一种产丁二酸大肠杆菌的构建方法及其应用与流程

本发明涉及生物化工领域，更具体的，本发明涉及一种能增强丁二酸分泌能力的产丁二酸大肠杆菌的构建方法及应用。

背景技术：

丁二酸又称琥珀酸，是重要的C4平台化合物，被广泛应用于医药、香料、油漆、染料、食品等行业，将其作为前体可合成四氢呋喃、γ-丁内酯、1，4-丁二醇等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯类生物可降解材料。此外，丁二酸还用于生产抗生素、氨基酸及维生素等利于人类健康的中间体，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一，市场需求量保持在10％以上的年增长率。

目前丁二酸主要由石化合成或微生物发酵制备。相比于化学合成，微生物发酵制备具有原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO₂，能有效缓解温室效应，故成为近年来研究的热点。

构建获得具有优良丁二酸生产性能的发酵菌株是实现生物法高效制备丁二酸的关键之一。目前的研究热点主要集中在产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)，产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimiasucciniciproducens)，重组大肠杆菌(Escherichia coli)及重组谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)等。其中野生型菌株虽具有较高的丁二酸生产能力，但培养过程中对氮源的要求较高，且过程中产生大量的副产物如甲酸、乙酸等，阻碍了其工业化应用。而重组大肠杆菌由于遗传背景清楚，基因工程改造易行且培养基要求简单等优点，近年来被广泛用于研究以获得高产丁二酸生产菌株。

当利用E.coli两阶段发酵产琥珀酸过程中，在厌氧阶段结束时，去除发酵液中的产物(主要是琥珀酸)，将细胞转入新鲜培养基中，从而使细胞处于较低的，渗透压和离子强度条件下，细胞能够再次生长，并在厌氧条件下发酵生产琥珀酸。可见发酵后期大肠杆菌自身转运丁二酸的能力受限，因此，如何提高菌株抗逆性能及转运羧酸能力，显得尤为重要。

本发明通过在大肠杆菌中异源表达来自于谷氨酸棒状杆菌的转运蛋白(Gene ID:1020162)，强化菌株对胞内的丁二酸产物的转运能力，减少胞内丁二酸的积累，且可解除产物抑制，进一步提高菌株丁二酸的生产能力。目前，虽然有相关报道表明可通过强化菌株转运能力提高丁二酸产量，但是筛选获得合适的转运蛋白仍是难点且报道较少。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种能增强丁二酸分泌能力的重组大肠杆菌构建方法，通过提高菌株羧酸转运能力，同时解除产物抑制，达到提高丁二酸产量的目的。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

以缺乏乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因活性且磷酸转移酶系统的ptsG染色体发生自发突变的大肠杆菌为出发菌株，构建含有谷氨酸棒状杆菌NCgl2130基因(Gene ID:1020162)的重组大肠杆菌。

优选的，所述出发菌株选用E.coliAFP111。

本发明的技术方案具体可采用如下步骤实现：

(1)将谷氨酸棒状杆菌NCgl2130基因克隆到pTrc99a质粒上，得到重组质粒；

(2)将重组质粒pTrc99a-NCgl2130转化入出发菌株中，即得到大肠杆菌重组菌。

具体的，上述(1)中重组质粒采用如下方式构建：

(1)以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，利用PCR扩增体系扩增NCgl2130基因片段，PCR产物片段回收：

(2)利用双酶切体系，双酶切pTrc99a质粒和PCR回收片段，酶切产物经电泳后回收双酶切的质粒及基因片段，利用T4连接体系，将前述经双酶切的质粒和基因片段连接；其中，酶切位点为Hind III和Xba I；

(3)将连接产物利用CaCl₂转化法转化至E.coli DH5α，挑取阳性克隆做菌落PCR验证，将正确的阳性克隆培养后提取重组质粒。

本发明的另一目的在于提供上述方法构建的重组菌株。

本发明的又一目的在于提供上述方法构建的重组菌株在丁二酸生产中的应用。

本发明采用厌氧摇瓶或发酵罐发酵重组大肠杆菌生产丁二酸，其中厌氧摇瓶采用一步厌氧发酵法；发酵罐采用二阶段发酵法，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。

重组菌进行厌氧摇瓶发酵条件优化，出发菌做空白对照，具体步骤为：

(1)厌氧发酵温度条件优化：重组菌活化培养后，转厌氧摇瓶发酵，厌氧摇瓶按照20℃、25℃、30℃、35℃、40℃五个温度梯度，转速200r/min，发酵时间为48h进行同批次发酵，每个条件做三个平行实验，出发菌做空白对照；

