一种高分子量普鲁兰多糖的发酵生产方法
【专利摘要】一种高分子量普鲁兰多糖的发酵生产方法，其特征在于：发酵过程中通过控制培养基成分和发酵参数，发酵生产高分子量和超高分子量等不同分子量级别的普鲁兰多糖。本发明可以生产分子量为5万-50万的普通分子量普鲁兰多糖，还可以生产的50万至150万高分子量和150万以上的超高分子量普鲁兰多糖，发明工艺简单易控制，成本低。
【专利说明】—种局分子量普鲁兰多糖的发酵生产方法
[0001]【技术领域】
本发明涉及一种通过控制发酵条件来生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，属于生物工程领域。
[0002]【背景技术】
普鲁兰多糖(Pullulan)中文亦译为茁霉多糖、出芽短梗孢糖、普聚多糖或普鲁兰糖。它是出芽孢梗霉产生的胞外多糖，以α -1, 6-糖苷键结合麦芽糖构成同型多糖为主，即葡萄糖按α-1，4_糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以α- 1，6-糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成高分子多糖。α-1，4_糖苷键同α-1，6_糖苷键的比例为2:1，聚合度(D.P)为100 — 5000，分子量5万一 200万。普鲁兰多糖的应用跟其分子量有直接关系，用于食品保鲜成膜的普鲁兰多糖分子量在20万Dal以上，用于胶囊制备的普鲁兰多糖分子量为30万Dal以上，用于食品增稠的普鲁兰多糖分子量在50万Dal以上，故生产高分子量的普鲁兰多糖可以大大拓展普鲁兰多糖应用领域，提高产品附加值。
[0003]微生物发酵是普鲁兰多糖主要的生产方法，关于普鲁兰多糖的发酵生产方法也有很多报道。专利97121608.8公开的一种发酵生产普鲁兰的新方法，生产的普鲁兰多糖平均分子量为10万道尔顿；专利200810052070.6公开的一种生产普鲁兰多糖的发酵方法得到分子量20-60万道尔顿之间的普鲁兰多糖；专利200910148764.4公开了一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，通过调节发酵培养基中有机氮源和无机氮源的浓度能够生产平均分子量在8万-48万之间的普鲁兰多糖。从这些及其他已公开的普鲁兰多糖生产方法的报道中，生产的普鲁兰多糖的分子量都较低，均在60万道尔顿以下，而且分子量分布范围宽，极大限制了普鲁兰多糖的生产 和应用。
[0004]本发明通过调节培养基中磷酸盐的浓度和初始pH，使发酵液的pH在发酵后期稳定在2.3-3.5之间，控制不同的磷酸盐的浓度和初始pH，可以得到分子量从50万到200万的普鲁兰多糖，提供了一种高分子量普鲁兰多糖的生产方法，而且工艺简单、成本低、效率闻。
[0005]
【发明内容】
一种高分子量普鲁兰多糖的生产方法，其实施步骤如下:
(1)种子培养:挑取一环出芽短梗霉孢子到液体种子培养基中，种子培养基组成为蔗糖50.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、磷酸氢二钾6.3g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸铵
0.6g/L，调节 pH 至 6.5，28°C 培养 24_48h ；
(2)发酵培养:按3%-10%接种量将培养好的种子接种到发酵培养基中培养，发酵培养基的组成为:蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、硫酸铵0.6g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸盐0-0.lmol/L,其中磷酸盐包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等，初始PH 3.5-6.5，培养温度28°C，培养12h后发酵液pH降至2.3-3.5之间，继续培养36-48h后结束发酵；
(3)发酵液后处理:发酵液经过滤除菌、酒精沉淀、干燥，即可得到白色的普鲁兰多糖产
品O[0006]在发酵培养过程中，通过减少磷酸盐的含量和降低发酵液初始pH，从而使发酵后期发酵液PH维持在比较低的条件下，改变细胞合成和分泌普鲁兰多糖的能力，生产高分子
量的普鲁兰多糖。
[0007]本发明工艺简单，控制容易，周期短，成本低，能够获得各种预期的分子量普鲁兰多糖，满足不同的需求，生产一系列的普鲁兰多糖产品，为高分子量普鲁兰多糖的生产提供了一种新方法，具有极大的工业化潜质。
[0008]【具体实施方式】
以下结合具体实例对本发明技术方案及其使用效果作进一步描述，但不局限于这些实例。 [0009]实施例一、
(1)挑取一环出芽短梗霉孢子到液体种子培养基中，种子培养基组成为蔗糖50.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、磷酸氢二钾6.3g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸铵0.6g/L，调节 pH 至 6.5，28°C培养 24h ；
