血红蛋白基因表达的重组钝齿棒杆菌，其分类命名为钝齿棒杆菌(Cwy"eZ^cteWwmcrewWwm)SYPA/pJCl-tac-vg6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2008年9月22日，保藏编号为CCTCCNO:M208132。具体实施方式实施例1:以氯霉素乙酰转移酶基因c^H乍为报告基因的钝齿棒杆菌遗传表达体系的构建根据GenBank公布的氯霉素乙酰转移酶基因c^序列，设计引物，通过PCR技术从质粒pAC中扩增出c^序列。引物设计如下pCml100F￡coRL5，-CGCO^rrCTTCGAATTTCTGCCATTCATC-3，pCml100R倫dIII:5,-CGC^GCr7UCGGTGCTTTTGCCGTTACG-3'以质粒pAC为模板，以pCmllOOF五coRI和pCmll00R历'"dIII为引物，反应体系为取DNA模板1^L，10xExPCR缓冲液5iaL，上、下游引物各1^L，dNTPs4(iL，ExTaqDNA聚合酶0.5jiL，总反应体积为50pL。PCR扩增参数为94'C变性1.5min，55。C复性1min，72t:延伸1min，30个循环；PCR获得含有五coRI与/7/"dlII两个酶切位点的caf片段，与pMD18-T连接，构建克隆载体pMD18-T-cafRl+州wdIII)。将克隆载体pMD18-T-c加CEcoRI+Z//"dIII)转化至大肠杆菌五.co//JM109中，涂布于含氨苄青霉素Amp、异丙基-e-D-硫代半乳糖苷IPTG、半乳糖类似物X-gal的LB琼脂平板上，37"C培养过夜后，平板上长出许多蓝色、白色菌落。随机挑取白色克隆，酶切鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序，用五coRI与77/"d111双酶切得到含有&01^与///^1111两个酶切位点的c^片段，与同样酶切的pEtac连接，转化大肠杆菌JM109后在卡那霉素抗性LB平板筛选得到转化子，获到质粒pEtac-c^。图2所示为重组质粒pEtac-c^酶切验证结果。根据pEtac的全序列及c^的序列，设计引物扩增-toc-o^-基因。引物设计如下PtacF尸WI:5'-AAAACrGC4GGGAGCTTATCGACTGCACG-3'PT7R尸WI:5'國AAAACrGC4GATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC画3'以pEtac-cW为模板，PtacFPWI，PT7RA'fl为引物，反应体系为取DNA模板1^L，10xExPCR缓冲液5(iL，上、下游引物各1^iL,dNTPs4pL，ExTaqDNA聚合酶0.5nL，总反应体积为50PCR扩增参数为94。C变性1.5min，57°。复性1min，72t:延伸1.5min，35个循环；PCR获得基因片段-toc-pramo^-c^-r7fem/"加or-，与同样酶切的pJCl连接转化，涂布卡那霉素抗性平板，挑取转化子，酶切验证，即获得重组质粒pJCl-toc-c^(图1)。或将所得基因片段-toc-;ramofer-cW-77^Tm'wator-以相同方法连接pMD18-T载体后测序。然后用尸Mlcaf-r7ferm!'"afor-后，备用，使得不必每次进行PCR扩增，可以简化操作。图3所示为Jt组质粒pJCl-tac-caf酶切验证结果。重组质粒pEtac-c^经五coiI与T/z'"^in双酶切后获得约650bp和5622bp的DNA片段，分别与基因片段和质粒pEtac的大小一致。重组质粒pJCl-toc-c^经尸WI酶切后获得约1098b的DNA片段，大小与PCR获得的-toc少ramoter-caf-r7te/7m'"她r-片段一致。以上结果证明重组质粒pJCl-toc-c^构建正确。提取质粒pJCl-toc-c^，用电转法转化钝齿棒杆菌SYPA，涂布于含20吗/mL卡那霉素的含葡萄糖LB平板，约36h后长出转化子。随机挑取若干菌落于LB培养基中培养后，提取质粒。质粒的酶切结果及线性化大小都与目的质粒一致。