一种从动物肺组织中分离纯化II型固有淋巴细胞的方法与流程

本发明是关于一种从动物肺组织中分离纯化II型固有淋巴细胞的方法。

背景技术：

近年来，随着人们对固有免疫细胞的深入研究，发现了一群新的细胞亚群。这类亚群不表达抗原特异性识别受体(TCR或BCR)，在发育和形态上属于淋巴细胞谱系，与过去人们发现的自然杀伤(NK)细胞和淋巴组织诱导(LTi)细胞一起被称为固有淋巴细胞(ILC)。按照辅助性T(Th)细胞的分类方法，根据细胞因子分泌和转录因子表达的不同，ILC家族又可被分成三大类：ILC1、ILC2和ILC3。

Ⅱ型固有淋巴细胞(Type II innate lymphoid cells,ILC2)是上述的其中一种新近发现的固有淋巴细胞群体，主要分布于肺脏、肠道、皮肤等黏膜组织，在IL-25和IL-33的刺激下能够产生IL-5和IL-13等Th2型细胞因子。ILC2在呼吸道抗感染免疫以及过敏性疾病中发挥重要作用，因而备受关注。已有研究表明，在呼吸道过敏性疾病发病早期，ILC2是Th2型细胞因子的重要来源，可以调控适应性免疫应答；同时在抗寄生虫、病毒感染以及组织修复过程中，ILC2也发挥重要功能。因此，ILC2的生物学研究具有重大的现实意义。尽管目前在ILC2相关领域的研究取得了重大的突破，但是由于ILC2细胞数量少、细胞表面缺少高度特异的标志分子，因而在获取该细胞用于研究方面仍然面临重大的技术挑战。其中，肺脏是ILC2细胞最早被发现的器官之一，肺脏ILC2介导呼吸道过敏反应等疾病早期的II型免疫应答，从小鼠肺脏中准确分离ILC2细胞是通过小鼠模型研究ILC2生物学的关键技术，然而，目前尚无对小鼠肺脏ILC2细胞分离方法的详尽描述。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种从动物肺脏中准确分离ILC2细胞的方法。

本发明提供了一种从动物肺组织中分离纯化II型固有淋巴细胞的方法，该方法包括：

取动物肺脏组织，破碎，加入I型胶原酶消化，得到肺组织消化溶液；

将肺组织消化溶液过滤；

通过Percoll法分离得到肺组织淋巴细胞；

用Ⅱ型固有淋巴细胞特异性抗体标记所得到的肺组织淋巴细胞，经细胞流式技术分选得到Ⅱ型固有淋巴细胞。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述动物为小鼠。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，是将动物肺脏组织剪成1～2mm³大小再加入I型胶原酶消化。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，对应每只小鼠的肺脏，加入3～20ml浓度为0.03～0.5％(m/v)的I型胶原酶消化。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，加入I型胶原酶后在30～42℃的环境中消化10～90分钟。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，肺组织消化溶液是200目的筛网过滤。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，Percoll法分离得到肺组织淋巴细胞的具体操作为：

用42％Percoll 3ml重悬沉淀，然后将该细胞悬液缓慢加到3ml 70％Percoll表面，离心1260g 30分钟。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，通过四种抗体从肝脏单个核细胞中进行流式细胞术分选纯化Ⅱ型固有淋巴细胞。优选地，所述抗体为FITC-anti mouse KLRG1、PE-anti mouse Lineage Cocktail、PerCP.Cy5.5-anti mouse CD90.2、APC-anti mouse IL33R。这些抗体可商购获得，例如可购自Biolegend公司。

在本发明的一具体实施方案中，本发明的从动物肺组织中分离纯化II型固有淋巴细胞的方法包括：

将动物肺组织剪成1～2mm³左右小块将组织块放入离心管中加5ml不含血清的具有生理渗透压的溶液(如不完全DMEM或生理盐水等)配制的0.1％胶原酶I溶液，置于37℃震荡箱中220rpm消化30分钟；置于冰上终止消化，用200目筛网过滤，将停留在网上的肺组织轻轻研磨后再过滤；

4℃1060g离心10分钟，弃上清；

密度梯度离心：用42％Percoll 3ml重悬沉淀，然后将该细胞悬液缓慢加到3ml70％Percoll(GE Healthcare)表面，离心1260g 30分钟；

取中间层细胞到新的15毫升离心管，PBS加满，1060g离心10分钟后弃去上清液；

细胞悬液加入大鼠血清封闭Fc受体并标记荧光抗体：FITC-anti mouse KLRG1、PE-anti mouse Lineage Cocktail、PerCP.Cy5.5-anti mouse CD90.2、APC-anti mouse IL33R，4℃避光孵育15min；

