HeLa-F细胞及其用途的制作方法

本发明涉及HeLa-F细胞及其用途。

背景技术：

目前，国内生物制药企业在细胞基质的培养过程中，普遍采用传统的转瓶细胞培养工艺，该方法存在细胞密度低、病毒产率低、生产成本高、劳动强度大等缺点。诞生于20世纪60年代的悬浮培养技术可以进行大规模细胞培养，能够获得大量的、高密度细胞基质，从而获得大量的细胞培养物和/或疫苗产品，因而在国外生物制药产业中普遍应用。

悬浮培养技术是在生物反应器中、人工条件下高密度大规模培养动物细胞用于生物制品生产的技术，根据细胞是否为贴壁细胞的性质，分为悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体悬浮培养。其中，悬浮细胞的培养非常简单，很容易实现高密度大规模悬浮培养，而贴壁细胞则由于易于贴壁，且在悬浮培养时，不易长期维持并难以达到高密度，只能采用细胞微载体悬浮培养的方式。但是，细胞微载体悬浮培养存在诸多缺陷，比如：1.需使用在培养液中添加动物血清，而血清成分复杂，增加后续纯化难度，并且由于引入了影响质量的其他物质，增加了不可控风险；2.培养固体微载体吸附血清，容易变性；3.培养后需要通过消化或球转球等手段分离细胞，操作过程易造成细胞流失；4.培养工艺复杂，劳动力消耗大，生产成本高；5.细胞易受搅拌、球珠间碰撞、流动剪切力等条件影响。

HeLa细胞，人宫颈癌细胞株，在含血清、贴壁培养下被发现具有极强的支持病毒复制的能力。然而，由于其贴壁细胞的特点，不能直接悬浮培养，在传统应用中，必须借助于微载体才能进行悬浮培养，存在前述成产成本高、产品不可控等诸多缺陷。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种HeLa-F细胞，其是由HeLa细胞驯化而来，与HeLa细胞的贴壁细胞特点不同，HeLa-F细胞具有能在悬浮状态下培养的特点，属于悬浮细胞。

本发明HeLa-F细胞，它是中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC C2015138的人宫颈癌细胞HeLa-F。

本发明人宫颈癌细胞HeLa-F，于2015年10月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，其地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏 号为：CCTCC C2015138。

其中，所述HeLa-F细胞为悬浮细胞。

本发明还提供了一种重组HeLa-F细胞，它是包含病毒的HeLa-F细胞，所述HeLa-F细胞为前述HeLa-F细胞中的细胞。

优选地，所述病毒为痘苗病毒。

本发明还提供了前述HeLa-F细胞在病毒生产中的应用。

本发明还提供了一种利用HeLa-F细胞制备痘苗病毒的方法，它包括如下步骤：

(1)取前述HeLa-F细胞，加入培养液和痘苗病毒，培养；

(2)离心，收获细胞，破碎细胞，离心，取上清，即可。

优选地，步骤(1)中，所述培养液为EMEM培养液。

优选地，步骤(1)中，加入痘苗病毒时，MOI(Multiplicity of infection，感染复数)为0.05-0.15。优选地，所述MOI为0.1-0.15。

优选地，步骤(1)中，所述培养的方法是：36～38℃、3％～10％CO₂条件下培养24～96小时。进一步优选地，所述培养的方法是：37℃、5％CO₂条件下培养48小时。

优选地，步骤(2)为：以1000rpm离心10min收获细胞，冻融3次破碎，3000rpm离心10min，取上清。

本发明HeLa-F细胞为悬浮细胞，可以直接高密度大规模悬浮培养，同时支持病毒复制的能力也非常强，比如，用于制备痘苗病毒时，单细胞产量高达26.8～31.8pfu/cell，因而其可用于大量的病毒产物和高质量的疫苗产品的制备，且其大规模培养非常简单，无需使用细胞微载体等辅助材料，成本低廉，工业应用前景极好。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

附图说明

图1 HeLa-F细胞的连续传代培养

图2 HeLa-F细胞的生长曲线

具体实施方式

本发明涉及到的“E+”为科学记数法，例如，1E+6与10⁶等同。

实施例1本发明HeLa-F细胞的制备

1、细胞的制备

HeLa(贴壁)细胞来源于ATCC(子宫颈癌细胞，ATCC货号：CCL-2，冻存批号：61647128)。

1.1HeLa-Adhere细胞准备

1.1.1取HeLa(贴壁)细胞1支，标记为批号ACB140724P04的HeLa细胞，复苏，在含10％FBS的EMEM中培养，批号为：标记AC140901P0401。