(2)厌氧发酵诱导剂浓度优化：重组菌活化培养后，转厌氧摇瓶发酵，厌氧摇瓶按照0、0.1、0.3、0.5mmol/L四种诱导剂浓度梯度，转速200r/min，发酵时间为48h进行同批次发酵；每个条件做三个平行实验，出发菌做空白对照；

结果表明，厌氧摇瓶发酵最优条件为：温度30℃，IPTG浓度0.1mmol/L，转速200r/min，发酵时间48h。此条件下，重组菌DCW 1.77g/L，耗糖21g/L，产丁二酸17.65g/L；而出发菌DCW 1.37g/L，耗糖17g/L，产丁二酸14.10g/L；相对于出发菌株，丁二酸产量提高25.2％(注:数值均为三个平行样的平均值)。

重组菌进行3L发酵罐放大实验，出发菌做空白对照，采用二阶段发酵法的具体步骤如下：

(1)平板活化，种子培养；

(2)发酵生产丁二酸：将摇瓶培养的种子液全部接入装有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，接种量10％(v/v)，接种后一次性补加葡萄糖至30g/L，用20％质量分数的碳酸钠调pH维持在6.8左右，转速200r/min，37℃下有氧培养长菌体，当OD长到0.6左右，加入诱导剂(0.1mmol/L)，并将温度控制在30℃进行有氧诱导。当糖耗尽后，补加葡萄糖至30g/L，200r/min，pH＝6.8，温度30℃进行厌氧发酵。若糖耗尽，继续一次性补加葡萄糖至30g/L，进行厌氧发酵，直至不再耗糖为止；

结果表明，重组菌DCW 3.88g/L，耗糖70g/L，产丁二酸58.5g/L；而出发菌DCW 3.77g/L，耗糖60g/L，产丁二酸50.5g/L；相对于出发菌株，丁二酸产量提高15.8％。

本发明通过异源表达来自于由谷氨酸棒状杆菌的转运蛋白(SucE)，构建了一株丁二酸分泌能力明显增强的重组大肠杆菌；通过厌氧发酵条件的优化及3L发酵罐放大实验可知，该重组菌对丁二酸的分泌能力明显提高，整个过程菌体生长、耗糖及丁二酸生产能力明显增强。该研究为强化大肠杆菌转运丁二酸能力提供了一个新的优良转运蛋白，为强化丁二酸分泌性能提供了一种新途径。

附图说明

图1是扩增出的基因NCgl2130的电泳条带；图中M：5kb marker；

图2是重组菌DH5α菌落PCR的电泳条带；图中M：5kb marker；

图3是重组菌AFP11质粒单双酶切验证的电泳条带；图中M1:5kb marker；M2:10kb marker；1、2泳道经Hind III和Xba I酶切，3、4泳道经Hind III酶切；

图4是重组菌表达目的蛋白的蛋白胶验证条带；

图5是3L发酵罐放大实验发酵结果。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。

实施例中选用的出发菌株大肠杆菌AFP111来源：

Applied and environmental microbiology,2001,67(1):148-154.申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处，并联系了发表人系美国芝加哥大学的David P.Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材料，并免费获得了该生物材料；且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料。

实施例1：

本实施例中，重组大肠杆菌构建的具体方法如下:

以谷氨酸棒状杆菌CorynebacteriumglutamicumATCC13032基因组为模板，扩增谷氨酸棒状杆菌NCgl2130基因片段。

其中上游引物序列：

5-GCTCTAGAGAACGTGCCCAGTTCCACATCAAATAACGC-3

下游引物序列：

5-CCCAAGCTTTGCCGAGAAGTTGAACAGCAATCTTGCAG-3

PCR扩增体系为：谷氨酸棒状杆菌基因组模板(不少于200ng)1μL，引物上游Primer 1和下游Primer 2各1μL，dNTP 4μL，5×Primer star缓冲液10μL，Primer star聚合酶0.5μL，ddH₂O 32.5μL。

PCR反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性45s；然后57℃退火45s，72℃延伸2min，循环30次；72℃延伸10min。

PCR产物进行PAGE实验，将正确的扩增条带(图1)按照柱式割胶回收试剂盒回收。

双酶切体系为：10×缓冲液5μL，Hind III 1μL，Xba I 1μL，底物(环状质粒或目的基因)10μL，ddH₂O 33μL，总体积50μL；对质粒pTrc99a和目的基因NCgl2130分别按照50μL双酶切体系进行酶切。

