携带基因型位点突变物质及其作为乙型脑炎疫苗的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及携带基因型位点突变物质及其作为乙型脑炎疫苗的应用。

背景技术：

乙型脑炎(乙脑)病毒属于黄病毒科黄病毒属，是引起病毒性脑炎的主要病原体，主要分布在亚洲和太平洋地区。病毒感染危害宿主中枢神经系统，能够引起严重的脑炎症状和神经系统疾病，死亡率高达30％，幸存者中约有50％患有严重的神经系统后遗症。据WHO统计，全球每年大约有50,000-70,000例乙型脑炎病例，死亡超过10,000例。近年来乙型脑炎病毒已经扩散到大洋洲地区，对人类健康形成了巨大威胁。

目前缺乏特效的乙脑抗病毒药物，主要通过疫苗接种的方式来进行预防。乙脑疫苗包括鼠脑化灭活疫苗、地鼠肾细胞灭活疫苗和地鼠肾细胞减毒活疫苗。减毒活疫苗具有免疫原性好、生产成本低等优点，已经被广泛用于预防多种疾病。SA14-14-2是目前应用最为广泛的乙脑减毒活疫苗，该疫苗株是将野生毒株SA14在地鼠肾单层细胞上传代获得的弱毒株，于1989年在中国被批准上市。到目前为止，已有接种了3亿多名儿童，具有良好的安全性和有效性。

乙脑病毒的基因组为单股正链RNA，大小约为11Kb左右，包括5’和3’非编码区和一个单一的读码框，其编码3种结构蛋白(衣壳蛋白C、膜蛋白前体/膜蛋白prM/M和包膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。包膜糖蛋白E具有多种重要的生物学功能，例如参与病毒与细胞受体的结合、病毒包膜与细胞膜的融合以及机体的特异性免疫应答。E蛋白包含3个结构域，Ⅰ区是由9股链形成的β桶状结构，位于E蛋白中间并连接Ⅱ区和Ⅲ区。Ⅱ区由两个延伸的环状结构组成，在Ⅰ区和Ⅱ区之间有一个具有极性表面结构的铰链区。Ⅲ区是连接在Ⅰ区上的免疫球蛋白样结构，是中和抗体识别的主要区域。

根据乙型脑炎病毒的全基因组序列或E蛋白基因序列可以将其分为5种基因型(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ)。近年来，乙型脑炎病毒的流行和分布情况已经发生了较大的变化，在亚洲地区的许多国家，例如中国、日本、泰国、越南等，基因Ⅰ型病毒已经取代了原有的基因Ⅲ型成为主要的流行病毒株。然而，目前的乙脑灭活和减毒疫苗均属于基因III型，其针对基因I型流行株的保护效果尚不明确。目前，决定乙脑病毒基因型特异中和能力的关键位点目前尚不明确。发展可同时针对多种基因型病毒的新型疫苗尤为重要。

技术实现要素：

本发明一个目的是提供如下A-E中任一种物质。

本发明提供的A-E中任一种物质：

A、重组乙型脑炎病毒，为突变乙型脑炎病毒LAV的基因组中包膜蛋白E编码基因，使包膜蛋白E的氨基酸序列第327位丝氨酸突变为苏氨酸，其余LAV基因组序列保持不变，得到的重组乙型脑炎病毒；

所述包膜蛋白E的氨基酸序列为序列表中序列4；

所述乙型脑炎病毒LAV的基因组为序列1所示cDNA编码的RNA；

B、RNA片段，为所述重组乙型脑炎病毒的基因组；

C、DNA片段，为所述重组乙型脑炎病毒的基因组对应的cDNA；

D、重组载体，表达C中所述DNA片段的载体；

E、蛋白质，为将所述包膜蛋白E氨基酸序列第327位丝氨酸突变为苏氨酸得到的蛋白。

上述乙型脑炎病毒减毒株LAV按照如下方法制备：将LAV的基因组RNA转染BHK-21细胞，包装得到的病毒为野生型乙型脑炎病毒LAV；乙型脑炎病毒LAV的基因组为序列1所示cDNA编码的RNA；该病毒为基于乙型脑炎病毒SA14-14-2反向遗传学系统拯救的恢复病毒。

