制备脐带间充质干细胞的方法与流程

本发明涉及一种干细胞培养的方法，尤其涉及一种脐带间充质干细胞的培养方法，以建立间充质干细胞制取的规范化方法。

背景技术：

间充质干细胞用于临床应用研究的种类主要是骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞，这两类细胞都具有间充质干细胞共同的特点低免疫源性，特别是后者更为明显。脐带中组织结构简单，除了主要的大血管，其余均以结缔组织为主，造成了脐带间充质干细胞基本未与抗原接触，所以免疫源性很低，这极大的增加了临床应用的可能性。脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。已经有较多的报道关于脐带间充质干细胞的制备。如何快速、有效地制备高品质的间充质干细胞用于临床和科研是目前干细胞的热点研究内容之一。由于受到技术水平所限，目前脐带间充质干细胞制备仍处于实验室小作坊式的方式制备，没有具体的标准规范生产流程，难以满足广泛的需求。

间充质干细胞制品不同于一般的生物制品，它来源于新生婴儿组织，生产制备过程涉及到组织的处理、原初代细胞的分离培养、细胞传代培养、冷冻保存、运输、复苏等临床应用前的程序，最终的间充质干细胞的产品不是某一单一或复合的物质，而是一群具有生物活性的细胞。

国家颁布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》，是遵循科学性的原则，以风险控制为主的思路，参照中国药典、WHO、欧盟、美国FDA及ICH有关细胞治疗指导原则而制定的，既体现适用性的原则，又具有前瞻性。规定了干细胞的采集、分离及干细胞(系)的建立；规定了细胞制剂的制备要求；规定了干细胞制备的检验，包括基本原则、质量检验和放行检验规定了干细胞制剂的质量研究，应不断地扩展对干细胞的安全性、有效性及稳定性研究，不断地提高对干细胞制剂质量控制的技术能力。

干细胞制剂的制备工艺包括干细胞的采集、分离、纯化、扩增和传代，干细胞(系)的建立、向功能性细胞定向分化，培养基、辅料和包材的选择标准及使用，细胞冻存、复苏、分装和标记，以及残余物去除等。本方法根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》的规定及精神，不断地优化脐带间充质干细胞的工艺过程，建立了脐带间充质干细胞制备及质量控制的全过程的规范化、标准化的制备生产程序，从整个生产链上的保证脐带间充质干细胞在细细胞数量、细胞活性、生物功能的效应和稳定、安全性及质量可控性。

目前的脐带间充质干细胞的标准制备生产未见报道，其报道的相关文章也仅限于试验阶段，没有形成规范化、标准化的工艺流程。有研究建立了充分利用组织块的方法：采集足月剖宫产分娩胎儿脐带，采用不剥离血管和包膜组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，待原代细胞长出时，收集原本换液应丢弃的组织块，进行二次贴壁培养，如此反复，待二次组织科长出细胞时，收集组织块进行三次贴壁培养。仅对三次贴壁培养长出的第三代细胞进行生物学分析(西南国防医药，2015，25(8)：828～831)。

组织块贴壁法是沿脐静脉内腔纵向切开血管，剥离脐静脉内膜，将剥离处的组织切成小块放在MSC培养液中，置于37℃，5v/v％CO₂培养箱培养，约5天～7天后可见贴壁生长的单个长条梭形细胞从组织中爬出，15天左右取贴块即可获得MSC。此法周期较长，增加了间充质干细胞在非人体单一的环境发生突变的几率，收获的原代细胞量少，且不能充分地利用组织，制备过程也限于实验室，非批量制备。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种制备脐带间充质干细胞的方法，以实现排除脐带个体差异性的影响，使得脐带间充质干细胞生产工艺全过程能够标准化、规范化、程序化，产品能被质量管理体系所控制。

一种制备脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

步骤1：按规范采集初生婴儿废弃脐带和脐带血，在距胎儿脐部近处3cm～5cm处用两把止血钳夹住，从中间剪断脐带，收集自断脐处至胎盘末端，将脐带放入含有保养液的密闭容器内；

步骤2：在安全稳定的环境下运输，运输过程中不能直接和外界空气有接触，保证脐带在24小时内到达实验室；

步骤3：按采集规范接收、登记建立档案，对采集的脐带血进行人源特定病毒(包括：HIV、HBV、HCV、TP和CMV等)的检测，保证脐带安全可靠和溯源；

步骤4：48小时内用磷酸盐缓冲液(含有青霉素10万单位/L和链霉素100mg/L)洗去大部分残留血液，保留10v/v％-20v/v％以上的残留血液，进行碎化处理，获得2mm³～5mm³均匀组织块；

步骤5：0.2w/v％胶原酶II，37℃恒温摇床上消化步骤4获得碎化组织2小时；

步骤6：加入DMEM，采用分步离心法获取脐带间充质干细胞，弃去残余组织。四步离心法的离心参数分别为：300rpm10min、1800rpm15min、1000rpm10min、1000rpm10min；

