1.一种体外规模化培养脐带间充质干细胞的方法,其特征在于包括如下步骤:
步骤一,清洗去大部分脐带的残留血液,并保留10v/v%~20v/v%的残留未凝固血液;
步骤二,将脐带制成2mm3~5mm3大小的组织碎块,用0.2w/v%胶原酶II 37℃消化;
步骤三,去除消化后的组织块,加入洗脱液进行离心,分离出未提纯初代脐带间充质干细胞;
步骤四,将获得的初代脐带间充质干细胞按5.0×104/cm2~1.0×105/cm2接种于生长面积为55cm2的培养容器,培养体系为含有10w/v%胎牛血清的LG-DMEM培养基;
步骤五,待底层贴壁细胞融合80%以上后,利用含有胰蛋白酶和EDTA·4Na的Trypsin-EDTA溶液消化分散细胞,消化分散后的细胞按2.0×104/cm2~3.0×104/cm2的种植密度接种于生长面积148cm2培养容器内进行传代,重复所述步骤四和步骤五的传代步骤,经4次传代直至获得第4代细胞;
步骤六,将第4代细胞按0.8×107~1.2×107个/瓶的密度接种于HYPERFlask培养容器中,直至第五代细胞或者第六代细胞终止培养。
2.根据权利要求1所述的体外规模化培养脐带间充质干细胞的方法,其特征在于所述的步骤一中,使用缓冲液清洗去大部分脐带的残留血液,所述的缓冲液含有青霉素10万单位/L和链霉素100mg/L。
3.根据权利要求1所述的体外规模化培养脐带间充质干细胞的方法,其特征在于所述的离心采用四步法,分别为:首先10分钟300r/min,然后15分钟1800r/min,接着10分钟1000r/min,以及最后10分钟1000r/min。
4.根据权利要求1所述的体外规模化培养脐带间充质干细胞的方法,其特征在于还包括将所述的第五代细胞或者所述的第六代细胞按照慢冻的规则降温并保存,从制备到冻存时间严格控制在15天~25天之间。
5.根据权利要求1所述的体外规模化培养脐带间充质干细胞的方法,其特征在于所述的HYPERFlask培养容器具有较大生长面积。
6.根据权利要求1所述的体外规模化培养脐带间充质干细胞的方法,其特征在于所述的第五代细胞或者第六代细胞数量级达到108以上终止培养。
7.根据权利要求1所述的体外规模化培养脐带间充质干细胞的方法,其特征在于所述的第4代细胞按0.8×107~1.2×107个/瓶的密度接种。