双酶切产物进行PAGE实验，用柱式割胶回收试剂盒回收，经胶回收的目的基因片段和质粒进行连接。

连接反应体系为：T4ligase 10×Buffer 2μL，酶切质粒(50ng左右)2μL，基因片段(200ng左右)5μL，T4ligase 0.5μL，ddH₂O10.5μL，总体积20μL。连接得到重组质粒pTrc99a-NCgl2130。

转化感受态细胞实验：取2μL重组质粒pTrc99a-NCgl2130加入制备好的200μLDH5α感受态细胞中，用手指轻弹均匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，快速置于冰上2min后，再加入1mL新鲜的SOC培养液，于37℃，200r/min振荡培养1h，取上述培养菌液100μL涂布于含抗性(氯霉素，卡那霉素，氨苄霉素)LB固体培养基表面，放37℃培养箱中培养12h；菌落PCR并进行电泳鉴定(图2)，筛选出正确的阳性克隆；将验证正确的阳性克隆接种于含抗性(氯霉素，卡那霉素，氨苄霉素)LB试管中培养并提取重组质粒，再按照同样的转化法将提取的重组质粒转化入AFP111感受态细胞中，筛选阳性克隆即培养后提取重组质粒进行单双酶切，酶切产物进行PAGE鉴定(图3)；通过鉴定，成功筛选出含重组质粒的阳性克隆，最后对该单克隆菌落进行保种并放-80℃冰箱保藏。

实施例2：

本实施例中，重组大肠杆菌膜蛋白提取的具体方法如下：

平板培养：将实施例1获取的重组菌接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为37℃，培养时间为12h；

种子培养：将平板培养的重组菌接种到试管种子培养基中，装液量为5mL，培养温度为37℃，转速200r/min，培养时间为14h；

有氧诱导：将试管培养的重组菌接种到500mL摇瓶中，装液量为100mL，接种量1％(v/v)，诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浓度为0.5mmol/L，诱导温度为37℃，转速200r/min，培养时间8h；

膜蛋白提取：按照膜蛋白提取试剂盒(生工Sangon Biotech)提供的方法，提取膜蛋白并进行SDS-PAGE实验(图4)，凝胶成像仪观察电泳条带，出发菌做空白对照。结果表明，重组菌的膜蛋白提取液跑出60kDa的蛋白条带，而对照菌没有，可见，重组菌能够成功表达出目的蛋白；

平板培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L；

种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L。

实施例3：

本实施例中，重组菌厌氧发酵温度条件优化的具体方法如下：

平板培养：将实施例1获取的重组菌接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为37℃，培养时间为12h；

种子培养：将平板培养的重组菌接种到试管种子培养基中，装液量为5mL，培养温度为37℃，转速200r/min，培养时间为14h；再将试管培养的重组菌接种到500mL摇瓶中，装液量为100mL，接种量1％(v/v)，培养温度为37℃，转速200r/min，培养时间8h；

厌氧发酵：将种子培养液接种到100mL厌氧摇瓶发酵培养基中，装液量为30mL，接种量10％(v/v)，碱式碳酸镁0.72g作为pH调节剂，初始葡萄糖30g/L，向培养基中加入诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浓度为0.1mmol/L，充二氧化碳2min；转速200r/min，温度按照20℃、25℃、30℃、35℃、40℃五个梯度，发酵时间为48h；每个条件做三个平行实验；

平板培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L；

种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L；

发酵培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，诱导剂0.1mmol/L，葡萄糖30g/L，碱式碳酸镁24g/L。

重组菌厌氧发酵温度优化的结果如表1所示：

表1重组菌厌氧发酵温度的优化

发酵结果表明，厌氧摇瓶发酵最优温度为30℃，在此温度条件下，重组菌DCW 1.67g/L，耗糖20g/L，产丁二酸15.65g/L，收率为78.3％(注:数值均为三个平行样的平均值)。

实施例4：

本实施例中，重组菌厌氧发酵诱导剂浓度优化的具体方法如下：

平板培养：将重组菌接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为37℃，培养时间为12h；

种子培养：将平板培养的重组菌接种到试管种子培养基中，装液量为5mL，培养温度为37℃，转速200r/min，培养时间为14h；再将试管培养的重组菌接种到500mL摇瓶中，装液量为100mL，接种量1％(v/v)，培养温度为37℃，转速200r/min，培养时间8h；

厌氧发酵：将种子培养液接种到100mL厌氧摇瓶发酵培养基中，装液量为30mL，接种量10％(v/v)，碱式碳酸镁0.72g作为pH调节剂，初始葡萄糖30g/L，温度30℃，充二氧化碳2min；转速200r/min，诱导剂IPTG浓度按照0，0.1，0.3，0.5mmol/L四个浓度梯度，发酵时间为48h；每个条件做三个平行实验；