1.1.272小时后，取出HeLa细胞(AC140901P0401)，弃去上清液，于每瓶细胞中，加入15ml的PBS溶液洗涤1次，加入2ml消化液(0.25％Trypsin-EDTA)，待细胞脱落后，加入8.0ml含10％FBS的EMEM中和，轻轻吸出细胞至50ml离心管中，130xg离心5min，弃去上清液，加入30ml含10％FBS的EMEM，制备成均匀的细胞悬液，接种至1个225cm²培养瓶中，标记：AC140901P0402。

1.1.348小时后，按1.1.2的消化方法将HeLa细胞消化下来，加入90ml含10％的EMEM，制备成均匀的细胞悬液，接种至3个225cm²培养瓶中，标记：AC140901P0403。

1.1.448小时后，按1.1.2的消化方法将HeLa细胞消化下来，加入300ml含10％的EMEM，制备成均匀的细胞悬液，接种至10个225cm²培养瓶中，标记：AC140901P0404。

1.2更换无血清培养液培养

取出预先准备好的HeLa-Adhere细胞(批号：AC140901P0404)，弃去旧培养液，用PBS洗涤细胞1次后，加入消化液(Tyrple^TM select)，消化HeLa细胞，用EMEM中和消化，将细胞悬液平分至50ml离心管中，以130×g离心5min，弃去上清液，收获HeLa细胞。加入无血清培养液，调整细胞浓度约为3.0E+5cells/ml，混匀，将细胞悬液接种至75cm²培养瓶中，每瓶接种15ml。放置于饱和湿度，37.0℃，8.0％CO₂的培养箱中静置培养，经过48小时静置培养后，观察细胞生长及成团情况。

结果发现，细胞呈圆形，分散度好，呈单个细胞悬浮生长，说明获得了纯的悬浮细胞，将这种悬浮细胞命名为HeLa-F细胞。

在48-96小时后，于每瓶细胞中取样计数，并计算存活率，根据计数结果补加无血清培养，调整至细胞浓度约为3.0E+5cells/ml，接种至75cm²培养瓶或175cm²培养瓶中，放置饱和湿度，37.0℃，8.0％CO₂的培养箱中静置培养。

经过第一次传代，细胞呈圆形、悬浮生长。以后每48-96小时传代一次。

结果发现，在第8代时已经能达到稳定，在第8代到第25代时，细胞倍增时间为36.0h，细胞生长良好，存活率及倍增时间均很稳定(如图1)。在第11代(P11)时冻存13支，经复苏检查，P11在复苏后能继续正常悬浮生长。

1.3生长曲线测定

取稳定生长的前述冻存的第11代细胞，经过复苏并连续传代培养后(P1121、P1122、P1123)的HeLa-F细胞，在倒置显微镜下观察，细胞应为：圆形，单个或成簇悬浮生长，生长状态良好。

将细胞悬液吸取至储液瓶中，取样计数，并计算存活率。根据计数结果补加无血清培养，调整至细胞浓度约为3.0E+5cells/ml，接种至75cm²培养瓶中，放置饱和湿度，37.0℃，8.0％CO₂的培养箱中静置培养，每24小时取样计数，计算存活率，直至细胞不再生长，存活率明显下降后结束培养。

其生长曲线如下表1和图2：HeLa-F细胞在培养液中培养，细胞生长稳定，存活率大于85％，平均最高生长浓度为：2.22E+6cells/ml，倍增时间范围在32.3-35.6小时，平均倍增时间为33.3小时。当细胞达到最高生长浓度时，细胞存活率明显下降。在细胞浓度约为：1.39E+6cells/ml时，细胞存活率约为97％，为对数生长期的中后期。

表1HeLa-F细胞的生长曲线

本发明通过对HeLa细胞进行驯化，获得了一种新的细胞HeLa-F，其与传统的HeLa细胞的生长特性不同。传统的HeLa细胞为贴壁细胞，而本发明经过驯化以后得到的HeLa-F细胞为悬浮细胞。

HeLa-F细胞通过传代扩增至一定数量后建立主细胞库和工作细胞库。

取本发明冻存的工作库细胞(P44)HeLa-F细胞，命名为人宫颈癌细胞HeLa-F，于2015年10月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，其地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为：CCTCC C2015138。

实施例2本发明HeLa-F细胞的大规模培养(HeLa-F细胞在波浪式反应器中培养实验)

1、实验方法

取本发明实施例1中冻存的主细胞库或工作细胞库HeLa-F细胞，在波浪式反应器中培养：

复苏来自本公司建立的HeLa-F细胞主细胞库或工作细胞库细胞1支，经过传代，待细胞扩增至20-25个175cm²培养瓶时，准备接种至波浪式反应器中。

当上述HeLa-F细胞接种至20-25个175cm²培养瓶后第二天，开启波浪式反应器，安装10L细胞袋。

通过接管机将接种瓶连接到10L细胞袋中，加入1000ml无血清培养液，定为D-1。设定摇动速度为12rpm(6rpm～30rpm)，摇动角度为：6°(3°～15°)，通气量：0.2Lpm(0.1Lpm～0.4Lpm)，CO2浓度：8.0％(3％～10％)，O₂浓度：25.0％(20％～50％)，温度：37.0℃(36℃～38℃)。

