体外规模化培养脐带间充质干细胞的方法与流程

本发明涉及一种干细胞培养的方法，尤其涉及一种脐带间充质干细胞的培养方法，以实现体外规模化培养。

背景技术：

根据美国国立卫生研究院管理的临床研究登记系统(Clinicaltrials.gov)数据显示，截止至2016年5月，全球已登记的间充质干细胞临床研究项目已有612项，其中中国有125项。世界已注册MSCs的临床试验分析567项，除了用来促进恢复造血，与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等以外，还用于心脑血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗研究，已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。脐带制备的间充质干细胞的临床研究在国内外也已经广泛开展，为了获得足量高效的间充质干细胞满足即将到来的临床治疗，脐带间充质干细胞规模化生产已经势在必行，但受到技术和科技水平的限制，从脐带提取的间充质干细胞数量较少，提取后由于杂细胞含量高、细胞的数量级小等问题无法直接用于临床和大量研究，对于脐带间充质干细胞的安全高效扩增已经成为干细胞行业的研究热点。

脐带间充质干细胞具有免疫调控、造血支持、连续传代和长期冻存后仍有自我复制和多向分化潜能等特点。在特定诱导条件下，可分化为多种组织细胞，可作为种子细胞用于组织器官损伤修复和抗衰老。但有关间充质干细胞的安全性存在一定的争议，因此脐带间充质干细胞是否具有致瘤型也是目前研究的热点。

细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定的环境中，易发生分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后凋亡；或发生转化获得不死性，可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生，为了减少体外培养的脐带间充质干细胞分化、衰退、死亡和癌变等差异的影响，在培养的过程中应当严格控制时间。

根据国内外文献报道脐带间充质干细胞体外传代培养染色体核型正常稳定，但也报道了最早发生变异的一例为第8代(中国优生与遗传杂志，2012(10)：42～44)。其制备方法是将脐带无菌条件下用PBS冲洗干净，用剪刀剪细，放入培养瓶中，加入完全培养基(DMEM/F-12)培养，4天～5天后全量换液，弃去非贴壁细胞后每3天～4天半量换液，观察细胞到80％融合时，胰酶消化传代。

国家863计划资助项目有研究采用胶原酶II消化法体外扩增3个代次(P3、P5、P7)脐带间充质干细胞，通过三个代次细胞生长形态、染色体核型、免疫表型和诱导分化观察体外连续传代培养脐带间充质干细胞染色体核型的稳定性(军事医学，2012，36(8)：599～602)。结果显示，此法在体外扩增P7代内的间充质干细胞未发生染色体结构的异常改变，保持了正常人体二倍体核型，为临床应用脐带间充质干细胞提供了遗传学的试验依据。

康宁公司推出HYPERFlask^TM高密度细胞培养容器，其包括10层大小相同的培养片，每个培养片都经过康宁CellBIND^TM表层处理，细胞附着度和生长速度得到提升，每片还设有一个透气良好的细胞生长层，各层空间设有空气分隔带，以达到最佳的气体交换效果。10个生产层被连载一起，组成一个多层培养容器。该产品尺寸与标准T175培养瓶无异，采用新型多层设计使得培养细胞的数量是T175培养瓶的10倍。选用康宁新一代细胞培养容器，可显著减少加工和处理耗时并降低对空间和废弃处理的要求。

通过采用康宁HYPERFlask细胞培养瓶，能够扩增生产大量用于研究的脂肪干细胞。脂肪干细胞在HYPERFlask细胞培养瓶中很容易扩增，并且具有类似成纤维细胞的形态，这一点和带通气盖的T175培养瓶中培养的脂肪干细胞一样。培养以后的脂肪干细胞流式细胞仪鉴定证明扩增后的间充质特征和多向分化潜能(中国医药生物技术，2015，V10(5)：466～468)。此报道让脐带间充质干细胞利用HYPERFlask多层培养瓶规模化扩增成为一种可能。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种培养脐带间充质干细胞的方法，以实现在体外对间充质干细胞进行规模化培养。

一种体外规模化培养脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

步骤一，清洗去大部分脐带的残留血液，并保留10v/v％～20v/v％的残留未凝固血液；

步骤二，将脐带制成2mm³～5mm³大小组织碎块，并用0.2w/v％胶原酶II37℃消化，如：2小时；

步骤三，去除消化后的组织块，加入洗脱液进行离心，离心采用四步法，分别为：首先10分钟300r/min，然后15分钟1800r/min，接着10分钟1000r/min，以及最后10分钟1000r/min，分离出未提纯初代脐带间充质干细胞；