步骤7：将步骤6获得的原初代脐带间充质干细胞按5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²接种于盛有培养基体系的塑料培养容器，培养基体系为含有10v/v％胎牛血清的LG-DMEM；置37℃，5v/v％CO₂培养箱培养，3天后换培养液，弃去非贴壁细胞，以后每2天更换培养液；

步骤8：5天～10天待细胞达到80％～90％融合度，利用胰蛋白酶和EDTA·4Na联合消化法，轻轻吹打分散细胞；

步骤9：将步骤8获得的细胞，按2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm²密度接种体外扩增。扩增脐带间充质干细胞至需求的数量级，最多传代扩增脐带间充质干细胞到第六代(记为P6)；

步骤10：将步骤9获得的间充质干细胞进行质量评估，包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物(流式检测CD34，CD45，CD73，CD90，CD105)、无菌检测、支原体检测。

步骤11：对评估合格的间充质干细胞加入冷冻保护剂，按包装规格进行分装；

步骤12：置MVE气态液氮中保存。

本发明提供的制备脐带间充质干细胞的方法用于建立脐带间充质干细胞生产规范。所建立的脐带间充质干细胞生产规范还包括建立标准、标准操作程序、质量管理体系建立和评估系统。

建立标准包括：建立采集标准、运输标准、分离制备标准、冻存标准和入库标准等；

标准操作程序包括：编写标准操作程序(SOP)，制定采集、运输、分离、传代和扩增、分装、冻存、复苏、以及废弃物处理等标准操作程序。

本发明技术方案实现的有益效果：

1.根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》的规范，建立了标准化、规范化和程序化的脐带间充质干细胞产品的生产工艺流程。

2.由于制备的规范化和标准化，采取定量的制备方法排除采集脐带长度、粗细、色泽等个体差异性的影响，充分完全利用脐带资源。

3.建立规范化、标准化的脐带间充质干细胞的原代细胞分离和培养。

3.1优选出最适消化条件，0.2％胶原酶II、37℃恒温摇床环境内消化2小时。

3.2根据分离过程中的离心目的，优选出4步离心分离法，离心参数分别为300rpm10min、1800rpm15min、1000rpm10min、1000rpm10min，提高了分离提取效果，获得更多的原代间充质干细胞。

3.3优选出原代细胞5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²的种植密度于塑料培养容器中，较高的种植密度，顺应间充质干细胞的贴壁生长特性，以保证提取的原初代脐带间充质干细胞充分地贴壁生长。

4.建立标准化、规范化脐带间充质干细胞传代培养。

4.1优化出按2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm²接种于塑料培养容器。如果高于此浓度，细胞重叠，影响细胞贴壁生长，营养物质供给相对不足，代谢产物增加导致死细胞增加；如果低于此浓度，细胞融合时间长，细胞老化，不利于标准化规范化生产。

4.2由于在稳定条件下2～3天就传代一次，控制在P5、P6的传代次数，优选的体外扩增法缩短了培养周期，培养周期的缩短和传代代数的控制，提高了间充质干细胞细胞临床使用和研究的安全性。

附图说明

图1为实施例1获得P5代细胞制成细胞悬液进行流式细胞仪检测，而得阴性对照散点图；

图2为实施例1获得P5代细胞制成细胞悬液进行流式细胞仪检测，而得强表达散点图；

图3为实施例1获得P5代细胞制成细胞悬液，进行流式细胞仪检测而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105阴性对照图；

图4为实施例1获得P5代细胞制成细胞悬液，进行流式细胞仪检测而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105强表达曲线图。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明以下实施例所用实际和仪器详见如下表1，其它所用的试剂若未经说明，均购自康宁(Corning)公司。

表1

实施例1

1、按照标准采集初生婴儿废弃脐带和脐带血，采集需在经产妇知情同意情况下进行，在距胎儿脐部近处3cm～5cm处用两把止血钳夹住，从中间剪断脐带，收集自断脐处至胎盘末端脐带密封入含有保养液的脐带采集容器；

2、参照SOP在安全稳定的环境下运输，运输过程中不能直接和外界空气有接触，保证脐带在24小时内到达实验室；

3、登记建立档案，初检脐带，要求采集瓶无破损、采集液无色变、脐带总体积≥30ml，对采集的脐带血进行人源特定病毒(包括HIV、HBV、HCV、TP和CMV等)的检测；

4、48h内用缓冲液冲洗去除大部分残留血液，保留10v/v％-20v/v％的残留血液，缓冲液是采用含有1.00v/v％青霉素/链霉素的磷酸盐缓冲液。碎化处理清洗后的脐带，获得2mm³～5mm³均匀组织块。

5、0.2m/v％胶原酶II，37℃恒温摇床上消化4.4步骤获得碎化组织2小时；

6、加入洗脱液，采用离心法获取脐带间充质干细胞，弃去残余组织。四步离心法分离出未提纯人脐带间充质干细胞，离心分离的参数分别为：300rpm10min、1800rpm15min、1000rpm10min、1000rpm10min；

