一种生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的发酵工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的发酵工艺，属生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]反式-4-羟基-L-脯氨酸(简称L-羟基脯氨酸或羟脯氨酸)主要存在于动物的胶原蛋白中，在胶原蛋白中含量可达10%左右，其作用是加强结缔组织的弹性和韧性。羟脯氨酸目前广泛应用于食品添加剂、化妆品和药物中间体。
[0003]食品添加剂方面主要作为营养强化剂和增味剂，应用于果汁、清凉饮料、营养饮料等。由于羟脯氨酸具有呈苦味中的独特甜味，能改善果汁饮料风味，而且还具有皮肤修复功能，常作为饮料添加剂。
[0004]在化妆品添加剂领域，由于其具有抗氧化、抗辐射的作用，是化妆品的重要添加剂。羟脯氨酸具有消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态的潜在效果，因此许多化妆品中都添加有羟脯氨酸，以期保养皮肤和延缓衰老。
[0005]在医药领域，羟脯氨酸具有多种生理功能与独特的生物活性，既可作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等，又可加快伤口愈合，以及治疗各种皮肤疾病。羟脯氨酸存在两个手性中心，易于衍生化，药理活性多样，被用于合成新一代培南类抗生素，还被应用于多种新创新制药物的合成。
[0006]目前羟脯氨酸的生产主要有三种路线:动物骨胶提取法、生物催化法和发酵法。其中动物骨胶提取法是以动物骨胶为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程获得产品，是目前国内生产企业采用的主要方法。但该方法由于需要用到强酸强碱水解，并且骨胶中成分复杂，分离提取难度大，需要用到离子交换树脂，产生大量的废水，在环保压力日益增大的今天，渐渐面临被淘汰的命运。
[0007]生物催化法是以L-脯氨酸和α -酮戊二酸为原料，利用高表达L-脯氨酸羟化酶的大肠杆菌作为酶源，经酶催化得到反式-4-羟基-L-脯氨酸。如中国发明专利申请CN1106457Α中，1995年协和发酵工业株式会社采用胞囊菌的羟基化酶，在添加维生素C，酮戊二酸，硫酸亚铁的条件下，催化L-脯氨酸为反式-4-羟基-L-脯氨酸。中国发明专利申请CN 1150821Α中，利用胞囊菌羟基化酶基因构建表达质粒，导入大肠杆菌，构建工程菌。在发酵表达酶的同时流加葡萄糖和L-脯氨酸，发酵72h，累积产物24g/L。中国发明专利申请CN 103509813A中，构建羟基化酶质粒，导入大肠杆菌；在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸，24h后产生0.3g/L羟基脯氨酸。中国发明专利申请CN 104278047A中，向羟基化酶大肠杆菌工程菌中导入透明颤菌血红蛋白基因，在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸，48h后产生4.9g/L羟基脯氨酸。中国发明专利申请CN 103911355 A，CN 201310064339.9和CN201310235337.6中，利用截断优化的羟基化基因构建了工程菌，发酵表达酶，再利用菌体转化，转化时添加酮戊二酸、MES缓冲液、L-脯氨酸、硫酸亚铁、抗坏血酸等，使转化率达97%以上，经72h反应，产物达26g/L。
[0008]上述生物催化法需要额外添加底物L-脯氨酸，有的还要添加α -酮戊二酸，这两种原料的成本较高，且存在转化率低，最终体系中残留L-脯氨酸而难于纯化的问题，使其生产成本居高不下。
