一株产γ-聚谷氨酸基因工程菌及其高产γ-聚谷氨酸方法
【专利摘要】本发明公开了一株高产γ-聚谷氨酸的基因工程菌及其发酵生产方法。该基因工程菌株名为枯草芽孢杆菌FRD518，保藏编号为CGMCCNO.6772，其染色体上重组整合了透明颤菌的血红蛋白基因（vgb），可成功高表达透明颤菌血红蛋白VHb，显著提高了重组枯草芽孢杆菌低溶氧条件下对氧的利用率；在发酵过程中，通过流加碳源和谷氨酸钠、酵母提取物等成分，工程菌能够高效高产γ-聚谷氨酸，产量达到65g/L以上，比原始野生菌株单批培养时产量提高了147%。该基因工程菌解决了γ－聚谷氨酸生产菌种在高粘、溶氧限制条件下发酵时，产量过低、副产物较多、周期较长及能耗较高等问题，可应用于γ－聚谷氨酸大规模工业化生产中。
【专利说明】一株产Y-聚谷氨酸基因工程菌及其高产Y-聚谷氨酸方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株利用基因工程技术改造的高产Y-聚谷氨酸工程菌株及其利用该工程菌株发酵生产Y -聚谷氨酸的方法，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]Y -聚谷氨酸(聚- Y-谷氨酸，poly- y -glutamic acid,简称PGA)是一种由微生物合成的氨基酸聚合物，由L-或/和D-谷氨酸通过Y -聚谷酰键连接而成，其分子量一般在100~1000KDa之间，相当于500到5000个左右的谷氨酸单体。Y-聚谷氨酸具有优良的成膜性、成纤维性、可塑性、粘结性和极其强的吸水性，具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保温、缓释、助溶、粘结和强吸水等功能。作为一种生物材料，Y-聚谷氨酸具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒害等优点，在食品、化妆品、医药、农业和水处理等领域具有广泛的应用前景。
[0003]近来国内外主要选用以芽孢杆菌为代表的微生物发酵法来生产Y-聚谷氨酸。早在1937年由Ivanovics首先在anthracis的荚膜中发现了 Y-聚谷氨酸，此后微生物发酵法生产Y-聚谷氨酸有了一些尝试性研究。特别是二十世纪九十年代后，在分离筛选以枯草芽孢杆菌为代表的Y-聚谷氨酸高产菌株方面做了大量的科学实验。Kubota从土壤中分离得到的一株subtil is F921,该菌株在最佳发酵生产条件下可以达到50g/L的最高产量,该菌株已被Mei ji Seika Kaisha公司成功用于工业化大规模生产Y-聚谷氨酸。Ogawa对Bacillus subtil is MR 2^7进行培养条件优化，在30L的发酵罐中可使Y-聚谷氨酸最大产量达到35 g/L ο Ywm Bacilluslicheniformis ATCC9945a采用流加高密度培养的方法，在2.5 L发酵罐中发酵35小时后达到39 g/L的最终产量。国内有研究报道在适量谷氨酸供给条件下，取得产量30 g/L，有望成为生产用株。日本味之素株式会社和台湾味丹企业已经利用发酵方法方法进行PGA的商业化试生产。
[0004]目前发酵法生产Y-聚谷氨酸过程中，合成代谢途径较为复杂，发酵液中PGA浓度相对较低，并且发酵液及其粘稠，粘度达到数千毫帕秒，发酵液高粘度显著降低了发酵液中的溶氧浓度，形成了低氧环境，非常有限的可利用氧成为限制生产菌种生产和代谢的关键性因素，极大地影响了菌株的代谢生长，降低了 Y-聚谷氨酸合成分泌量，导致Y-聚谷氨酸产率较低。因此寻找一种能够增加发酵液中溶氧浓度的方法或是提高微生物在贫氧环境下的摄氧能力，成为目前Y-聚谷氨酸发酵生产中亟待解决的问题。