加满PBS，4℃1060g×10min，洗两遍；

用流式细胞仪分选Lineage-IL33R+CD90.2+KLRG1+细胞，即为ILC2细胞。

本发明的方法，运用胶原酶I从组织中释放淋巴细胞而最大限度维持淋巴细胞活性；通过密度梯度离心，将淋巴细胞与肝脏组织细胞分离开，从而富集肺脏II型固有淋巴细胞。该方法经过大量实践证明能从正常或具有肺脏炎症的C57BL/6小鼠中分离并纯化出高纯度、高活性的II型固有淋巴细胞。

附图说明

图1表示Ⅱ型固有淋巴细胞在分选过程中的Gate步骤。

图2显示ILC2细胞的流式细胞术分选实验结果。

图3显示分选所得的ILC2细胞的功能/活性鉴定结果。

图4A与图4B显示不同条件下经本方法所能获取的ILC2细胞数量。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例1

以下实验均需无菌操作。

(1)正常或具有肺脏炎症的小鼠肺组织，放入无菌PBS中置于冰上。

(2)将组织剪成1～2mm3左右小块将组织块放入离心管中加5ml不完全DM EM配制的胶原酶I溶液(0.1％，即1mg/ml，sigma)，旋紧盖子置于37℃震荡箱中220rpm消化30分钟(可见组织块已分散而失去块的形状，即消化成功)。

(3)第3步完成后，置于冰上终止消化，用200目筛网过滤，将停留在网上的肺组织轻轻研磨后再过滤。

(4)4℃1060g离心10分钟，弃上清。(以下离心除了密度梯度离心的步骤是常温外均是4℃)。

(5)密度梯度离心：用42％Percoll 3ml重悬沉淀，缓慢加到3ml 70％Percoll(GE Healthcare)表面，离心1260g 30分钟。

20ml 70％Percoll配方：12.6ml Percoll原液(GE Healthcare)+

1.4ml 10×PBS+6ml 1×PBS

20ml 42％Percoll配方：7.56ml Percoll原液(GE Healthcare)+

840ul 10×PBS+11.6ml 1×PBS

(6)取中间层细胞到新的15毫升离心管，PBS加满，1060g离心10分钟后弃去上清液，然后用1毫升PBS重悬细胞。

(7)取出少量细胞用台盼蓝染色后进行计数。

(8)根据计数结果，取包含有100万个细胞的细胞悬液加入10％悬液体积的大鼠血清封闭Fc受体并标记荧光抗体：FITC-anti mouse KLRG1、PE-anti mouse Lineage Cocktail、PerCP.Cy5.5-anti mouse CD90.2、APC-anti mouse IL33R(抗体均来自Biolegend)，4℃避光孵育15min。

(9)加满PBS，4℃1060g×10min，洗两遍。

(10)用流式细胞仪分选Lineage^-IL33R⁺CD90.2⁺KLRG1⁺细胞，即为ILC2细胞。

图1表示Ⅱ型固有淋巴细胞在分选过程中的Gate步骤：

肺单个核细胞→CD45⁺→KLRG1⁺CD90⁺→Lineage^-IL-33R⁺

图2显示实验结果，依据本方法分离肺脏淋巴细胞后能清晰检测到ILC2细胞的存在，其在流式细胞仪上所展示的位置如图2所示。经该检测策略进行流式分选，每只成年的正常小鼠能获得4000-10000个II型固有淋巴细胞，小鼠处于肺脏炎症状态下，能获得更大数量的细胞，具体数量依炎症严重程度而定。分选所得的该细胞，在体外以50000/mL密度培养时，以mIL-33(比如50ng/mL mIL-33)刺激2天后能产生大量的Th2型细胞因子如IL-5和IL-13，但不能产生Th1型细胞因子如IFN-γ(图3)，表示该细胞具有较好的活性。

实施例2

正常小鼠的肺脏经本发明的方法，用生理盐水配制的几种不同浓度的胶原酶I溶液消化，其他操作同实施例1，结果表明能分离并纯化出高活性的II型固有淋巴细胞，所能获得的II型固有淋巴细胞数量参见图4A。

正常小鼠经过80微克博莱美素滴鼻诱导肺脏炎症一周后，参照实施例1的方法分离II型固有淋巴细胞，结果表明能分离并纯化出高活性的II型固有淋巴细胞，所得的II型固有淋巴细胞数量参见图4B。