[0009]发酵法相对于生物催化法和骨胶提取法，整体工艺相对简单易操作，使用廉价的葡萄糖为原料，成本低。中国发明专利申请CN 1178245A中，1997年协和发酵工业株式会社强化宿主菌大肠杆菌L-脯氨酸生物合成系统，并敲除了脯氨酸分解酶系，利用胞囊菌羟基化酶基因构建表达质粒，导入改造的大肠杆菌，构建工程菌；在发酵时流加葡萄糖，生产羟基脯氨酸。该工艺生产简单，成本优势明显，成为日本协和发酵工业株式会社多年来生产羟基脯氨酸的工艺。但该工艺在实际生产中也存在一些问题，一是表达基因通过质粒表达载体引入，在大规模长周期工业发酵中，质粒容易丢失，导致生产菌种遗传稳定性差，发酵后期产量下降的问题；二是由于通过强化表达了能耐受反馈抑制表达的谷氨酸激酶突变体编码基因proB74，这虽然增加了细胞内L-脯氨酸的代谢通量，但也导致L-脯氨酸过量积累，发酵终产物中除了羟脯氨酸外，还含有较多的L-脯氨酸，二者性质比较相近，只能通过离子交换树脂加以分离纯化，从而产生了大量的酸碱废水，大大增加了成本。
[0010]目前发酵法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸还存在转化率低，发酵时间长的问题。中国发明专利申请CN 1150821A报道，发酵72h，产量24g/L。中国发明专利申请CN103509813A报道江南大学构建羟基化酶质粒，导入大肠杆菌，在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸，24h后产生0.3g/L羟基脯氨酸。中国发明专利申请CN 104278047A报道江南大学向羟基化酶大肠杆菌工程菌中导入透明颤菌血红蛋白基因，在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸，48h后产生4.9g/L羟基脯氨酸。
【发明内容】
[0011]本发明要解决的技术问题是开发缩短发酵时间，提高产量，提高糖转化率的发酵技术。
[0012]本发明解决上述问题的技术方案如下:
一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的发酵工艺，采用pH为1-6的除菌亚铁离子溶液，在发酵过程中以流加方式加入发酵罐，保持发酵罐内稳定的亚铁离子浓度；所述发酵以葡萄糖为碳源。
[0013]作为上述技术方案的优选，采用pH为1-6的除菌亚铁离子溶液，在发酵过程中以流加方式加入发酵罐，保持发酵罐内稳定的亚铁离子浓度；所述发酵以葡萄糖为碳源。
[0014]作为上述技术方案的优选，亚铁离子在发酵体系中的总摩尔浓度为
0.35-3.5mmol/L，在规定时间内勾速流加。
[0015]本发明所述的亚铁离子总浓度是一个设计值，由于亚铁离子并非一次性加入到发酵罐中，而是流加。需要流加的原因是亚铁离子易氧化，而产生消耗。总浓度是假设亚铁离子一次性加入到发酵罐中时的浓度值。因为流加的关系，发酵罐中的实际亚铁浓度值不会达到总浓度值。
[0016]作为上述技术方案的优选，所述的规定时间为在48小时内。
[0017]作为上述技术方案的优选，所述亚铁离子溶液采用膜过滤除菌或者高温灭菌。
[0018]作为上述技术方案的优选，所述亚铁离子溶液中还加有抗氧化剂或还原剂。
[0019]作为上述技术方案的优选，发酵过程中，所述抗氧化剂或还原剂的浓度为0.35-3.5mmol/L。
[0020]作为上述技术方案的优选，所述抗氧剂或还原剂为抗坏血酸。
[0021]作为上述技术方案的优选，所述亚铁盐为七水硫酸亚铁。
[0022]作为上述技术方案的优选，所述发酵采用的菌种为保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年9月17日，保藏编号为CCTCC Μ 2015550的大肠杆菌HJ(Escherichia coli HJ)。
[0023]作为上述技术方案的优选，活化培养工程菌大肠杆菌HJ(EsCheriChia coli HJ),并将培养好的种子逐级放大，并在发酵罐中进行好气培养，培养温度33-37°C，控制pH为
6.5-7.0，溶氧20%以上，发酵时间40-60小时；配置无菌亚铁离子溶液，并在发酵过程中流加亚铁离子溶液；在发酵后期取样检测羟脯氨酸含量，至含量不再增加为止。
[0024]本发明选择将亚铁离子采取保护促