[0005]透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是由一种专性好氧的革兰氏阴性菌透明颤菌(K/ treosciIla sp.)的血红蛋白基因(Ki treosciIla hemoglobingene, vgb)编码的同型二聚体形式的可溶性血红蛋白分子，在缺氧条件下合成的一种可溶性血红蛋白，是原核生物中迄今为止发现的唯一一种血红蛋白。由于它具有较强的氧传送能力，可以在贫氧环境中促进细菌生长，因此利用透明颤菌血红蛋白基因在发酵菌株中的表达血红蛋白(VHb)，能够有效地解决好氧微生物发酵过程中的供氧问题，在不增加投资的情况下，达到提高产量的目。本发明正是基于以上的原理，构建了可表达透明颤菌血红蛋白的Y-聚谷氨酸工程菌株，该工程菌以补料方式发酵培养可高效高产Y-聚谷氨酸。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一株利用基因工程技术改造的高产Y-聚谷氨酸工程菌株及其利用该工程菌株发酵生产Y -聚谷氨酸的方法，改造后经独特的流加补料方式发酵培养，生产聚谷氨酸能力较改造前提高了 147%。
[0007]本发明以一株产Y-聚谷氨酸的野生枯草芽孢杆菌作为遗传改造改造对象，经基因工程技术改造后获得的一株高产Y -聚谷氨酸工程菌FRD518，该基因工程菌为同源重组菌，染色体上重组了含有启动子P43、同源重组序列amyE和氯霉素抗性筛选标记的透明颤菌血红蛋白基因vgb等序列的重组载体，重组基因工程菌能成功高表达血红蛋白活性，提高贫氧条件下该菌的摄氧能力和代谢能力，在较低溶氧水平下，大幅度提高Y-聚谷氨酸的产量。
[0008]本发明所提供的可高产Y-聚谷氨酸的工程菌，是将透明颤菌血红蛋白基因(.vgb)以重组载体的方式重组到枯草芽孢杆菌基因组上，所述透明颤菌血红蛋白基因具有GENBANK Aceession Number 为 M30794 的 5’ 端第 142-582 位核苷酸序列。
[0009]本发明所述表达透明颤菌血红蛋白基因的重组载体中所述透明颤菌血红蛋白基因的5’端连接有P43启动子，所述P43启动子具有GENBANK Aceession Number为K02174的5’端第1-476位核苷酸序列，其可在Y-聚谷氨酸生产菌中启动下游基因的表达。
[0010]本发明所述表达透明颤菌血红蛋白基因重组载体中的同源重组序列为淀粉酶(amyE)位点,筛选标记为氯霉素抗性基因。
[0011]本发明将透明颤菌 血红蛋白基因通过基因工程技术构建成枯草芽孢杆菌重组载体 pBluescriptsk (+)-amyE-P43-cat-vgb_amyE,又名为 pSK_P43_vgb (见附图1 说明)。重组载体pSK-P43-vgb通过电转化方法导入Y -聚谷氨酸野生型生产菌株内，经筛选得到高产工程菌株枯草芽孢杆菌UaciJJm 5^ii7i5)FRD5180该基因工程菌株于2012年11月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC N0.6772。该基因工程菌经发酵验证，Y _聚谷氨酸产量由改造前24.6g/L提高至45.2g/L，增幅达到81.4%。
[0012]本发明提供了基因工程菌株枯草芽孢杆菌心仰况iJi^FRDSlS发酵高产Y -聚谷氨酸的方法，根据该工程菌株生长代谢特点，在发酵罐上通过连续流加底物方式控制菌的生产和代谢，促进Y-聚谷氨酸高效生产。分别在不同培养时间流加碳源(蔗糖、葡萄糖、甘油、柠檬酸中任一种或以上混合物)、谷氨酸钠和酵母提取物等底物发酵培养，IOf 100L发酵罐上Y-聚谷氨产量可达到65 g/L以上，比工程菌株枯草芽孢杆菌{Bacillus subtilis)mmi^单批发酵培养时产量至少提高35%以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1 重组载体 pBluescriptsk ( + ) -amyE-P43-vgb-cat- amyE 结构图
图2工程菌株subtil is FRD 518与原始菌株摇瓶发酵比较图3工程菌株subtil is FRD518与原始菌株IOL发酵罐单批发酵比较 图4工程菌株subti I is FRD518 IOL发酵罐流加补料发酵 图5工程菌株subti I is FRD518 100L发酵罐流加补料发酵
【具体实施方式】
[0014]下述实施例中所用的方法无特别说明均为常规方法。
