诱导脐带间充质干细胞向胰岛素分泌样细胞分化的无血清培养基及其制备方法和用途与流程

本发明涉及干细胞的研究领域，特别是涉及一种新型、高效的适用于间充质干细胞向胰岛素分泌样细胞诱导分化的无血清培养基及其制备方法和用途。
背景技术：
：糖尿病已成为21世纪世界范围内的一种流行病，是继肿瘤、血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病，具有高致死率、高致残率和高医疗花费的特征。目前中国糖尿病患者人数已达1.14亿，数量达到世界第一，约占全球糖尿病人总数的三分之一。因此，糖尿病已成为当前世界各国、特别是中国面对的严峻的公共健康问题。20世纪中叶以后，随着人体器官移植技术的兴起与发展，胰腺移植作为糖尿病的一种治疗方法被引进医疗领域。但是，能供移植的器官毕竟数量有限，且器官移植所需的费用也常常让人望而却步，而且器官移植往往会引起较强的免疫排斥，这些问题都一直困扰着医生和患者。近年来，干细胞理论和技术的快速发展给糖尿病患者的治疗带来了新的希望。尤其是成体干细胞的横向分化能力(即成体干细胞在一定的微环境作用下，可以横向分化为特定的细胞和组织)的证实，为细胞移植治疗糖尿病提供了另一可供选择的细胞来源。有研究表明，骨髓间充质细胞、成人脂肪细胞、脐血干细胞在特定的条件下可分化为胰岛样细胞，这些细胞在体外可分泌胰岛素，可望成为糖尿病细胞移植治疗的另一细胞来源。脐带间充质干细胞起源于中胚层，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外微环境条件下，可以向三个胚层的组织细胞分化。与其他成体干细胞相比，脐带间充质干细胞取材方便，来源丰富，采用的是通常被视为医疗废弃物的脐带组织，没有道德伦理问题。此外，脐带间充质干细胞体外增殖速度快，免疫源性相对较低，外源性污染少，因而更具有研究价值。技术实现要素：本发明的发明人研究得到一种新型、高效的适用于间充质干细胞向胰岛素分泌样细胞诱导分化的无血清培养基，利用此培养基可以将脐带间充质干细胞在体外无血清环境下，经过6-7天诱导分化为胰岛素分泌样细胞。本发明目的是提供一种将脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌样细胞的无血清培养基，利用该无血清培养基可以将脐带间充质干细胞在6天之内快速诱导为胰岛素分泌样细胞。本发明的另一目的是提供该培养基的制备方法。本发明的还一目的是提供一种使用该培养基诱导分化脐带间充质干细胞的方法。本发明的又一目的是提供该培养基的用途。本发明的技术方案如下。一方面，本发明提供一种用于诱导脐带间充质干细胞(UC-MSCs)向胰岛素分泌样细胞分化的无血清培养基，所述无血清培养基包含：高糖DMEM、血清替代物(SR)、B27无血清添加剂、胰岛素-转铁蛋白-硒复合物(ITS)、非必需氨基酸(NEAA)、N-2无血清添加剂，以及肝素(Heparin)、长春花碱Ⅲ(Conophylline)、尼古酰胺(Nicotinamide)和重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)和五肽胃泌素(Pentagastrin)。优选地，以100体积份计，所述无血清培养基包含：85-95体积份的葡萄糖含量为4.5g/L的高糖DMEM、5-8体积份的血清替代物(SR)、1-4体积份的B27无血清添加剂(50×)、1-1.5体积份的胰岛素-转铁蛋白-硒复合物(ITS)、0.5-2体积份的非必需氨基酸(NEAA)水溶液、0.5-2体积份的N-2无血清添加剂(100×)，以及在所述无血清培养基中终浓度为0.5-2ug/ml的肝素(Heparin)、终浓度为50-200ng/ml的长春花碱Ⅲ(Conophylline)、终浓度为5-20mmol/L的尼古酰胺(Nicotinamide)和终浓度各自为5-20ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)和五肽胃泌素(Pentagastrin)。更优选地，以100体积份计，所述无血清培养基包含：89体积份的葡萄糖含量为4.5g/L的高糖DMEM、5体积份的血清替代物(SR)、2体积份的B27无血清添加剂(50×)、1体积份的胰岛素-转铁蛋白-硒复合物(ITS)、1体积份的非必需氨基酸(NEAA)水溶液、1体积份的N-2无血清添加剂(100×)，以及在所述无血清培养基中终浓度为1ug/ml的肝素(Heparin)、终浓度为100ng/ml的长春花碱Ⅲ(Conophylline)、终浓度为10mmol/L的尼古酰胺(Nicotinamide)和终浓度各自为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)和五肽胃泌素(Pentagastrin)。