7、将获得的原初代脐带间充质干细胞按5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²接种于盛有培养基体系的塑料培养容器，培养基体系为含有10v/v％胎牛血清的LG-DMEM；置37℃，5v/v％CO₂培养箱培养，3天后换培养液，弃去非贴壁细胞，以后每2天更换培养液；

8、5～10天待细胞达到80％～90％融合度，利用胰蛋白酶和EDTA·4Na联合消化法，结合生物化学消化方法和物理吹打方法分散细胞；

9、传代培养步骤8获得的细胞，按2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm²密度接种，扩增脐带间充质干细胞至需求的数量级，最多传代扩增脐带间充质干细胞到P6代；

10、将步骤9获得的间充质干细胞进行质量评估，包括细胞数量、细胞活性、细胞表面标记物(流式检测CD34，CD45，CD73，CD90，CD105)、无菌检测、支原体检测。

11、对评估合格间充质干细胞进行分装，不能立即使用的按照慢冻的规则降温，置气态液氮中保存(参见表2)。

取实施例1细胞台盼蓝拒染后，使用Life Technologies自动细胞计数仪进行计数分析。本法的得到的间充质干细胞活性，各代细胞拒染实验活性均可达到97％～100％。

取实施例1细胞培养至P5细胞，用0.25w/w％胰酶消化，用PBS洗涤2～3次，制成1.0×10⁶的细胞悬液，流式检测CD34、CD45、CD73、CD90和CD105(参见图3和图4)。用流式分析软件Flow Jo进行分析，P5收获时，强表达标记细胞达95％以上，不表达细胞小于2％(参见图1和图2)。

表2

实施例2

将实例1中步骤7中原初代脐带间充质干细胞按5.0×10³/cm²～1.0×10⁴/cm²接种于盛有培养基体系的塑料培养容器对照成原初代脐带间充质干细胞10.0×10⁶个按1.0×10⁴/cm²、5.0×10⁴/cm²、10.0×10⁴/cm²和20.0×10⁴/cm²接种于盛有培养基体系的塑料培养容器(参见表3)。

观察细胞伸展时间、融合时间，记录细胞培养容器使用个数，并比较接种密度的优缺点。实验显示：接种密度低融合时间长，培养时间过长细胞出现老化现象，耗材使用量大，工作量大。接种密度与融合时间呈反比，接种密度太高，细胞生长空间不够喝营养不够，不利于细胞的传代扩增。综合分析，选择出原代细胞接种密度为5×10⁴/cm²～10.0×10⁴/cm²。

表3

实施例3

将实施例1中P1代细胞按2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm²密度接种对照成按1.0×10⁴/cm²、2.0×10⁴/cm²、3.0×10⁴/cm²和4.0×10⁴/cm²密度接种传代，倒置显微镜下观察脐带间充质干细胞的贴壁时间，细胞形态，折光性，融合时间，细胞活率的差别(参见表4)。

表4

实施例4

将实施例1的步骤5 0.2v/v％胶原酶II，37℃恒温摇床上消化步骤4获得碎化组织2小时对照成胶原酶II浓度设置0.1v/v％、0.2v/v％和0.4v/v％三个梯度值，消化时间1小时、2小时和4小时三个时间段，共9个对照试验(参见表5)。

实验显示胶原酶II浓度小、消化时间，消化不充分，获得法的原初代脐带间充质干细胞量少；胶原酶II浓度大、消化时间长虽能获得足够的原初代脐带间充质干细胞，但对细胞造成损伤，使贴壁伸展时间延长，融合时间延长。通过实验选择出胶原酶II浓度0.2％，消化时间2小时作为脐带组织块的消化参数。

表5

实施例5

将实施例1中步骤6离心分离的参数分别为：10min 300rpm、15min 1,800rpm、1000rpm 10min和1000rpm 10min对照成离心参数(10min 300rpm、15min 1,800rpm、10min 1,000rpm和10min 1,000rpm)；(10min 500rpm、15min 1,800rpm、10min 1,000rpm和10min 1,000rpm)；(10min 300rpm、15min 1,500rpm、10min 1,000rpm和10min 1,000rpm)，以及(300rpm 10min、1,800rpm 15min、1,500rpm 10min和1,500rpm 10min)四个离心组合(参见表6)。

第一次离心后弃沉淀，留上层液，因提取的间充质干细胞在上层液中，严格控制离心力和时间，时间过长或离心力太大，提取的细胞将被沉淀丢弃；第二次离心是从第一次离心后的上层液中收集间充质干细胞，离心力过小或时间过短，细胞被丢弃，离心力过大或时间过长细胞受损，影响细胞的生长扩增；第三、四次洗涤离心，也是既要达到完全收集，也要最大地保持细胞活性。最终选择出300r/min10分钟、1,800r/min15分钟、1,000r/min10分钟和1,000r/min10分钟的离心组合(离心机使用Thermo Scientific Sorvall ST 16系列离心机)。表6