上述物质中，

所述重组乙型脑炎病毒按照包括如下步骤的方法制备：将所述重组乙型脑炎病毒的基因组转染宿主细胞，包装，得到乙型脑炎病毒；

所述重组乙型脑炎病毒的基因组为序列2所示cDNA编码的RNA。

上述物质中，所述重组乙型脑炎病毒的基因组通过所述重组载体体外转录获得；

所述重组载体为将序列2所示的cDNA插入表达载体得到的载体。

上述的物质在制备如下1)和/或2)产品中的应用也是本发明保护的范围：

1)乙型脑炎病疫苗；

2)具有提高自身免疫后中和抗体效价功能的产品。

所述产品为试剂盒。

本发明另一个目的是提供一种具有如下1)和/或2)功能产品。

本发明提供的产品，其活性成分为上述的重组乙型脑炎病毒；

1)乙型脑炎病疫苗；

2)提高自身免疫后中和抗体效价。

上述产品为药物。

上述表达载体为pANCR-L1，上述重组表达载体具体可为在表达载体的pANCR-L1载体的多克隆位点(如Asc I和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

所述重组病毒具体可为将以上任一所述的重组表达载体导入离体哺乳动物细胞并培养哺乳动物细胞得到的重组病毒。所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞、Vero细胞或C6/36细胞。

本发明还保护以上任一所述重组病毒在乙型脑炎疫苗制备中的应用。所述疫苗具体可为预防乙型脑炎病毒感染的疫苗。

本发明还保护一种乙型脑炎疫苗，它的活性成分为以上任一所述重组病毒。所述疫苗具体可为预防乙型脑炎病毒感染的疫苗。

本发明提供的携带包膜糖蛋白氨基酸突变的乙脑重组病毒具有如下优点：(1)本发明首次提出了病毒包膜糖蛋白上对乙型脑炎减毒活疫苗免疫诱导中和抗体作用具有重要影响的基因型特异氨基酸位点，携带该位点突变的病毒诱导的针对基因Ⅰ型乙脑病毒的中和抗体效价明显高于目前使用的乙脑减毒活疫苗SA14-14-2；(2)具有减毒特性，安全性高，遗传稳定性好；(3)与乙脑减毒活疫苗一样，能够诱导产生针对野生型乙脑病毒的免疫应答。综上所述，本发明所提供的重组乙型脑炎病毒可用作乙脑疫苗，对乙型脑炎的防治和疫苗设计具有重要的意义。

附图说明

图1为野生型乙型脑炎病毒全长RNA的cDNA结构示意图以及突变位点示意图。

图2为实施例2中间接免疫荧光的结果。

图3为实施例3中空斑试验的结果。

图4为实施例4中乙型脑炎病毒的在不同细胞内的增殖特征的结果。

图5为实施例5中各代病毒空斑试验的结果。

图6为实施例6中乙型脑炎病毒的神经毒力特征的结果(存活率)。

图7为实施例7中乙型脑炎病毒的神经侵袭力特征的结果(存活率)。

图8为实施例8中乙型脑炎病毒的免疫原性的结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

BHK-21细胞：购自ATCC，产品目录号为CCL-10；Vero细胞：购自ATCC，产品目录号为CCL-81；C6/36细胞：购自ATCC，产品目录号为CRL-1660。

野生型乙型脑炎病毒减毒株LAV按照如下方法制备：将LAV的基因组RNA转染BHK-21细胞，包装得到的病毒为野生型乙型脑炎病毒LAV；乙型脑炎病毒LAV的基因组为序列1所示cDNA编码的RNA；该病毒为基于乙型脑炎病毒SA14-14-2反向遗传学系统拯救的恢复病毒。

乙型脑炎病毒SA14-14-2株：购自成都生物制品研究所；记载在如下文献中：吴永林,赵宇,黄玉仙等.乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在小鼠体内的动态分布。中国生物制品学杂志，2007，20(3)204-205)。