其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各自为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸。根据本申请的具体实施方式，所述非必需氨基酸水溶液可以采用Gibco公司货号为11140的产品。根据本申请的具体实施方式，所述血清替代物可以采用KnockOutTMSerumReplacement(Gibco公司产品，货号10828-010)。根据本申请的具体实施方式，所述B27无血清添加剂(50×)可以采用Gibco公司货号为17504044的产品。根据本申请的具体实施方式，所述胰岛素-转铁蛋白-硒复合物(ITS)可以采用Sigma公司货号为I3146的产品。根据本申请的具体实施方式，所述N-2无血清添加剂(100×)可以采用Gibco公司货号为17502048的产品。以所述无血清培养基的总量为100mL计，其组成可以为下表1所示情况。表1优选地，所述无血清培养基的组成可以为下表2所示情况。表2成分用量高糖DMEM培养基(葡萄糖含量4.5g/L)89mlSR5mlB27(50X)2mlITS1mlN-2(100X)1mlNEAA1mlHeparin100ugConophylline(100μg/ml)10μgNicotinamide1mmolb-FGF(1μg/ml)1μgEGF1μgHGF1μgPentagastrin1μg对于本发明的无血清培养基，所述脐带间充质干细胞为人来源的脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)，优选为从自然分娩或剖宫产的健康新生儿新鲜脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。另一方面，本发明提供上述无血清培养基的制备方法，所述制备方法包括：将各个成分混合均匀。还一方面，本发明提供一种用于诱导脐带间充质干细胞向胰岛素分泌样细胞分化的方法，所述方法包括：采用本发明所述的无血清培养基培养脐带间充质干细胞。优选地，所述脐带间充质干细胞为人来源的脐带间充质干细胞，更优选为从自然分娩或剖宫产的健康新生儿新鲜脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。优选地，所述方法包括以下步骤：(1)将脐带间充质干细胞以2-6×104个细胞/cm2的密度接种于所述无血清培养基中，然后在CO25％、37℃下培养，例如在CO2浓度为5％的37℃恒温培养箱中；(2)每2-3天将步骤(1)的细胞培养物于300-800rpm下离心4min，吸弃旧培养基，更换为新鲜的所述无血清培养基；例如，用移液管缓慢吸取旧培养基细胞悬液于离心管中，在300-800rpm下低速离心4min，然后吸弃旧培养基，更换为新鲜本发明诱导培养基，每2-3天换液一次；(3)培养6-7天，收获细胞；(4)检测步骤(3)的所收获细胞的诱导分化效果。其中，所述步骤(4)包括检测以下项目中的一项或多项(优选全部项)：单位细胞胰岛素释放量；胰岛素释放相关基因PDX-1、INSULIN和NGN-3的表达；细胞核蛋白PDX-1和胞浆蛋白Insulin的存在；胰岛素分泌样细胞特异性标志PDX-1、NKX6.1、Insulin的阳性表达率。更优选地，所述方法包括以下步骤：(1)将脐带间充质干细胞以5×104个细胞/cm2的密度接种于超低吸附六孔培养板中的所述无血清培养基中，然后在CO25％、37℃下培养，例如在CO2浓度为5％的37℃恒温培养箱中；(2)每2天将步骤(1)的细胞培养物于500rpm下离心4min，吸弃旧培养基，更换为新鲜的所述无血清培养基；例如，用移液管缓慢吸取旧培养基细胞悬液于离心管中，在500rpm下低速离心4min，然后吸弃旧培养基，更换为新鲜本发明诱导培养基，每2天换液一次；(3)培养6-7天，收获细胞；(4)检测步骤(3)的所收获细胞的诱导分化效果。步骤(1)中，脐带间充质干细胞(UC-MSCs)优选为人来源的脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)，更优选为从自然分娩或剖宫产的健康新生儿新鲜脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。