本发明属于生物医学领域，具体地涉及高纯度脐带血干细胞的分离方法和试剂盒。
背景技术：
脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗80多种疾病。因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源。因此，脐带血是一种非常重要的人类生物资源。
脐带血中最重要的成分之一为脐带血干细胞。因此，从脐带血中分离或提取这些干细胞是脐带血进一步有效利用的重要前提。本申请的发明人在脐带血分离方面一直进行着深入研究，并且此前已公开了利用三种不同液体进行干细胞分离的方法及试剂盒(参见，例如CN101638637A或CN102154201A)。然而这些技术的目的均在于提高获得的产物的回收率和存活率，并没有关注获得的产物中有效干细胞的纯度。
对于用于治疗的干细胞，特别是直接用于注射的干细胞而言，存在杂质是极其不利的，甚至是危险的。因为干细胞中的杂质会引起体内产生排异反应，这种情况在当将干细胞输入不同来源的个体时特别严重，而在临床上异体输入是通常情况。因此，在脐带血提取的干细胞的过程中，不仅需要关注回收率和存活率，从安全角度，更需要关注脐带血干细胞的纯度。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明人进行了深入的研究并发现，在通过常规细胞分层液使沉淀细胞分层得到的有核细胞中，存在部分功能受损的有核细胞以及部分衰老的红细胞(本发明中也将这些细胞统称为“杂质细胞”)，这些细胞的密度比脐带血中有效干细胞略轻。基于此密度差通过设计针对有核细胞的进一步分离，从而得到更高纯度的脐带血干细胞。由此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的一方面，提供脐带血干细胞的分离方法，其包括下列步骤：
稀释步骤：将脐带血样品与细胞稀释液混合；
沉淀步骤：加入沉淀剂，并静置沉降以得到含有干细胞的上层细胞液，将所述含有干细胞的上层细胞液离心浓缩，得到细胞沉淀；
分层步骤：将所述细胞沉淀铺在细胞分层液上离心，得到中间云雾状有核细胞；
纯化步骤：将所述有核细胞铺在细胞纯化液上离心，得到两条细胞带，取下方细胞带中的细胞即为纯化的干细胞；其中，
所述细胞稀释液为PBS液或0.8-1.0重量％氯化钠水溶液，
所述细胞沉淀剂为4-10重量％的羟乙基淀粉水溶液，
所述细胞分层液为由聚蔗糖和/或泛影葡胺配制成的密度为1.074-1.076g/ml的水溶液，
所述细胞纯化液为由聚蔗糖配制成的密度为1.090-1.095g/ml的水溶液。
优选地，所述细胞分层液中聚蔗糖和泛影葡胺的质量比为0.8:1。
优选地，所述细胞稀释液为0.85-0.95重量％氯化钠水溶液，更优选所述细胞稀释液为0.9重量％氯化钠水溶液。
优选地，所述细胞沉淀剂为5-7重量％的羟乙基淀粉水溶液，更优选所述细胞沉淀剂为6重量％的羟乙基淀粉水溶液。
优选地，所述脐带血样品与细胞稀释液的体积比为0.8:1-1.2:1，更优选所述脐带血样品与细胞稀释剂的体积比为1:1。
优选地，所述沉降的时间为5分钟至3小时。
优选地，所述沉淀步骤中的离心浓缩的转速为2000-3000转/分，离心时间为3-20分钟。
优选地，所述分层步骤中的离心浓缩的转速为1800-2200转/分，离心时间为15-25分钟。
优选地，所述纯化步骤中的离心转速为1500-2000转/分，离心时间为30-45分钟。
本发明的另一方面还提供了脐带血干细胞的分离试剂盒，其包括：