步骤四，将5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²获得的初代脐带间充质干细胞接种于生长面积为55cm²的培养容器，培养体系为含有10w/v％胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培养基；

步骤五，待底层贴壁细胞融合80％以上后，利用含有胰蛋白酶和EDTA·4Na的Trypsin-EDTA溶液消化，消化分散后的细胞按2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm²密度传代接种于生长面积148cm²培养容器，重复步骤四和步骤五传代步骤4次直至获得第4代细胞(记为：P4代)将第4代细胞按0.8×10⁷～1.2×10⁷个/瓶的浓度接种于HYPERFlask培养容器(康宁公司，美国)中，生长面积为1720cm²；直至第五代细胞(记为：P5代)或者第六代细胞(记为：P6代)数量级达到10⁸以上终止培养；

步骤六，将P5或P6代按照慢冻的规则降温并保存(如：ZENOAQ CELLBANKER 2使用手册，置气相液氮MVE罐中)，从制备到冻存时间严格控制在15天～25天之间；

步骤七，对生产出的间充质干细胞进行流式检测CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、无菌检测、支原体检测和传染病检测，筛选出合格的脐带间充质干细胞，建立可供检索的干细胞细胞信息档案，以备临床和研究使用。

本发明的方法，步骤一中，使用缓冲液清洗去大部分脐带的残留血液，该缓冲液如：但不仅限于磷酸缓冲盐溶液(PBS)，含有青霉素10万单位/L和链霉素100mg/L。

本发明技术方案实现的有益效果：

与现有脐带间充质干细胞的小规模培养方法相比，本发明提供的体外规模化培养脐带间充质干细胞的方法：

按0.8×10⁷～1.2×10⁷个/瓶的浓度传代到HYPERFlask细胞培养容器，根据细胞增殖特点、细胞生长体积提供生长最佳浓度，使试剂耗材可控制和脐带间充质干细胞制备生产标准化。

脐带间充质干细胞从进入制备周期到冻存时间严格控制在15天～25天，保证了脐带间充质干细胞的生物原性和安全性，可控地获得优质的产品。

在脐带间充质干细胞P5、P6代终止培养，P5代、P6代细胞较完整地保存了干细胞的生物特性，同时将脐带间充质干细胞的数量扩增至亿以上，脐带间充质干细胞在体外连续传代培养控制在6代以内，以保证扩增细胞的染色体结构稳定，降低分化、衰退、死亡和癌变等的概率。

在脐带间充质干细胞P5代、P6代采用康宁公司推出的多层细胞培养容器，培养面积可达1720cm²，多层的细胞培养容器具有透气性的材料上在维持细胞贴壁生长的同时可进行气体交换。所有的液体操作可通过瓶颈连接至所有的培养层，理想的生长表面采用康宁独特的CeIIBIND培养表面，大大的提高了细胞的吸附性和生长速度，提高了细胞的产率。

附图说明

图1A为实施例1获得P1代脐带间充质干细胞规模培养细胞图，图中单个细胞呈纤维样，视野明显可见杂细胞；

图1B为实施例1获得P3代脐带间充质干细胞规模培养细胞图，图中单个细胞呈纤维样，整体呈流线型，细胞体积较P1代有所增大；

图1C为实施例1获得P5代脐带间充质干细胞规模培养细胞图，图中单个细胞呈纤维样，整体呈流线型，细胞体积较P3代有所增大；

图2为实施例4获得P1、P2、P3、P4和P5代脐带间充质干细胞的增殖曲线图，图中横轴为细胞代数，纵轴为细胞数量；样本1、样本2和样本3为三个平行细胞数量样本随着传代变化；

图3为实施例5的P5代脐带间充质干细胞传代后生长曲线，图中横轴为时间，纵轴为细胞计数；

图4A为实施例1获得P5代细胞制成细胞悬液进行流式细胞仪检测，而得阴性对照散点图；

图4B为实施例1获得P5代细胞制成细胞悬液进行流式细胞仪检测，而得强表达散点图；

图5A为实施例1获得P5代细胞制成细胞悬液，进行流式细胞仪检测而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105阴性对照图；

图5B为实施例1获得P5代细胞制成细胞悬液，进行流式细胞仪检测而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105强表达曲线图。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明以下实施例所用实际和仪器详见如下表1，其它所用的试剂若未经说明，均购自康宁(Corning)公司。