当上述HeLa-F细胞接种至20-25个175cm2培养瓶并培养3天后，将HeLa-F细胞接种至波浪式反应器中培养，培养袋体积为10L，初始工作体积为1500-1700ml，设定摇动速度为12rpm(6rpm～30rpm)，摇动角度为：6°(3°～15°)，通气量：0.2Lpm(0.1Lpm～0.4Lpm)，CO₂浓度：8.0％(3％～10％)，O2浓度：25.0％(20％～50％)，温度：37.0℃(36℃～38℃)，定为D0。在接种细胞1小时后取样计数并记录。

在D1时取样计数，计算存活率，并对细胞培养进行监控。

在D2时取样计数，计算存活率，当HeLa-F细胞达到约1.0E+6cells/ml时补加500ml-700ml无血清培养液，设定摇动速度为12rpm(6rpm～30rpm)，摇动角度为：6°(3°～15°)，通气量：0.2Lpm(0.1Lpm～0.4Lpm)，CO2浓度：8.0％(3％～10％)，O2浓度：25.0％(20％～50％)，温度：37.0℃(36℃～38℃)，补液后1小时取样计数。

在D3时取样计数，计算存活率，当HeLa-F细胞达到约1.0E+6cells/ml时补加1000-1200ml无血清培养液，设定摇动速度为12rpm(6rpm～30rpm)，摇动角度为：6°(3°～15°)，通气量：0.2Lpm(0.1Lpm～0.4Lpm)，CO2浓度：8.0％(3％～10％)，O2浓度：25.0％(20％～50％)，温度：37.0℃(36℃～38℃)，补液后1小时取样计数。

每24小时进行取样计数，计算存活率。

2、实验结果

大规模培养条件下，本发明HeLa-F细胞在细胞存活率大于85％的条件下，细胞浓度最终达到2.0E+6cells/ml，基本与静置培养的细胞浓度相当。

实验结果说明，本发明HeLa-F细胞可以直接高密度大规模悬浮培养，可用于大量的病毒产物和高质量的疫苗产品的制备，且大规模培养时可以对其直接悬浮培养，无需使用细胞微载体等辅助材料，工艺简单，成本低廉。

实施例3采用本发明HeLa-F细胞制备痘苗病毒

1、实验方法

痘苗病毒，为痘苗病毒哥本哈根株。痘苗病毒液中，病毒的滴度为5.77E+7pfu/ml。

取本发明实施例1中冻存的主细胞库或工作细胞库HeLa-F细胞，130×g离心5min，离心后重悬计数，细胞总数为：4.4E+7个细胞，存活率：91％。将HeLa-F细胞分装，每瓶为8.8E+6个细胞，按下表2分别加入培养液和痘苗病毒液，放入37℃(36～38℃)，5.0％(3％～10％)CO₂培养箱中培养48(24～96)小时。

表2培养液和痘苗病毒液的加入方式

以1000rpm离心10min收获细胞，每个样品(每个样品为约8E+6个细胞)加入2.0ml病毒保存液，含10mM Tris/5％Sucrose/10mM NaGlu/50mM NaCl(pH8.0)。冻融将混合物投入-80℃冰箱中过夜，然后取出，在37℃水浴中不停摇动直至全部解冻，如此进行3次破碎，3000rpm离心10min取上清。

2、实验结果

本试验在制备痘苗病毒的过程中，产生了包含痘苗病毒的重组HeLa-F细胞。

本发明方法制得的痘苗病毒的数量如下表3：

表3感染痘苗病毒的实验结果

实验结果说明，用本发明HeLa-F细胞能有效支持病毒复制，用其制备 痘苗病毒时，单细胞的病毒产量高达26.8～31.8pfu/cell，其中，MOI为0.1～0.15时，单细胞产量较高，为31.4～31.8pfu/cell，MOI＝0.15的单细胞病毒产量最高，为31.8pfu/cell。

综上，本发明通过驯化HeLa细胞获得了一种新的细胞HeLa-F，其为悬浮细胞，可以直接高密度大规模悬浮培养，同时支持病毒复制的能力也非常强，比如，用于制备痘苗病毒时，单细胞病毒产量高达26.8～31.8pfu/cell。因此，本发明HeLa-F可用于大量的病毒产物和高质量的疫苗产品的制备，且其大规模培养非常简单，无需使用细胞微载体等辅助材料，成本低廉，工业应用前景良好。