平板培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L；

种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L；

发酵培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，诱导剂0.1mmol/L，葡萄糖30g/L，碱式碳酸镁24g/L。

重组菌厌氧发酵诱导剂浓度优化的结果如表2所示：

表2重组菌厌氧发酵诱导剂浓度的优化

发酵结果表明，厌氧摇瓶发酵最优诱导剂浓度为0.1mmol/L，在此诱导剂浓度下，重组菌DCW 1.79g/L，耗糖22g/L，产丁二酸17.66g/L，收率为80.3％(注：数值均为三个平行样的平均值)。

实施例5：

本实施例中，重组菌厌氧摇瓶发酵(其中出发菌做空白对照)的具体方法如下：

平板培养：将重组菌接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为37℃，培养时间为12h；

种子培养：将平板培养的重组菌接种到试管种子培养基中，装液量为5mL，培养温度为37℃，转速200r/min，培养时间为14h；再将试管培养的重组菌接种到500mL摇瓶中，装液量为100mL，接种量1％(v/v)，培养温度为37℃，转速200r/min，培养时间8h；

厌氧发酵：将种子培养液接种到100mL厌氧摇瓶发酵培养基中，装液量为30mL，接种量10％(v/v)，碱式碳酸镁0.72g作为pH调节剂，初始葡萄糖30g/L，向培养基中加入诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浓度为0.1mmol/L，充二氧化碳2min；诱导温度为30℃，转速200r/min，发酵时间为48h；出发菌做空白对照；

平板培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L；

种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L；

发酵培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，诱导剂0.1mmol/L，葡萄糖30g/L，碱式碳酸镁24g/L。

菌株厌氧摇瓶发酵结果如下表3所示:

表3菌株厌氧摇瓶发酵结果

发酵结果表明，重组菌DCW 1.77g/L，耗糖21g/L，产丁二酸17.65g/L；而出发菌DCW1.37g/L，耗糖17g/L，产丁二酸14.10g/L；相对于出发菌株，丁二酸产量提高25.2％(注:数值均为三个平行样的平均值)。

实施例6：

本实施例中，重组菌3L发酵罐放大实验(出发菌做空白对照)，并采用二阶段发酵法的具体步骤如下：

平板培养：将重组菌接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为37℃，培养时间为12h；

种子培养：将平板培养的重组菌接种到试管种子培养基中，装液量为5mL，培养温度为37℃，转速200r/min，培养时间为14h；再将试管培养的重组菌接种到500mL摇瓶中，装液量为100mL，接种量1％(v/v)，培养温度为37℃，转速200r/min，培养时间8h；

厌氧发酵：将摇瓶培养的种子液全部接入装有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，接种量10％(v/v)，接种后一次性补加葡萄糖至30g/L，用20％质量分数的碳酸钠调pH维持在6.8左右，转速200r/min，37℃下有氧培养长菌体，当OD长到0.6左右时，加入诱导剂IPTG(终浓度0.1mmol/L)，并控制温度30℃有氧诱导。当糖耗尽后，再次补加葡萄糖至30g/L，并转接厌氧进行发酵，温度37℃，200r/min，pH＝6.8。若糖耗尽，继续一次性补加葡萄糖至30g/L，进行厌氧发酵，直至不再耗糖为止；其中出发菌做空白对照。

平板培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L；

种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L；

发酵培养基配方为：Citric Acid 3g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 4g/L，KH₂PO₄8g/L，(NH₄)₂HPO₄8g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，(NH4)₂SO₄0.75g/L，NH₄Cl 0.2g/L，CaCl₂·2H₂O 10mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.5mg/L，CuCl₂·2H₂O 0.25mg/L，MnSO₄·H₂O 2.5mg/L，CoCl₂·6H₂O 1.75mg/L，H₃BO₃0.12mg/L，Al₂(SO₄)₃1.77mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/L，Fe(III)citrate16.1mg/L；VB₁20mg/L(单独灭菌加入)，Biotin 2mg/L(单独灭菌加入)，121℃高压灭菌15分钟。菌株3L发酵罐放大实验发酵结果如图5所示。

图中，DCW 1，Glucose 1，Succinate 1为出发菌株AFP111发酵数据；DCW 2，Glucose 2，Succinate 2为重组菌株AFP111/pTrc99a-NCgl2130发酵数据。

发酵结果表明，重组菌DCW 3.88g/L，耗糖70g/L，产丁二酸58.5g/L；而出发菌DCW3.77g/L，耗糖60g/L，产丁二酸50.5g/L；相对于出发菌株，丁二酸产量提高15.8％。