乙型脑炎强毒株SA14：记载在如下文献中：凌静萍，朱荫耕，杜桂枝等，流行性乙型脑炎强毒株和弱毒疫苗株SA14-14-2对猴子和小鼠的致病性和病理学研究，微生物学免疫学进展，2000，4)。

乙型脑炎病毒分离株SX06(Ye,et al,Human vaccines&immunotherapeutics,2014)，2006年分离自中国山西。

乙型脑炎病毒分离株SH53(Pan,et al,Journal of Virology,2011，GenBank No.JN381850；提交日：2011年9月24日)：2001年分离自中国上海。

实施例1、重组乙型脑炎病毒S327T的构建和鉴定

重组乙型脑炎病毒S327T，为突变乙型脑炎病毒LAV的基因组中包膜蛋白E编码基因，使包膜蛋白E的氨基酸序列第327位丝氨酸突变为苏氨酸，其余LAV基因组序列保持不变，得到的重组乙型脑炎病毒；包膜蛋白E的氨基酸序列为序列4。乙型脑炎病毒LAV的基因组为序列1所示cDNA编码的RNA。

突变乙型脑炎病毒LAV的基因组中包膜蛋白E编码基因为将乙型脑炎病毒LAV的基因组中包膜蛋白E编码基因的核苷酸序列第1956-1958位ucc突变为了aca。包膜蛋白E编码基因的核苷酸序列为序列1第978-2477位。

乙型脑炎病毒减毒株LAV(WT)的全长RNA对应的cDNA结构示意图以及突变位点示意图见图1。

乙型脑炎病毒减毒株LAV基因组RNA的cDNA序列如序列表的序列1所示，自5′末端第1位-95位核苷酸为5′UTR，第96-476位核苷酸为衣壳蛋白C的编码基因(C)，第477-977位核苷酸为膜蛋白及其前体prM/M的编码基因，第978-2477位核苷酸为包膜糖蛋白E的编码基因，第2478位-3722位核苷酸为非结构蛋白NS1的编码基因(NS1)第3723-4607位核苷酸为非结构蛋白NS2的编码基因(NS2)，第4608-6464位核苷酸为非结构蛋白NS3的编码基 因(NS3)，第6465-7676位核苷酸为非结构蛋白NS4的编码基因(NS4)，第7677-10391位核苷酸为非结构蛋白NS5的编码基因(NS5)，第10395-10976位核苷酸为3′UTR。

一、载体pJE-LAV的构建

将序列表的序列1所示的双链DNA分子插入pANCR-L1载体(pANCR-L1载体为序列表的序列4所示的质粒；序列4中，自5’末端第2350-2575位核苷酸为sp6启动子)的Asc I和XhoI酶切位点之间，得到载体pJE-LAV。

二、重组质粒pJE-S327T的构建

1、以载体pJE-LAV为模板，采用F405和J-S327T-R组成的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(1574bp)；

J-F405：5’-AAAAGAGGAGGAAATGAAGGC-3’

J-S327T-R：5’-gggccatcactcccagagtatgtgagttcaatgacaactgttc-3’

2、以载体pJE-LAV为模板，采用J-S327T-F和J-BspEl-R组成的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(1537bp)；

J-S327T-F：5’-gaacagttgtcattgaactcacatactctgggagtgatggccc-3’

J-BspEl-R：5’-ccgtaccagcagccattttctgtccggaatcgtagg-3’

3、同时将步骤1的PCR扩增产物和步骤2的PCR的扩增产物作为模板，采用J-F405和J-BspEl-R组成的引物进行PCR扩增，得到S327T PCR扩增产物(3068bp，其核苷酸序列为序列2第405-3472位核苷酸)。