又一方面，本发明提供所述无血清培养基在制备干细胞培养介质中的用途。其中，所述干细胞从哺乳动物、例如人的组织或器官中分离得到，所述组织或器官为骨髓、脐带和脂肪中的一种或多种；优选地，所述干细胞为哺乳动物来源的脐带间充质干细胞，更优选为人来源的脐带间充质干细胞；进一步优选地，所述干细胞是从自然分娩或剖宫产的健康新生儿新鲜脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。发明人研究发现，本发明提供的新型间充质干细胞向胰岛素分泌样细胞诱导分化的无血清培养基不含血清成分，避免了在细胞培养过程中因血清批次差异导致细胞生长过程不稳定的情况，也排除了传播异种病原体危险的可能；并且，该无血清培养基实现了快速将间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌样干细胞(仅需6天时间)，为动物细胞的体外培养提供了一种高效的解决方案。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1是在培养基组成筛选过程中的细胞团数量(直径＞50μm)随培养时间变化趋势图。图2是在不同浓度五肽胃泌素的培养基中单位细胞胰岛素释放量的比较。图3是不同浓度ITS的培养基中细胞形态的比较，其中图3A为0.5体积ITS诱导6天的细胞形态，图3B为1.0体积ITS诱导6天的细胞形态，图3C为2.0体积ITS诱导6天的细胞形态。图4是使用本发明的培养基诱导脐带间充质干细胞向胰岛素分泌样细胞分化过程中(10天内)的细胞团数量(直径＞100μm)随培养时间变化趋势图。图5是使用本发明的培养基诱导脐带间充质干细胞向胰岛素分泌样细胞分化过程中(6天内)的细胞团形态变化。图6为流式细胞仪分析经本发明培养基诱导得到的胰岛素分泌样细胞特异性细胞表面分子结果，图6A为诱导前后PDX-1变化，图6B为诱导前后NKx6.1变化，图6C为诱导前后insulin变化，左图为诱导前，右图为诱导6天后。图7为脐带间充质干细胞经本发明培养基诱导分化得到的胰岛素分泌样细胞特异性基因在转录水平的RT-PCR分析，图7A为诱导前，图7B为诱导6天后；其中M为核酸分子量标准，1为内参基因GAPDH，2为PDX-1，3为INSULIN，4为NGN-3。图8为脐带间充质干细胞经本发明培养基诱导分化得到的胰岛素分泌样细胞特异性基因在蛋白水平的分析，其中图8A为核蛋白PDX-1染色，图8B为胞浆蛋白INSULIN染色，图8C为合并叠图。图9为脐带间充质干细胞经过本发明培养基诱导得到的胰岛素分泌样干细胞在低糖和高糖每104细胞释放胰岛素量检测，其中阴性组为诱导前，诱导组为诱导6天后，阳性对照组为胰岛素瘤细胞。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。实施例中采用的NEAA为非必需氨基酸水溶液，其包含浓度均为10mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸。实施例1培养基组成的筛选基础培养基：DMEM(葡萄糖含量4.5g/L)+5％SR+1％NEAA+2％B27(50X)+1％N-2(100X)+10ng/mlHGF+10ng/mlEGF+10ng/mlb-FGF+10mmol/LNicotinamide；筛选成分：在基础培养基中添加100ng/ml长春花碱Ⅲ(Conophylline)、1体积份的ITS、终浓度为1ug/ml肝素(Heparin)、以及终浓度均为10ng/mlβ细胞调节素(betacellulin)、唾液素4(Exendi-4)、胰岛素样生长因子(IGF-1)和五肽胃泌素。各分组情况如下表3所示。表3在生物安全柜内，取分离于自然分娩新生儿脐带华通式胶组织的第3代的hUC-MSCs，以5×104个细胞/cm2密度接种于超低吸附六孔板中，每孔加2ml表3中所示各组受试培养基，观察细胞生长情况，观察细胞成团数量。结果：第一组培养基中，细胞团数量少；第二、三、四组培养基中依次添加了长春花碱Ⅲ、五肽胃泌素以及肝素，细胞团数量有所增加，但细胞团结构不紧凑；第五组细胞团数量最多，同时细胞团成熟度最好；第六、七、八组依次添加β细胞调节素、唾液素4、胰岛素样生长因子，但这三种因子在细胞团数增加影响不大。结果参见图1。