细胞稀释液、沉淀剂、细胞分层液和细胞纯化液；其中，所述细胞稀释液为PBS液或0.8-1.0重量％氯化钠水溶液，所述细胞沉淀剂为4-10重量％的羟乙基淀粉水溶液，所述细胞分层液为由聚蔗糖和/或泛影葡胺配制成的密度为1.074-1.076g/ml的水溶液，所述细胞纯化液为由聚蔗糖配制成的密度为1.090-1.095g/ml的水溶液。
作为优选地，其中所述的细胞分层液和/或细胞纯化液包含腺嘌呤。
和其他方法相比，采用本发明提供的方法从脐带血中分离出的干细胞中含有的造血干细胞的比例更高，且含有的杂质细胞数更少，即纯度更高，更容易在临床特别是在干细胞治疗上应用。
具体实施方式
通过解释以下本申请的优选实施方案，本发明的目的和优点将变得清楚。
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。另外，对于本公开中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
本发明中，所述的"脐带血"是指哺乳动物(例如，人类)胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。在一个实施方案中，胎盘和脐带可从动物体分离后经冷冻保存。在另一实施方案中，胎盘和脐带为从动物体分离的新鲜胎盘和脐带。优选地，胎盘和脐带为从动物例如人体分离后1-12小时，优选1-5小时之内的胎盘和脐带。新鲜的胎盘和脐带具有更多高活性的干细胞。因此，本发明的脐带血优选为新鲜胎盘和脐带中的血液。另外，为了抗凝的目的，本发明的脐带血也可包含枸橼酸钠和/或肝素。
本发明中，所述术语"有核细胞"是指通过分层液分离得到的不同细胞的组合，其中绝大部分细胞均为具有这完整细胞核的细胞，它们的密度范围在1.083-1.100g/ml之间。本发明人进一步研究发现，这些有核细胞中可以进一步细分出"有效干细胞"和"杂质细胞"。关于两类细胞如下所述。
其中"有效干细胞"是指对于干细胞治疗有效的细胞的简称。通常，此类细胞中含丰富的造血干细胞(HSCs).的标志物，即CD34(细胞表面的唾液粘蛋白)。此前的研究发现，从骨髓和外周血来源的CD34阳性富集的细胞群体显出大部分的造血活性，被认为是造血干细胞(HSCs).的标志物。CD34在原始细胞分化为成熟细胞后表达下降。这点也发现存在于克隆的祖细胞和一些细胞系的干细胞。因此，CD34可以作为本发明中有效干细胞活性的标识。
其次，"杂质细胞"是指功能受损的有核细胞以及刚开始或即将开始衰老的红细胞。通常情况下正常功能的红细胞具有更低的密度，在沉淀步骤中，这些正常红细胞会沉淀而分离，但刚开始或即将开始衰老的红细胞具有更高的密度，且在该过程中不沉淀而与有核细胞一样存在于中间云雾层中。本发明人发现，这些杂质细胞的密度比脐带血中有效干细胞略轻，通常为1.080左右。通过常规离心分离技术(例如，中国专利公布CN101638637A或CN102154201A中所述的技术)即使在低速、长时间条件下也很难将这些杂质细胞与有效干细胞分离开来。
本发明中，术语"细胞稀释液"用于将脐带血样品进行稀释，从而获得所需浓度或密度的血液样品。优选地，细胞稀释液为0.85-0.95重量％，例如，0.89重量％、0.92重量％、0.95重量％、0.98重量％的氯化钠水溶液，更优选所述细胞稀释液为0.9重量％氯化钠水溶液，此溶液有时也称作生理盐水。
本发明中，所述术语"沉淀剂"为本领域内通常使的物质，例如羟乙基淀粉及其等同物质的水溶液，关于羟乙基淀粉的浓度优选为4-10重量％，更优选为5-7重量％，进一步优选为6重量％。羟乙基淀粉可以直接在市场购买所得。沉淀剂的作用为结合红细胞，使其重量增加，沉淀到细胞培养器皿的底部。