4、用限制性内切酶Kasl和BspEl分别双酶切步骤3得到S327T PCR扩增产物，回收S327T酶切产物(2974bp)。

5、用限制性内切酶Kasl和BspEl双酶切载体pJE-LAV，回收13567bp载体骨架。

6、将步骤4得到的S327T酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到pJE-S327T。

结果如下：重组质粒pJE-S327T为在pANCR-L1载体的Asc I和XhoI酶切位点之间插入了序列2所示的双链DNA分子得到的质粒；其中序列2为将序列1所示核苷酸自5’末端第1956-1958位核苷酸由“ucc”突变为了“aca”，序列2编码的包膜糖蛋白E自N末端第327位氨基酸残基由苏氨酸(S)突变为了苏氨酸(T)，该突变简称S327T突变。

三、乙型脑炎病毒S327T的获得

1、用限制性内切酶Xhol酶切重组质粒pJE-S327T，分别回收线性化质粒。

2、以2ug步骤1的线性化质粒为模板，采用SP6RiboMAX Express Large Scale RNA Production Systems(Promega公司产品)并按说明书的步骤在30ul体系中体外转录，得到转录体RNA，为序列2所示的DNA编码的RNA，分装后置-80℃冻存待用。

3、用脂质体Lipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)将步骤2得到的转录体RNA转染单层BHK-21细胞，方法如下：首先将250μl OPTI-MEM培养基与6μl脂质体混匀，室温放置5min后与30μl转录体RNA和250μl OPTI-MEM培养基混合，室温放置20min，然后将混合液加入到6孔板的1个孔中(6孔板中已接种BHK-21细胞)，然后补加400μl OPTI-MEM培养基，37℃、5％CO₂条件下孵育6h，移去上清并补加含2％FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO₂条件下孵育至出现细胞病变，离心收集培养上清，将培养上清重新接种于BHK-21细胞并进行培养，细胞出现病变后离心收集上清，即为乙型脑炎病毒S327T种子液，冻存于-80℃。

检测乙型脑炎病毒S327T种子液的病毒滴度，为1.08×10⁷PFU/ml。

4、乙型脑炎病毒S327T的RNA检测

(1)提取上述3制备的S327T种子液的总RNA，采用测序引物R5N进行反转录，得到cDNA。以cDNA为模板，采用F2N和R4N组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。反转录引物R5N：5’-GCTATGGTGTGCGGAATGATGA-3’；PCR引物F2N：5’-GCTACATGTGTGAGGACACTATC-3’，R4N：5’-CTTGTGCGCTTTGTGGACGA-3’。

(2)将步骤(1)得到的cDNA进行测序，乙型脑炎病毒S327T基因组的cDNA测序结果为序列2。

实施例2、乙型脑炎病毒对BHK-21细胞的感染率

1、用实施例1制备的乙型脑炎病毒乙型脑炎病毒S327T种子液(1.08×10⁷PFU/ml)感染铺满盖玻片单层的BHK-21细胞(mOI为0.01)，分别于感染后24、48、72h取出盖玻片，置于-20℃丙酮中固定30-60min，晾干后保存于-20℃冰箱密封，即为抗原片。

2、采用乙型脑炎病毒SA14免疫小鼠血清作为多抗，通过间接免疫荧光对抗原片的BHK-21细胞中的病毒蛋白进行检测。方法如下：将抗体按1:300稀释，与抗原片中的BHK-21细胞在37℃孵育1-2h，用PBS缓冲液(10mM K₂HPO4，2mM KH₂PO4，135mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4)振荡洗涤3次，每次10min，室温晾干；在病毒抗原片上加入用PBS缓冲液500倍稀释的488标记的羊抗鼠IgG抗体，置37℃作用45min，然后将病毒抗原玻片放入PBS缓冲液振荡洗涤3次，每次10min，室温晾干，荧光显微镜下观察结果。

以野生型乙型脑炎病毒(LAV)为对照。

间接免疫荧光的结果见图2。图2中，LAV代表野生型乙型脑炎病毒(减毒株)，S327T分别代表乙型脑炎病毒S327T。乙型脑炎病毒S327T和野生型乙型脑炎病毒(减毒株)均能够在BHK-21细胞中表达乙型脑炎病毒蛋白，且蛋白表达量随着时间的延长而增加，乙型脑炎病毒S327T和野生型乙型脑炎病毒(减毒株)对BHK-21细胞的感染率相近。