实施例2培养基成分(长春花碱Ⅲ)含量的筛选受试培养基：89体积份的高糖DMEM(葡萄糖含量4.5g/L)、5体积份的血清替代物(SR)、2体积份的B27(50X)、1体积份的ITS、1体积份的非必需氨基酸(NEAA)、1体积份的N-2(100X)、终浓度为1ug/ml的肝素(Heparin)、10mmol/L的尼古酰胺、终浓度均为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、五肽胃泌素以及浓度梯度为1、10、50、100、200、300ng/ml的长春花碱Ⅲ(Conophylline)。采用上述不同浓度长春花碱Ⅲ(Conophylline)的培养基进行人脐带间充质干细胞的诱导分化培养。结果：在浓度为1和10ng/ml长春花碱Ⅲ的两组受试培养基中，细胞团边缘出现游离细胞附着，随培养时间延长，细胞团松散，表明细胞团成熟度不够；在浓度为50、100和200ng/ml长春花碱Ⅲ的三组受试培养基中，细胞团紧凑，且细胞团逐渐增大，表明细胞团增殖状况良好；在浓度为300ng/ml长春花碱Ⅲ受试组中，细胞团颜色加深，但细胞团边缘细胞形态发生变化，表明已分化细胞发生了不定向分化。实施例3培养基成分(五肽胃泌素)含量的筛选受试培养基：89体积份的高糖DMEM(葡萄糖含量4.5g/L)、5体积份的血清替代物(SR)、2体积份的B27(50X)、1体积份的ITS、1体积份的非必需氨基酸(NEAA)、终浓度为1ug/ml肝素(Heparin)、1体积份的N-2(100X)、100ng/ml的长春花碱Ⅲ(Conophylline)、10mmol/L的尼古酰胺、终浓度均为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)以及浓度梯度为1、2、5、10、20、30、50ng/ml的五肽胃泌素。采用上述不同浓度五肽胃泌素的培养基进行人脐带间充质干细胞的诱导分化培养，然后采用糖刺激实验，测定单位细胞(1×104个)各组胰岛素释放量，进行了各组细胞的比较。其中糖刺激实验如下进行：收集培养6天的细胞团，分别加入2ml25mM/L葡萄糖DMEM刺激液，轻轻吹散混匀细胞团，37℃，刺激2小时后收集上清，以胰岛素ELISA试剂盒测收集上清，最终读取OD450值。结果：在五肽胃泌素浓度为5、10、20ng/ml的培养基中分化的细胞具有较高的单位细胞胰岛素释放量效果。结果参见图2。实施例4培养基成分(ITS)含量的筛选受试培养基：89体积份的高糖DMEM(葡萄糖含量4.5g/L)、5体积份的血清替代物(SR)、2体积份的B27(50X)、1体积份的ITS、1体积份的非必需氨基酸(NEAA)、终浓度为1ug/ml的肝素(Heparin)、1体积份的N-2(100X)、100ng/ml的长春花碱Ⅲ(Conophylline)、10mmol/L的尼古酰胺、终浓度均为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、五肽胃泌素以及浓度梯度为0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0ng/ml的ITS。采用上述不同浓度ITS的培养基进行人脐带间充质干细胞的诱导分化培养。结果：在ITS浓度为0.2、0.5、0.8ng/ml的培养基中，细胞出现松散死亡，细胞团直径较小，且不均匀，培养皿底部死细胞较多；在ITS浓度为1.0、1.2、1.5ng/ml的培养基中，细胞成团紧密；在ITS浓度为2.0ng/ml的培养基中，细胞团虽然紧密，但死细胞数量又出现，开始增加。结果参见图3。实施例5诱导时间筛选无血清诱导分化培养基制备：配方：89体积份的高糖DMEM(葡萄糖含量4.5g/L)、5体积份的血清替代物(SR)、2体积份的B27(50X)、1体积份的ITS、1体积份的非必需氨基酸(NEAA)、1体积份的N-2(100X)、终浓度为1ug/ml肝素(Heparin)、100ng/ml长春花碱Ⅲ(Conophylline)、10mmol/L尼古酰胺、以及终浓度均为10ng/ml重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、五肽胃泌素。各成分混合均匀后制成培养基。