[0015]实施例一:表达血红蛋白基因的pSK (-) -P43-vgb重组载体的构建
采用常规分子生物学技术，将枯草芽孢杆菌淀粉酶基因的5’端第f500和138广1984位核苷酸序列分别克隆到pBluescriptsk (-)质粒的ZAo I ,HindIII^W Xba I jac及位点之间；所用引物分别为:
AmyEl 5’ ATTGCTCGAGATGTTTGCAAAACGATTCAAA3’
AmyE2 5’ GGATAAGCTTTGTGTGTTTCCATGTGTCCAGT3’
AmyE3 5’ ATTGTCTAGAGCTGTGCTTTATCCTGATGATA3’
AmyE4 5’ ATTACCGCGGTCAATGGGGAAGAGAACCGCT3’
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，以
Pl 5’ ATTAGAATTCTGTCGACGTGCATGCAGGC3’
P2 5’ TAGGATCCTATAATGGTACCGCTATCACT3’
为引物进行PCR扩增出P43启动子基因；插入到pBluescriptsk (-)质粒的I热BamH /位点之间；
以pUC19-vgb为模板，以
VGBl 5’ ATTGGATCCGGAAGACCCTCATGTTAGA3’
VGB2 5’ ATTATCTAGATTATTCAACCGCTTGAGCGTA3’
为引物进行PCR扩增出vgb基因；插入到pBluescriptsk (-)质粒的I和Xba I位点之间；
以pNZ8148为模板，以
CMl: 5’ AATGAAGCTTACGGCAATAGTTACCCTTATT3’，
CM2: 5’ ACTGGAATTCTGTAATATAAAAACCTTCTTC3’
为引物进行PCR扩增出氯霉素抗性基因(cat),插入到pBluescriptsk (-)质粒的HindIII和EcoR /位点之间，成功构建了重组载体，将载体命名为pSK (-)-P43-vgb (其结构如附图1)。
[0016]实施例二:高产Y-聚谷氨酸工程菌枯草芽孢杆菌UaciBm仰)FRD518的构建
将实施例一构建的载体pSK (_)-P43-vgb用限制性内切酶ZAo /或fee//线性化；用碱性磷酸酶去磷酸化处理，回收后用于电转化。具体方法如下:
(1)接种A - SUbtilis于3mlLB培养基中，过夜培养。(2)取2.6ml过夜培养物接入40ml (LB+0.5M 山梨醇)中，37°C，200rpm 培养至 0D600=0.85 ~0.95。(3)将菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4°C离心收集菌体。(4)用50ml预冷的电转培养基(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖)，重新吹悬菌体，5000g, 5min，4°C离心去上清，如此漂洗4次。
(5)将洗涤后的菌体吹悬于Iml电转培养基中，每EP管分装120。(6)将60 μ I感受态细胞中加入50ngDNA，冰上孵育2min，加入预冷的电转杯(Imm)中，电击一次。电转仪设置:
2.0kv, Imm,电击I次。(7)电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM (LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇)，371:，200印111，复苏311后，涂布于含有1(^8/1111氯霉素的LB固体培养基上。37°C培养48~72h。(8)挑取单菌落于LB液体培养基中培养24h，提取基因组，用引物VGBl和VGB2进行PCR验证，扩增产物为441bp的DNA片段的为阳性菌株。
[0017]实施例三:基因工程菌FRD518高产Y-聚谷氨酸筛选、验证
挑取生长快速的阳性克隆菌株36株，经摇瓶发酵筛选挑取发酵液粘度最高的一株，命名％ Bacillus subti I is FRD518。将原始菌株和subti I is FRD518 分别接