实施例3、乙型脑炎病毒的空斑特征

分别将实施例1制备的乙型脑炎病毒S327T种子液和野生型乙型脑炎病毒(强毒株)种子液进行如下检测：

分别将乙型脑炎病毒S327T(1.08×10⁷PFU/ml)以及LAV种子液(1.08×10⁷PFU/ml)用含2％FBS的DMEM培养基进行10倍梯度稀释(稀释度依次为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，10^-5、10^-6和10^-7)。将各个稀释液分别以750μl/孔接种于铺于6孔板的单层BHK-21细胞(MOI为0.01)，37℃、5％CO₂条件下静置1-2h，吸弃培养上清，在每个孔中加入琼脂盖(即含2％FBS和1％琼脂的DMEM培养基)，37℃、5％CO₂条件下培养3d，然后用4％甲醛室温固定1h，弃琼脂盖，用结晶紫室温染色10min，观察空斑形态，并计算空斑形成单位(PFU)。

结果见图3。图3中，LAV代表野生型乙型脑炎病毒(减毒株)，S327T分别代表乙型脑炎病毒S327T。乙型脑炎病毒S327T与LAV均能够形成大小较为均一，边缘清晰的空斑。S327T形成的空斑形态与野生型乙型脑炎病毒(减毒株)相近。

实施例4、乙型脑炎病毒的在不同细胞内的增殖特征

为了观察乙型脑炎病毒在鼠类、蚊虫类和灵长类细胞系中的增殖特征，分别将实施例1制备的乙型脑炎病毒S327T种子液和野生型乙型脑炎病毒(减毒株)种子液进行如下检测：

将乙型脑炎病毒种子液以MOI＝0.01的接种量接种24孔板中的BHK-21细胞、C6/36细胞或Vero细胞，37℃、5％CO₂条件下静置1h，吸弃培养上清，补加含2％FBS的DMEM培养液(BHK-21细胞、Vero细胞)或含2％FBS的RPMI-1640维持液(C6/36细胞)，37℃(BHK-21细胞、Vero细胞)或28℃(C6/36细胞)、5％CO₂条件下培养，接种后每隔24小时收取培养上清， 用空斑滴定法测定病毒滴度(方法同实施例3，均采用BHK-21细胞进行空斑测定；结果数据的单位为PFU/mL，即每毫升上清液中的病毒含量)，绘制生长曲线。

结果见图4。图4中，LAV代表野生型乙型脑炎病毒(减毒株)，S327T分别代表乙型脑炎病毒S327T。乙型脑炎病毒S327T在BHK-21细胞和C6/36细胞上的复制能力与野生型乙型脑炎病毒(减毒株)类似，而在Vero上的增殖能力比野生型乙型脑炎病毒(减毒株)略强。在BHK-21细胞中，S327T分别在感染后48h和72h达到复制高峰。在Vero细胞和C6/36细胞中，S327T均在感染后120h达到复制高峰。结构表明，乙型脑炎病毒S327T能够在不同的细胞系中有效复制，其复制能力与野生型乙型脑炎病毒(减毒株)略有差异。

实施例5、乙型脑炎病毒的遗传稳定性

将实施例1制备的乙型脑炎病毒S327T种子液(第零代病毒液)进行如下检测：

1、将第零代病毒液以MOI＝0.01的接种量接种于单层Vero细胞，3d后收集细胞上清(第一代病毒液)，通过空斑试验测定病毒滴度。

2、将前一步骤得到的病毒上清以MOI＝0.01接种于单层Vero细胞，通过空斑试验测定病毒滴度。重复进行7次步骤2，收集每一代的病毒上清，于-80℃冻存待用。

3、分别提取每代病毒上清的RNA，采用测序引物R5N进行反转录，得到cDNA，以cDNA为模板，采用F2N和R4N组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。反转录引物R5N：5’-GCTATGGTGTGCGGAATGATGA-3’；PCR引物F2N：5’-GCTACATGTGTGAGGACACTATC-3’，R4N：5’-CTTGTGCGCTTTGTGGACGA-3’