细胞培养：在生物安全柜内，取分离于自然分娩新生儿脐带华通式胶组织的第3代的hUC-MSCs，将hUC-MSC以5×104个细胞/cm2的密度接种于超低吸附六孔培养板，每孔加本发明诱导培养基2ml，移入CO2浓度为5％的37℃恒温培养箱中；用移液管缓慢吸取旧培养基细胞悬液于离心管中500rpm低速离心4min吸弃旧培养基，更换为新鲜本发明诱导培养基，每2天换液一次；持续诱导10天，观察细胞团数量变化，并计数，结果：细胞自诱导后细胞团数量在前六天逐渐增加，在第6天达到最大值(223个)，6天后，细胞团数量逐渐减少。结果参见图4。实施例6无血清诱导培养基的制备及应用无血清诱导分化培养基制备：配方：89体积份的高糖DMEM(葡萄糖含量4.5g/L)、5体积份的血清替代物(SR)、2体积份的B27(50X)、1体积份的ITS、1体积份的非必需氨基酸(NEAA)、1体积份的N-2(100X)、终浓度为1ug/ml肝素(Heparin)、100ng/ml长春花碱Ⅲ(Conophylline)、10mmol/L尼古酰胺、以及终浓度均为10ng/ml重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、五肽胃泌素(Pentagastrin)。各成分混合均匀后制成培养基。细胞培养参照实施例5方法，连续六天，观察细胞团形态变化。结果：诱导第1天后，细胞团聚，形成小细胞团，数量多且透光性好，随培养时间的延伸，小细胞团逐渐汇集成大细胞团，小细胞团数量减少，大细胞团数量逐渐增加，随细胞团直径变大，细胞团的透光性逐渐减小；在培养6天后，大细胞团(成熟细胞团)占据大部分视野。结果参见图5。实施例7流式细胞仪分析胰岛素分泌样细胞特异性表面标志收集实施例6诱导分化6天的细胞团于离心管中，然后在4℃条件下500rpm离心4min，弃上清收集细胞团，加0.25％胰酶同时轻轻吹打混匀20min，待细胞团结构松散，无肉眼可见细胞团悬浮，加入新鲜培养基终止消化，然后1200rpm离心6分钟，弃上清收集细胞，PBS清洗两次，将细胞每管1×105个转移至流式管，加入500μl4％多聚甲醛，室温固定30min，再1200rpm离心6分钟，弃上清收集细胞，每管加入5μlPDX-1、NKX6.1、Insulin、IgG1-PE(同型对照)抗体混匀4℃下避光孵育30分钟，PBS清洗一次，离心去上清，加500μLPBS缓冲液重悬混匀，上机检测(流式细胞仪XL，Beckman公司)，每个样本收集1×104个细胞。结果：间充质干细胞在诱导六天后表达胰岛素分泌细胞特异性标志，流式检测PDX-1-阳性表达率51.4％，NKx6.1阳性表达率15.36％，insulin阳性表达率24.03％。诱导前细胞不表达此标志。结果参见图6。实施例8RT-PCR分析胰岛素分泌样细胞特异性基因收集实施例6诱导分化6天的细胞团于离心管中，按总RNA提取试剂盒(R6834-01，OMRGA公司产品)抽提RNA，将抽提的RNA用反转录试剂盒(RR014A，TAKARA产品)反转录得到cDNA样本，并进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后移至凝胶成像仪观察。结果：诱导后表达胰岛素分泌样细胞标志基因，PDX-1、INSULIN以及NGN-3有明亮程度不同的条带。结果参见图7。实施例9免疫荧光染色分析hUC-MSCs特异性蛋白收集实施例6诱导分化6天的细胞团于离心管中，以4％多聚甲醛固定15分钟后用0.25％TritonX-100打孔处理20分钟，山羊血清封闭后加稀释好的红色鼠抗人(抗-Insulin抗体)，在4℃下过夜避光孵育；之后然后以染PDX-1核蛋白，在4℃下过夜避光孵育，荧光显微镜下观察。结果：以本发明方法诱导分化得到胰岛素分泌样细胞在蛋白水平表达INSULIN和PDX-1特异性蛋白。结果参见图8。实施例10单位细胞胰岛素分泌量检测收集实施例6诱导分化6天的细胞团于离心管中，弃上清，PBS重悬细胞团，轻缓吹吸，500rpm离心3分钟；弃PBS后分别加入5.5mM/L葡萄糖DMEM刺激液(低糖组)和25mM/L葡萄糖DMEM刺激液(高糖组)，轻轻吹散混匀细胞团，37℃，5％CO2条件下，刺激2小时；500rpm离心3分钟，收集上清备测；ELISA检测胰岛素分泌量；阳性对照组为胰岛细胞瘤。结果：经过本发明培养基诱导得到的胰岛素分泌样干细胞在高糖刺激下每104细胞释放胰岛素4.393uIU/ml，阳性对照组在高糖刺激下每104细胞释放胰岛素6.9828uIU/ml。诱导组＝62.91％阳性组。结果参见图9。以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。当前第1页1 2 3