本发明中，所述术语"细胞分层液"为密度在1.074-1.076g/ml范围内的水溶液，优选地，其由聚蔗糖和/或泛影葡胺配制而成，优选密度为1.074g/ml、1.075g/ml，其中聚蔗糖和泛影葡胺的质量比可以是任意的，只要能够实现本发明所述的密度即可。优选地，聚蔗糖和泛影葡胺的质量比为0.8:1。所述细胞分层液能够利用各种细胞之间密度的差异来去除脐带血中的红细胞、血浆、血小板、血红蛋白、粒细胞等。在优选的实施方案中，所述细胞分层液进一步包含腺嘌呤。关于腺嘌呤的描述如下所述。
本发明中，所述术语"细胞纯化液"为1.090-1.095g/ml的聚蔗糖水溶液。需要说明的是此密度是必要的，如果密度过低，则在细胞纯化时，所需要的干细胞与杂质细胞在离心时沉降过快，即使在低于1000转/分的低速下离心难以将它们分开。另一方面，如果密度过高，则在低速旋转时有效干细胞与杂质细胞不能进行沉降，另外，由于沉降速率相似，致使在高速旋转时两种细胞不能有效分开。因此，聚蔗糖水溶液在密度在1.090-1.095g/ml范围内是必要的，优选的密度为1.091g/ml、1.092g/ml、1.093g/ml、1.094g/ml等。在优选的实施方案中，细胞纯化液还可包含腺嘌呤。关于腺嘌呤的描述如下所述。
本发明中，所述"腺嘌呤"是体内天然存在的一种物质，分子式C5H4N4。其可以嘌呤核苷酸的形式使用。腺嘌呤的含量基于细胞分层液或细胞纯化液的质量为0.5-2重量％。优选的含量为0.8-1.8重量％，更优选1.0-1.5重量％，进一步优选1.2-1.4重量％。本发明人发现在本发明的细胞分层液或细胞纯化液中添加上述含量的腺嘌呤能够更有效地保护得到的干细胞。其原因并不清楚，但是一种可能的原因在于在细胞呼吸中，腺嘌呤是富与能量的腺苷三磷酸(ATP)，与辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等形式发生作用，并且在蛋白质生物合成过程中作为DNA与RNA的组成物。过高或过低的腺嘌呤的含量的保护作用均是不利的。
本发明中，所述纯化步骤中的离心转速需要为1500-2000转/分，且离心时间为30-45分钟。例如，离心转速需要为1800转/分，且离心时间为35分钟；离心转速需要为2000转/分，且离心时间为30分钟等。需要说明的是，由于杂质细胞与有效干细胞之间的密度差异非常小，因此保持转速与时间之间的协同配合至关重要。转速过快或过慢，或者时间过长或过短都不能有效的将杂质细胞与有效干细胞进行很好的分离。优选地，离心转速为1600-1800转/分，且离心时间为32-40分钟。更优选离心转速为1800转/分，且离心时间为35分钟。
本发明的方法中，所述稀释步骤为将脐带血样品与细胞稀释液混合，然后加入沉淀剂，并静置沉降以得到含有干细胞的上层细胞液，其中所述混合可以是将脐带血样品添加到放置细胞稀释液的容器中，也可以是将细胞稀释液添加到放置脐带血样品的容器中，还可以是其他已知的混合方式；接触时通常需要在较为温和的条件下进行，例如，在温度能够使细胞存活的各种温度，优选25℃-38℃，例如37℃，或在轻轻搅拌的条件下进行等。
本发明的方法中，所述沉淀步骤为将适量的沉淀剂添加到含有脐带血样品和细胞稀释液的容器中，容器可以是试管，也可以是其他常用的器皿。
本发明所述的脐带血干细胞的分离试剂盒中，细胞稀释液、沉淀剂、细胞分层液和细胞纯化液优选以独立存在方式配置。例如，分别将细胞稀释液、沉淀剂、细胞分层液和细胞纯化液放置于不同的容器中，或者同一容器中独立存在的空间内。