每代病毒上清的测序结果均一致，S327TPCR扩增产物序列均如序列2第978-2477位核苷酸所示。结果表明，经Vero细胞传代后，S327T突变均具有基因的遗传稳定性。

4、取第零代病毒液(P0)、第四代病毒液(P4)和第八代病毒液(P8)，分别进行蚀斑大小测定(方法同实施例3，采用BHK-21细胞进行空斑测定)。照片见图5。经过在Vero细胞上若干代传代，乙型脑炎病毒S327T的蚀斑大小无明显变化，表明该重组病毒具有很好的遗传稳定性。

实施例6、乙型脑炎病毒的神经毒力特征

分别将实施例1制备的乙型脑炎病毒S327T种子液和野生型乙型脑炎病毒(减毒株)种子液进行如下检测：

将乙型脑炎病毒以6×10³PFU的剂量颅内接种3周龄BALB/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)，每种病毒接种10只小鼠，观察15天内的小鼠发病和死亡情况，接种15天后统计该剂量组小鼠的死亡率(死亡数/接种数)，绘制颅内接种小鼠生存曲线。结果见图6。图6中，LAV代表野生型乙型脑炎病毒(减毒株)，S327T分别代表乙型脑炎病毒S327T。上述结果表明，乙型脑炎病毒S327T的小鼠神经毒力与亲本野生型乙型脑炎病毒(减毒株)相近，具有明显的减毒特征。

实施例7、乙型脑炎病毒的神经侵袭力特征

分别将实施例1制备的乙型脑炎病毒S327T种子液和野生型乙型脑炎病毒(减毒株)种子液进行如下检测：

将乙型脑炎病毒以6×10⁵PFU的剂量腹腔接种3周龄BALB/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)，每种病毒接种10只小鼠，观察15天内的小鼠发病和死亡情况。结果见图7。图7中，LAV代表野生型乙型脑炎病毒(减毒株)，S327T代表乙型脑炎病毒S327T。该剂量下的乙型脑炎病毒对小鼠均没有致死性。上述结果表明，乙型脑炎病毒S327T与亲本野生型 乙型脑炎病毒(减毒株)均具有明显的减毒特征。

实施例8、乙型脑炎病毒免疫诱导中和抗体效价

将乙型脑炎病毒S327T与野生型乙型脑炎病毒(减毒株)皮下接种3周龄BALB/c小鼠，每种病毒接种8只小鼠，每只小鼠接种剂量为10⁵PFU。在初次免疫后30d皮下加强免疫一次，每只小鼠接种剂量为10⁵PFU。在加强免疫后第28d剪尾取血。于室温静置3h后离心收取血清，56℃灭活30min，-20℃冻存待用。

采用空斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)测定小鼠血清中的中和抗体效价(PRNT₅₀)。具体方法如下：用PBS缓冲液将血清制备成1:10、1:20、1:40倍稀释的稀释液；将稀释液分别与乙型脑炎分离株SX06和SH53等体积混合(混合液中含约100PFU的乙型脑炎病毒)，37℃孵育1.5h，然后检测上清中的病毒滴度(方法同实施例3，采用BHK-21细胞进行空斑测定)，依据Karber法计算50％中和抗体滴度。即为免疫小鼠血清对乙型脑炎分离株SX06和SH53的中和抗体效价。

结果见图8。野生型乙型脑炎病毒(减毒株)诱导的对SX06和SH53的中和抗体效价分别在1:10-1:12(平均值为10.9)和1:10-1:33(平均值为23.8)，乙型脑炎病毒S327T诱导的中和抗体效价分别在1:20-1:26(平均值为23.8)和1:22-1:44(中位值为32.4)。

上述结果表明，乙型脑炎病毒S327T诱导的中和抗体效价要明显高于野生型乙型脑炎病毒(减毒株)。