种到250ml含有50ml种子培养基的三角瓶中，37 °C过夜培养，摇床转速为210rpm。将培养好的种子以2%的接种量接种于250ml含有50ml发酵培养基的三角瓶中，37°C培养48~72h，摇床转速为210rpm。发酵结束后取Iml发酵液，稀释10倍，12000r/min、4°C离心IOmin,取上清液,经微孔滤膜过滤,进行色谱分析,色谱分析条件为:色谱柱:Hypersil BDSC18, 5 μ m, 4.6mmX 250mm ;流动相:磷酸氢二钠_磷酸二氢钾，pH6.98 ;流速:lml/min ;柱温300C ;波长220nm，Agilent高效液相色谱化学工作站进行色谱数据处理。发酵结果如图2。
[0018]结果表明，相同条件下，发酵72h时，基因工程菌FRD518聚谷氨酸产量达到45.2g/1，生物量达到18.lg/l ;而原始菌株的聚谷氨酸产量仅为24.6g/l，生物量达到13.2g/l，聚谷氨酸产量提高了 83.7%。
[0019]实施例四:基因工程菌FRD518 IOL发酵罐上单批发酵培养高产Y -聚谷氨酸 IOL发酵罐上单批发酵培养基因工程菌FRD518和原始菌，发酵培养基含有:蔗糖100g/
L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物20 g/L，硫酸铵5 g/L，谷氨酸钠70 g/L，硫酸镁I g/L，磷酸氢二钾5 g/L，装液量8L。将培养好的种子以5%的接种量接种发酵培养基中，培养72h，发酵培养温度为36~37°C，发酵过程控制pH为6.0-7.5，通过调节搅拌速度和通气量控制溶解氧DO在20%以上，罐压0.05~0.08mPa。发酵结果如图3。
[0020]结果表明，发酵发酵72 11时，基因工程菌？1?518聚谷氨酸产量达到47.9 g/Ι，而原始菌株的聚谷氨酸产量仅为26.4 g/Ι，改造后基因工程菌FRD518聚谷氨酸产量提高了81.4%。
[0021]实施例五:基因工程菌FRD518 IOL发酵罐上流加补料发酵培养高产Y -聚谷氨酸
在IOL发酵罐上通过连续流加补料的方式发酵生产Y-聚谷氨酸。发酵初始培养基含:鹿糖40 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,硫酸铵5 g/L,谷氨酸钠20 g/L,硫酸镁I g/L，磷酸氢二钾10 g/L，装液量6L。将培养好的种子以5%的接种量接种发酵培养基中。发酵初始pH为7.0，发酵培养温度为35~37.5°C，罐压0.05、.08mPa,调节搅拌速度和通气量控制溶解氧DO在10%以上。当发酵18h时，糖浓度低于5 g/L，pH上升至7.0以上时，开始连续流加蔗糖、谷氨酸钠和酵母提取物等，其中50% (w/v)蔗糖溶液流加速度为6mL / (L*h)，流加至60h结束补料，20%酵母提取物(w/v)溶液流加速度为3 mL / (L*h)，流加至50h结束补料，50% (w/v)谷氨酸钠溶液流加速度为3.2 mL / (L*h)，流加至55h结束补料，补料结束后继续发酵至73h时，碳源和谷氨酸钠消耗完结束发酵。发酵结果如图4。
[0022]结果表明，基因工程菌FRD518流加补料培养时Y -聚谷氨酸产量达到67.5 g/1，比IOL罐单批培养时提高了 40.9%，比原始野生菌株单批培养时产量提高了 156%。[0023]实施例六:基因工程菌FRD518 100L发酵罐上流加补料发酵培养高产Y -聚谷氨
酸
在100L发酵罐上通过连续流加补料的方式发酵生产Y-聚谷氨酸。发酵初始培养基含:碳源60 g/L (葡萄糖:甘油:柠檬酸=3:1:2)，蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，硫酸铵5 g/L，谷氨酸钠20 g/L，硫酸镁I g/L，磷酸氢二钾10 g/L，装液量50L。将培养好的种子以5%的接种量接种发酵培养基中。发酵初始pH为7.0，发酵培养温度为36~37°C，罐压0.05、.08mPa，调节搅拌速度和通气量控制溶解氧DO在10%以上。当发酵12h时，pH上升至7.0以上时，开始连续流加碳源、谷氨酸钠和酵母提取物等，其中50% (w/v)碳源(葡萄糖:甘油:柠檬酸=3:1:2)溶液流加速度为4.8 mL / (L*h)，流加至60h结束补料，20%酵母提取物(w/v)溶液流加速度为3.5 mL / (L*h)，流加至54h结束补料，50% (w/v)谷氨酸钠溶液流加速度为3.6 mL / (L*h)，流加至55h结束补料，补料结束后继续发酵至75h时，碳源和谷氨酸钠消耗完结束发酵。发酵结果如图5。