本发明的试剂盒可进一步包含其他试剂或成分或装置。例如，用于移动液体的装置，例如吸液器等。这些其他试剂或成分或装置是本领域技术人员已知的，并且可通过公开出版物容易地获知。
优选地，本发明中的试剂盒还进一步包含使用说明书，其中在使用说明书中给出或教导了实施本发明所述方法或使用本发明所述试剂盒的指导、指引或教导。
实施例1
首先，将含有枸橼酸钠的50ml脐带血样品与50ml 0.9重量％氯化钠水溶液混合形成混合液。
然后在上述混合液中加入6重量％的羟乙基淀粉水溶液并静置沉降1小时以得到含有干细胞的上层细胞液，将所述含有干细胞的上层细胞液以2500转/分离心10分钟，得到细胞沉淀。将所述细胞沉淀铺在由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.075g/ml的水溶液上进行离心，其中聚蔗糖和泛影葡胺的质量为0.8:1。然后以2000转/分离心20分钟，得到中间云雾状干细胞层。取中间干细胞层，平铺于另一试管的密度为1.092g/ml的聚蔗糖水溶液之上，以1700转/分的离心转速离心35分钟，得到上下两条细胞带，取下方细胞带分离，即为本发明所述的有效细胞。其中细胞情况如表1所示。
实施例2
除了在细胞纯化液中加入1％的腺嘌呤以外，以与实施例1相同的方式制备有效细胞。所含细胞情况如表1所示。
作为对照，将含有枸橼酸钠抗凝液的50ml脐带血，按照中国专利公布CN101638637A实施例1所提供的方法，进行分离，即可得到含有干细胞的沉淀物，其中所含细胞如表1所示。
表1：本发明所述方法及现有技术分离出的干细胞情况对比
注：
采用流式细胞仪检测CD34细胞的数量、分离后总细胞的数量以及无核细胞或核受损细胞总数；
回收率＝分离后CD34细胞数/分离前CD34细胞数×100％；
纯度＝分离后CD34细胞数/分离后总细胞数×100％。
从表1可以看出，针对脐带血样品，与对照组相比，采用本发明提供的分离方法获得的含有干细胞的沉淀物中的细胞总数虽然只有对照组中细胞总数的25-35％左右，但是其中有效干细胞的回收率几乎没有变化，并且重要的是纯度大大提高，达到7.4％以上。
实施例3
首先，将含有枸橼酸钠的30ml脐带血样品与35ml PBS液混合形成混合液。
然后在上述混合液中加入6重量％的羟乙基淀粉水溶液并静置沉降1小时以得到含有干细胞的上层细胞液，将所述含有干细胞的上层细胞液以2600转/分离心10分钟，得到细胞沉淀。将所述细胞沉淀铺在由聚蔗糖配制成的密度为1.075g/ml的水溶液上进行离心，其中聚蔗糖和泛影葡胺的质量为0.85:1。然后以2000转/分离心20分钟，得到中间云雾状干细胞层。取中间干细胞层，平铺于另一试管的密度为1.092g/ml的聚蔗糖水溶液之上，以1800转/分的离心转速离心32分钟，得到上下两条细胞带，取下方细胞带分离，即为本发明所述的有效细胞。其中细胞情况如表2所示。
实施例4
除了在细胞纯化液中加入0.8％的腺嘌呤以外，以与实施例3相同的方式制备有效细胞。所是细胞情况如表2所示。
作为对照，将含有枸橼酸钠抗凝液的30ml脐带血，按照专利CN101638637A提供的分离试剂盒及使用方法，进行分离，即可得到含有干细胞的沉淀物，其中所含细胞数量如表2所示。
表2：本发明所述方法及现有技术分离出的干细胞情况对比
注：
采用流式细胞仪检测CD34细胞的数量、分离后总细胞的数量以及无核细胞或核受损细胞总数；
回收率＝分离后CD34细胞数/分离前CD34细胞数×100％；
纯度＝分离后CD34细胞数/分离后总细胞数×100％。