(2)配置发酵培养基，组成为蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、硫酸铵0.6g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾0.lmol/L,调节pH至3.5，121°C灭菌20min后，按3%接种量接种种子培养液，28°C培养，12h后培养基pH降至2.4左右并稳定在2.4左右，48h后结束发酵，发酵液粘度为2IOOmpas ；
(3)将发酵液稀释一倍，板框过滤除去菌体，滤液精酒精沉淀、烘干，得到颜色洁白的普鲁兰多糖产品，平均分子量为220万道尔顿。
[0010]实施例二、
(1)种子培养同一；
(2)配置发酵培养基，组成为蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、硫酸铵0.6g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钠0.05mol/L,调节pH至4.0，121°C灭菌20min后，按3%接种量接种种子培养液，28°C培养，12h后培养基pH降至2.6左右并稳定在2.6左右，48h后结束发酵，发酵液粘度为1800mpas ；
(3)将发酵液稀释一倍，板框过滤除去菌体，滤液精酒精沉淀、烘干，得到颜色洁白的普鲁兰多糖产品，平均分子量为160万道尔顿。
[0011]实施例三、
(1)种子培养同一；
(2)配置发酵培养基，组成为蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、硫酸铵0.6g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸二氢钾0.05mol/L,调节pH至5.0，121°C灭菌20min后，按3%接种量接种种子培养液，28°C培养，12h后培养基pH降至2.8左右并稳定在2.8左右，42h后结束发酵，发酵液粘度为HOOmpas ；
(3)将发酵液稀释一倍，板框过滤除去菌体，滤液精酒精沉淀、烘干，得到颜色洁白的普鲁兰多糖产品，平均分子量为120万道尔顿。
[0012]实施例四、
(1)种子培养同一；
(2)配置发酵培养基，组成为蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、硫酸铵0.6g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸二氢钠0.lmol/L,调节pH至6.0,121°C灭菌20min后，按3%接种量接种种子培养液，28°C培养， 12h后培养基pH降至3.2左右并稳定在3.2左右，42h后结束发酵，发酵液粘度为400mpas ；
(3)将发酵液稀释一倍，板框过滤除去菌体，滤液精酒精沉淀、烘干，得到颜色洁白的普鲁兰多糖产品，平均分子量为80万道尔顿。
【权利要求】
1.一种高分子量普鲁兰多糖的发酵生产方法，其特征在于，实施步骤如下: (1)种子液的制备:配制种子培养基，其组成为蔗糖50.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、磷酸氢二钾6.3g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸铵0.6g/L，调节pH至6.5，121。。灭菌，20min，接入一环出芽短梗霉菌种，220rpm、28°C震荡培养24_48h，作为种子液； (2)发酵培养:配置发酵培养基，其组成为蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、磷酸盐，0-0.lmol/L、氯化钠1.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸铵0.6g/L,调节pH至适当值，121。。灭菌，20min，按3%-10%接种量接入种子液，搅拌转速为200-500rpm，通气量为0.5_5vvm，培养温度 28 ± I °C，罐压 0.05-0.1Mpa,发酵培养 48_72h ； (3)分离精制:发酵结束，发酵液经过滤除菌后，加入2倍体积乙醇沉淀，沉淀经干燥、粉碎，得到不同分子量的普鲁兰多糖产品。
2.根据权利要求1所述的一种高分子量普鲁兰多糖的发酵生产方法，其特征在于:发酵培养基中的磷酸盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或几种。
3.根据权利要求1、2所述的一种高分子量普鲁兰多糖的发酵生产方法，其特征在于:培养基中磷酸盐的含量在0-0.1 mo I/L之间。
4.根据权利要求1所述的一种高分子量普鲁兰多糖的发酵生产方法，其特征在于:调节发酵培养基的初始PH在3.0-6.5之间。
5.根据权利要求1、3、4所述的一种高分子量普鲁兰多糖的发酵生产方法，其特征在于:通过控制发酵培养基磷酸盐的含量和初始PH，使发酵培养12h后，发酵液PH稳定在，2.5-4.5之间，pH越低，产品 分子量 越高。
【文档编号】C12R1/645GK103882076SQ201210555219
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2012年12月20日
【发明者】王林, 苏移山, 朱希强, 朱云峰, 李伟, 凌沛学 申请人:山东福瑞达生物科技有限公司