[0024]结果表明，基因工程菌FRD518流加补料培养时Y -聚谷氨酸产量达到65.3 g/1,比IOL罐单批培养时提高了 36.3%`，比原始野生菌株单批培养时产量提高了 147%。
【权利要求】
1.一株高产Y-聚谷氨酸的基因工程菌，该基因工程菌株名为枯草芽孢杆菌(.Bacillus subti I is) FRD518，其特征在于:于2012年11月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.6772。
2.按照权利要求1所述的基因工程菌株枯草芽孢杆菌心subtilis)mm\S,其特征在于:该基因工程菌为同源重组菌，染色体上重组了含有启动子P43、同源重组序列amyE和氯霉素抗性筛选标记的透明颤菌血红蛋白基因vgb重组载体，重组基因工程菌能成功闻表达血红蛋白活性，提闻贫氧条件下该菌的摄氧能力和代谢能力。
3.按照权利要求1和2所述的基因工程菌株枯草芽孢杆菌{Bacillussub tills )FRD518,其特征在于:含有同源重组载体的基因序列结构为:pBluescriptsk(+)-amyE-P43-cat-vgb-amyE。
4.按照权利要求1、2和3所述的基因工程菌株枯草芽孢杆菌(feci77心subtiI is)FRD518，其特征在于:基因组上含有透明颤菌血红蛋白基因1?力，其具有GENEBANKAceession Number 为 M30794 的 5'端第 142-582 位核昔酸序列。
5.一种利用基因工程菌株枯草芽孢杆菌)FRD518发酵生产gamma-聚谷氨酸的方法，其特征在于:所述液体发酵培养基含有:蔗糖、葡萄糖、甘油、柠檬酸中任一种或以上混合物30~150g/L，蛋白胨5~30 g/L，酵母提取物5~30 g/L，硫酸铵5~20 g/L，谷氨酸钠30~100 g/L，硫酸镁0.2~2 g/L，磷酸氢二钾2~10 g/L ;发酵培养温度为33~38°C，发酵过程控制PH为6.0-7.5，通过调节搅拌速度和通气量控制溶解氧DO在10%以上，罐压.0.05^0.08mPa。
6.一种利用基因工程菌株枯草芽孢杆菌)FRD518发酵生产gamma-聚谷氨酸的方法，其特征在于:通过连续流加补料的方式发酵生产Y -聚谷氨酸，发酵初始培养基中碳源(碳源为蔗糖、葡萄糖、甘油、柠檬酸中任一种或以上混合物)为3(T50g/L，蛋白胨5~30 g/L，酵母提取物5~15g/L，硫酸铵5~20 g/L，谷氨酸钠20-40 g/L，硫酸镁.0.2^2 g/L，磷酸氢二钾2~10 8/1;发酵初始？!1为7.0，发酵培养温度为35~37.51:，罐压.0.05、.08mPa，调节搅拌速度和通气量控制溶解氧DO在10%以上；当发酵约12~18h时，碳源浓度低于5 g/L，pH上升后，分别开始连续流加碳源、谷氨酸钠和酵母提取物等，其中50% (w/v)碳源溶液流加速度为4~6 mL /(L*h)，流加至5(T60h结束补料，20%酵母提取物(w/v)溶液流加速度为2.5~5 mL /(L*h)，流加至4(T50h结束补料，50% (w/v)谷氨酸钠溶液流加速度为2~4 mL /(L*h)，流加至5(T60h结束补料，补料结束后继续发酵至碳源和谷氨酸消耗完结束发酵。
【文档编号】C12P13/02GK103881954SQ201210555304
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2012年12月20日
【发明者】李海军, 苏移山, 朱希强, 张晓元, 颜震, 王林, 凌沛学 申请人:山东福瑞达生物科技有限公司