从表2可以看出，针对脐带血样品，与对照组相比，采用本发明提供的分离方法获得的含有干细胞的沉淀物中的细胞总数虽然只有对照组中细胞总数的25-30％左右，但是其中有效干细胞的回收率几乎没有变化，并且重要的是纯度大大提高，达到9.6％以上。
实施例5
首先，将含有枸橼酸钠的50ml脐带血样品与45ml 0.9重量％氯化钠水溶液混合形成混合液。
然后在上述混合液中加入6重量％的羟乙基淀粉水溶液并静置沉降1小时以得到含有干细胞的上层细胞液，将所述含有干细胞的上层细胞液以2500转/分离心10分钟，得到细胞沉淀。将所述细胞沉淀铺在由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.074g/ml的水溶液上进行离心，其中聚蔗糖和泛影葡胺的质量为0.75:1。然后以2000转/分离心20分钟，得到中间云雾状干细胞层。取中间干细胞层，平铺于另一试管的密度为1.095g/ml的聚蔗糖水溶液之上，以1900转/分的离心转速离心31分钟，得到上下两条细胞带，取下方细胞带分离，即为本发明所述的有效细胞。其中细胞情况如表3所示。
实施例6
除了在细胞纯化液中加入1.5％的腺嘌呤以外，以与实施例5相同的方式制备有效细胞。所是细胞情况如表3所示。
作为对照，将含有枸橼酸钠抗凝液的50ml脐带血，按照专利CN101638637A提供的分离试剂盒及使用方法，进行分离，即可得到含有干细胞的沉淀物，其中所含细胞数量如表3所示。
表3：本发明所述方法及现有技术分离出的干细胞情况对比
注：
采用流式细胞仪检测CD34细胞的数量、分离后总细胞的数量以及无核细胞或核受损细胞总数；
回收率＝分离后CD34细胞数/分离前CD34细胞数×100％；
纯度＝分离后CD34细胞数/分离后总细胞数×100％。
实施例7
试剂盒组成：
首先分别配置以下成分：
细胞稀释液：取4.5g氯化钠，加入适量水溶解，再加水稀释至500ml，混合均匀，备用；
沉淀剂：6％(重量)羟乙基淀粉(市场购买)水溶液；
细胞分层液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.075g/ml的水溶液，其中聚蔗糖和泛影葡胺的质量为1:1；
细胞纯化液：由聚蔗糖和腺嘌呤配制成的密度为1.093g/ml的水溶液，其中腺嘌呤的质量分数为1％。
将上述细胞稀释剂、沉淀剂、细胞分层液及细胞纯化液经过115℃，20分钟灭菌处理，检测其内毒素含量≤0.5EU/ml，装瓶。
首先，将含有枸橼酸钠的50ml脐带血样品与50ml上述细胞稀释液混合形成混合液。
然后在上述混合液中加入上述沉淀剂并静置沉降1小时以得到含有干细胞的上层细胞液，将所述含有干细胞的上层细胞液以2500转/分离心10分钟，得到细胞沉淀。将所述细胞沉淀铺在上述细胞分层液上进行离心。然后以2500转/分离心20分钟，得到中间云雾状干细胞层。取中间干细胞层，平铺于另一试管的细胞纯化液之上，以2000转/分的离心转速离心30分钟，得到上下两条细胞带，取下方细胞带分离，即为本发明所述的有效细胞。其中细胞情况如表3所示。
从表3可以看出，针对脐带血样品，与对照组相比，采用本发明提供的分离方法和分离试剂盒获得的含有干细胞的沉淀物中的细胞总数虽然只有对照组中细胞总数的25-33％左右，但是其中有效干细胞的回收率几乎没有变化，并且重要的是纯度大大提高，达到7.9％。
参考本申请的优选技术方案详细描述了本申请的生物材料去细胞洗脱装置，然而，需要说明的是，在不脱离本申请的精神的情况下，本领域技术人员可在上述公开内容的基础上做出任何改造、修饰以及变动。本申请包括上述具体实施方案及其任何等同形式。