表1

实施例1

(1)按照国家规范采集足月婴儿脐带及脐带血，酒精对脐带进行消毒；

(2)用新鲜缓冲液(含有1.00v/v％青霉素/链霉素)清洗掉大部分残留血液，保留10v/v％以上的残留未凝固血液。利用仪器装置进行碎化处理脐带，获得1mm³大小组织碎块在低浓度胶原酶II环境下消化足够时间；

(3)弃消化后残剩组织块，加入洗脱液采用四步离心法，分离出未提纯原脐带间充质干细胞，离心分离的参数分别为：300r/min10分钟、1800r/min15分钟、1000r/min10分钟、1000r/min10分钟；

(4)将获得的初代脐带间充质干细胞计数后按5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²种于生长面积为55cm²的塑料培养容器，培养体系为含有10％FBS的LG-DMEM；

(5)待底层贴壁细胞融合80％以上，利用含有胰蛋白酶和EDTA·4Na的Trypsin-EDTA消化，消化分散后的细胞按2.0×10⁴/cm²-3.0×10⁴/cm密度传代接种于生长面积148cm²培养容器，重复上述10％FBS的LG-DMEM体系培养步骤4次传代直至P4代；

(6)将P4代细胞按1.0×10⁷/瓶的浓度接种于HYPERFlask培养容器中，HYPERFlask培养容器生长面积为1720cm²，直至P5代脐带间充质干细胞数量级达到亿以上终止培养；

(7)将P5代或者P6代脐带间充质干细胞按照慢冻的规则降温，置气态液氮中保存，从制备到冻存时间严格控制在15～25天之间；

(8)对生产出的间充质干细胞进行流式检测CD34，CD45，CD73，CD90，CD105、无菌检测、支原体检测、传染病检测；

(9)筛选出合格脐带间充质干细胞，建立可供检索的干细胞细胞信息档案(参见表2)，以备临床和研究使用。

表2

实施例2，将实施例1中步骤(6)按1.0×10⁷/瓶的浓度接种于HYPERFlask培养容器对照成按1.25×10⁷/瓶、1.0×10⁷/瓶、0.75×10⁷/瓶、0.5×10⁷/瓶的浓度接种于HYPERFlask培养容器。

实施例3，将实施例1中步骤(6)接种于HYPERFlask培养容器对照成接种于HYPERFlask培养容器和普通细胞培养容器。

实施例4，将实施例1中步骤实验于三个脐带样本，扩增至P5代。

实施例5，将实施例1中步骤实验于三个脐带样本，取P5代细胞接种，每8小时计数，直至细胞完全融合后24小时。

取实施例1P1代、P3代和P5代细胞进行拍照，各代的细胞形态分别参见图1A、图1B和图1C。

取实施例4的P1、P2、P3、P4和P5代脐带间充质干细胞的增殖情况进行验证(参见图2)，由图2可见，随着传代代数的增加，细胞数量呈倍数增加。

取实施例5的脐带间充质干细胞绘制生长曲线，由图3可见，细胞按照2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm传代，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过24小时左右的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期，在细胞48小时左右完全融合，进入平定期细胞基本不再分裂。细胞经过了虚弱潜伏期和旺盛指数生长期，在平顶期初消化传代，无需额外进行更换完全培养基，节约了培养基。

不同传代浓度接种于HYPERFlask培养容器性状对比

实施例2细胞分别按1.25×10⁷/瓶、1.0×10⁷/瓶、0.75×10⁷/瓶、0.5×10⁷/瓶四种浓度进行传代，倒置显微镜下观察细胞的贴壁时间，细胞形态，折光性，融合时间和细胞活率的差别等详见表3，接种密度越小，融合时间越长，过长的融合时间会出现边缘模糊、白色絮状物、空泡等老化现象。

表3

普通细胞培养容器与HYPERFlask培养容器特性比较

实施例3细胞1.0×10⁷个分别接种到HYPERFlask培养容器和普通细胞培养容器(148cm²细胞培养皿)，普通细胞培养容器相对HYPERFlask培养容器需要消耗更多的数量，消化时间更长，酶消耗增加，空间占据大，均一较性较差，结果详见表4。

表4

脐带间充质干细胞表面标志性抗原检测

取实例一HYPERFlask细胞培养容器内P5代细胞，制成细胞悬液，流式细胞仪检测CD34、CD45、CD73、CD90和CD105等5个表面标记物(参见图4A和图4B)。用流式分析软件Flow Jo进行分析，P5或P6收获时，强表达标记细胞达95％以上，不表达细胞小于2％(参见图5A和图5B)。