实施例2:以氯霉素乙酰转移酶基因^H乍为报告基因的钝齿棒杆菌遗传表达体系的初步评价挑取在含20pg/mL卡那霉素的平板生长的钝齿棒杆菌菌落接种LB培养基，于3(TC摇床培养至OD6(X)达到0.6后，加入IPTG至终浓度为20pmol/L，诱导4h。将诱导后的菌体接种于不同浓度的氯霉素抗性平板上，培养生长，初步确定启动子的强度。结果发现诱导前后的重组子pJCl-toc-^能在氯霉素抗性平板上生长，而对照(不含重组质粒pJCl-toc-c^)不能在氯霉素抗性平板上生长。说明加启动子在钝齿棒杆菌中具有启动子的功能。且toc启动子在钝齿棒杆菌中有本底表达。接下来，将诱导前后的C.c.(pJCl-加-^)分别接种于不同浓度的氯霉素抗性平板上，来初步测定各启动子的强度。图4所示，为C.c.(pJCl-toc-c加)的表达量。为了更准确的确定启动子的强弱，作者进一步对Cx.(pJCl-toc-o^)所表达的氯霉素乙酰转移酶的酶活进行了测定。结果如表l所示，比活力的总趋势与平板实验是一致的，toc启动子在诱导前有本底表达，诱导后的表达量更高。表l不同菌株的CAT比活力<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根据GenBank中公布的透明颤菌血红蛋白基因vg6核苷酸序列设计引物如下F￡coRI:5，-ACCCGG^rrCATGTTGGATCAACAGAC-3，R州禮I:5，-ACCCGA4GCT7TTATTCAACAGCTTGAG-3'以质粒pYG013为模板，反应体系为取DNA模板1piL，10xExPCR缓冲液5(iL，Pvg6F￡coRI、Pvg6R///w/in引物各1pL，dNTPs4[iL，ExTaqDNA聚合酶0.5iiL，总反应体积为50pL;PCR扩增参数为94'C变性1.5min，55"C复性lmin，72'C延伸lmin，28个循环；所得片段胶回收后与克隆载体pMD18-T连接，转化Eo^'JM109，挑取阳性转化子；提取质粒酶切鉴定，并将重组质粒命名为pMD18-T-v^)，并测序；将pMD18-T-vg6双酶切，胶回收vg6片段，将其与经相同酶切线性化的表达载体pJCl-toc连接，得到重组表达质粒pJCl-tac-v^;如图6所示，重组质粒pJCl-toc-v^酶切验证结果。重组质粒pJCl-toc-vgZ)经尸WI酶切后获得约853bp的DNA片段，大小与PCR获得的-toe-pramo^-v^)fenmVwtor-片段一致。以上结果证明重组质粒pJCl-toe构建正确。提取质粒pJCl-toc-vg6，用电转法转化钝齿棒杆菌SYPA，涂布于含10|ig/mL卡那霉素的葡萄糖LB平板，约36h后长出转化子。随机挑取若干菌落于LB培养基中培养后，提取质粒。质粒的酶切结果及线性化大小都与目的质粒一致，证明钝齿棒杆菌重组菌C.c.(pJC1-toc-vg6)构建成功。成功获得重组大肠杆菌JM109(pJCl-toc-vg6)和重组钝齿棒杆菌C.c.(pJCl-toc-"^6)后，分别对其进行VHb的表达研究，并通过CO差光谱法测定了VHb的表达量。如图7至图9所示，以原始钝齿棒杆菌SYPA做对比，重组钝齿棒杆菌C.c.(pJCl-toc-vg6)在IPTG诱导前后，与CO结合后在419nm处均出现吸收峰，证明)基因以钝齿棒杆菌为宿主细胞，在toc启动子作用下，能表达出具有活性的透明颤菌血红蛋白。在此基础上，根据检测到的吸收峰的大小及用于检测的菌体量可以计算出单位菌体VHb的表达量。计算所得诱导前后的表达量分别为2.4nmol/L和3.4nmol/L(表2)。_表2钝齿棒杆菌VHb表达的定量分析_<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从重组钝齿棒杆菌C.c.(pJCl-加-v^)VHb的表达量来看，诱导后的表达量均有所提高，c^的表达一致，但差距有所縮小，这可能与蛋白种类及检测方法有关。实施例4:用所述重组钝齿棒杆菌发酵生产L-精氨酸发酵条件如上本发明的技术方案所述。将重组钝齿棒杆菌C.c.(pJCl-toc-vg。接种于摇瓶发酵培养基中，于3(TC，110r/min的往复摇床培养96h，并将重组菌株分为两组，一组每隔24h加一次不同浓度的IPTG，另一组不加IPTG。对照组为钝齿棒杆菌出发株。发酵结束后，分别测定了菌浓，L-精氨酸产量及葡萄糖的消耗量见表3。表3钝齿棒杆菌重组株与出发株的发酵特性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注表格中所示为发酵培养基中IPTG终浓度。不加IPTG的钝齿棒杆菌重组株在菌浓和产酸方面都较优于出发株，重组菌株的产酸能力比出发菌株提高了13.0%，菌浓提高了10.9%，且重复性良好。这可能是由于tac启动子存在本底表达，在不加入IPTG的情况下，仍能表达一定量的透明颤菌血红蛋白，因而促进了菌体对氧的利用率，进而促成L-精氨酸产量的提高。IPTG用量较少时(lmmol/L)，菌浓和产酸都与不加IPTG的重组菌差异甚小，这是因为钝齿棒杆菌为革兰氏阳性菌，细胞壁较厚因而渗透性受到一定影响，所以，IPTG加量少时，对菌体基本没有影响，发酵特性与不加IPTG时相似。但随着IPTG浓度的增加，重组菌在菌浓和产酸两方面有所下降。这可能是因为IPTG浓度较大时，对菌体存在一定的毒副作用，因而不利于菌体产酸。因此，采用此重组钝齿棒杆菌发酵产精氨酸时选择不加IPTG诱导。权利要求1、一株透明颤菌血红蛋白基因表达的重组钝齿棒杆菌，其分类命名为钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)SYPA/pJC1-tac-vgb，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM208132。2、根据权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌，其特征是构建所用的表达载体pJC1vgZ)，采用toc启动子。3、根据权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌，其特征是首次扩增了来自透明颤菌血红蛋白基因vg6。4、根据权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌，其特征是表达透明颤菌血红蛋白VHb，因而提高了重组钝齿棒杆菌菌体对氧的利用率，来提高发酵法生产L-精氨酸的产量。5、权利要求1所述重组钝齿棒杆菌的构建方法，其特征是将来自于透明颤菌血红蛋白基因vg6，构建钝齿棒杆菌表达载体pJCl-toc-vg6;将该表达载体pJCl-toc-vg6电转入钝齿棒杆菌SYPA中，获得了重组钝齿棒杆菌(Co/^we6acten'應crewa^/m)SYPA/pJCl-toc画vg6;(1)获得toC启动子根据GenBank公布的氯霉素乙酰转移酶基因c^序列，设计引物，通过PCR技术从质粒pAC中扩增出c^序列，引物设计如下pCml100F五coRI:5，-CGCG^7TCTTCGAATTTCTGCCATTCATC-3，pCml100R历"dIII:5，画CGC44GC7TGCGGTGCTTTTGCCGTTACG-3，以pAC为模板，以pCm]100F五coRI和pCmllOOR历"dIII为引物，PCR获得含有五coRI与/^'wdni两个酶切位点的c^片段，与pMD18-T连接，构建克隆载体pMD18-T-c"/，将克隆载体pMD18-T-c"f转化至五.co//JM109受体菌，涂布于含氨苄青霉素Amp、异丙基-P-D-硫代半乳糖苷IPTG、半乳糖类似物X-gal的LB琼脂平板上，37。C培养过夜后，平板上长出许多蓝色、白色菌落；随机挑取白色克隆，酶切鉴定后测序，用五coRI与///"dill双酶切得到含有五coRI与///"dIII两个酶切位点的■片段，与同样酶切的pEtac连接，转化大肠杆菌JM109后在卡那霉素抗性LB平板筛选得到转化子，获到质粒pEtac-Mt;根据pEtac的全序列及caf的序列，设计引物扩增-toc-c^-基因；引物设计如下PtacF尸WI:5'-AAAACrGC4GGGAGCTTATCGACTGCACG-3'PT7R尸"I:5'-AAAACrGC4GATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC-3'以pEtac-c^为模板，PtacF尺"I，PT7R尺Wl为引物，高保真PCR获得基因片段-toc-pramofer-c^-77fenm'"ator-，与同样酶切的pJCl连接转化，涂布卡那霉素抗性平板，挑取转化子，酶切验证，即获得重组质粒pJCl-toc-^t;(2)构建钝齿棒杆菌表达载体pJCl-toC-Vg6:根据GenBank中公布的透明颤菌血红蛋白基因vg6核苷酸序列设计引物如下:F五coRI:5，隱ACCCGG"rrCATGTTGGATCAACAGAC-3'Pvg6R历"週5，-ACCCG^4GCT7TTATTCAACAGCTTGAG-3'以质粒pYG013为模板，反应体系为取DNA模板1(iL，10xExPCR缓冲液5|aL，上、下游引物各1^L，dNTPs4|iL，ExTaqDNA聚合酶0.5^L，总反应体积为50pL;PCR扩增参数为94'C变性1.5min，55。C复性1min，72"C延伸1min，28个循环；所得片段胶回收后与克隆载体pMD18-T连接，转化五.w//JM109，挑取阳性转化子；提取质粒酶切鉴定，并将重组质粒命名为pMD18-T-vg6,并测序；将pMD18-T-vg6双酶切，胶回收v^片段，将其与经相同酶切线性化的表达载体pJCl-toc连接，得到重组表达质粒pJCl-toc-vg6;(3)重组钝齿棒杆菌SYPA/pJCl-toc-vg6的获得提取质粒pJCl-toc-vg6，用电转法转化钝齿棒杆菌SYPA，涂布于含10|iig/mL卡那霉素的含葡萄糖LB平板，36h后长出转化子，即获得重组钝齿棒杆菌SYPA/pJCl-toc画—。6、用权利要求1所述重组钝齿棒杆菌发酵生产L-精氨酸的方法，其特征是出发菌株为重组钝齿棒杆菌SYPA/pJCl-toc-vg6;培养基组成摇瓶种子培养基以g/L计葡萄糖30，玉米浆20，(NH4)2S0420，KH2PO4l，MgS04'7H200,5，尿素1.5;pH7.07.2，121。C灭菌20min，装液量20mL/250mL;摇瓶发酵培养基以g/L计葡萄糖150，玉米浆4，(NH4)2S0420，KH2P041.5，MgS047H200.5，FeSO47H200.02，MnSO4H200.02，生物素8Xl(T5，L-组氨酸5X1(T4，CaC0330;pH7.07.2，121。C灭菌10min，20mL/250mL三角瓶；罐上发酵培养基以g/L计葡萄糖150，玉米浆4,(NH4)2S0420，KH2P041.5，MgS047H200.5，FeS047H200.02，MnS04H200.02，生物素8X10-5，L-组氨酸5X10-4，氨水控制pH7.07.2，12rC灭菌10min，装液量3L/5L发酵罐；培养条件种子培养于固体培养基平板中挑取钝齿棒杆菌单菌落接种于种子培养基中，150r/min，30'C培养15h;摇瓶发酵培养种子培养后，按5%接种量转接到发酵培养基中置往复式摇床，110r/min，30。C培养96h;5L发酵罐培养装液量3L，接种量5%10%，31°C，转速600r/min，通气量3L/min，用氨水连续流加控制pH为7.07.2，培养96h。全文摘要利用透明颤菌血红蛋白基因表达的重组钝齿棒杆菌及其应用，属于基因工程
技术领域：
。本发明的一株透明颤菌血红蛋白基因表达的重组钝齿棒杆菌，其分类命名为钝齿棒杆菌SYPA/pJC1-tac-vgb，保藏编号为CCTCCNOM208132。将来自于透明颤菌血红蛋白基因vgb，构建钝齿棒杆菌表达载体pJC1-tac-vgb；将该表达载体pJC1-tac-vgb电转入钝齿棒杆菌SYPA中，获得了重组钝齿棒杆菌SYPA/pJC1-tac-vgb；成功表达透明颤菌血红蛋白VHb，因而提高了重组钝齿棒杆菌菌体对氧的利用率，来提高发酵法生产L-精氨酸的产量。结果显示，发酵过程中重组菌的产酸能力比原始菌提高了13.0％，菌浓提高了10.9％。文档编号C12N15/74GK101397548SQ20081015513公开日2009年4月1日申请日期2008年10月23日优先权日2008年10月23日发明者张晓梅,徐美娟,窦文芳,虹许,许正宏,许泓瑜,饶志明申请人:江南大学