专利名称：获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种从大肠杆菌中快速、经济、高效地获得克隆表达的可溶性斑马鱼肌酸激酶蛋白并验证的方法，为获得融合表达蛋白研究提供便利，具有广泛的科研价值和应用前景。
背景技术：
肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，是细菌的一种，由Escherich在1885年发现。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。肌酸激酶(Creatine Kinase, CK) (ATP -Creatine N-phosphotransferase EC 2. 7. 3. 2)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，可作为研究蛋白质折叠的理想模型。肌酸激酶是心肌梗塞和骨骼肌疾病等的临床诊断方面的一个重要指标。斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼(Brachydanio rerio)，原产于印度、孟加拉国。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，其基因与人类87%相似，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分子机制的优良资源， 有的还可做为人类疾病模型。斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一， 在其它学科上的利用也显示很大的潜力。目前，常用的破碎大肠杆菌获得目的蛋白的方法有超声破碎、玻璃珠破碎等机械法，干燥法、冻融法等物理法、化学试剂处理、酶解法等化学方法。传统的冻融法是在_20°C以下，而且所适用于动物性材料，对微生物作用较差。传统的酶解法一个是浓度的问题，浓度一般为300μ g/mL-lmg/ml，浓度太高，容易造成产物抑制作用；此外含量过高在镍柱纯化时候容易堵塞柱子，给进一步纯化带来困难。此外，溶菌酶的处理时间均需要Ih以上，不同的菌种需选择不同的酶，不适宜大量方便快捷蛋白质提取。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速、经济、高效地破碎大肠杆菌获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法，采用该方法能有效获得高质量且含量高的总蛋白，包括目的蛋白。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法，依次包括以下步骤1)、在导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液中加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至 IPTG的终浓度0. 9 1. ImM ；220rpm、36. 5 37. 5°C培养摇床振荡继续培养4. 5 5. 5小时；所述菌液的OD6tltlnm 为 0. 4 0. 6 ；OD是optical density (光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度， nanodrop仪器检测；2)、将步骤1)的所得菌液先于IlOOOg 13000g离心9 llmin，弃上清，所得的沉淀中先加入PBS重悬，重悬后再加入溶菌酶，使溶菌酶的终浓度为180 220 μ g/mL ；3)、先将上述步骤的所得物于36. 5 37. 5°C处理8 12min，然后于液氮中冰冻 38 42秒；再于室温中自然解冻至液态；4)、重复上述步骤3) 2次；5)、将步骤4)的所得物先于IlOOOg 13000g离心9 llmin，取上清，所述上清
中含有可溶性的斑马鱼肌酸激酶融合蛋白。作为本发明的获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法的改进步骤1)为在导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液加入IPTG至IPTG的终浓度ImM; 220rpm、37°C培养摇床振荡继续培养5小时；步骤2)为使溶菌酶的终浓度为200 μ g/mL ；步骤幻为先将上述步骤的所得物于37°C处理lOmin，然后于液氮中冰冻40秒； 再于室温中自然解冻至液态。在步骤2)中，每Iml的步骤1)的所得菌液配用80 120 μ L的PBS (即PBS缓冲液)。采用本发明的方法破碎大肠杆菌后，通过离心、加热等预处理方法，从而获得蛋白，并进行验证。本发明通过实验方法得出以下结论，证明了加溶菌酶处理后液氮反复冻融具有良好的效果，操作简便，可大规模使用，获得克隆表达的肌酸激酶蛋白。本发明的有益效果(1)本发明优化得到一系列高效的破碎大肠杆菌的方法，解决了超声波破碎体积小的问题；同时操作起来方便快速，比纯粹的反复冻融效果佳，此外更溶于获得目的蛋白。(2)通过SDS-PAGE检测破碎后的细胞总蛋白，该方法获得的目的蛋白，溶于上清，可能是活性蛋白，减少包涵体蛋白变性复性过程的损失，为直接纯化、活性的检测等进一步实验提供实验材料。(3)采用加溶菌酶处理后液氮反复冻融方法破碎大肠杆菌，获得总蛋白方法，使用量较少的酶，相比传统的酶的方法经济，且可用于大规模的生产， 此外在处理后液氮环境下反复冻融，操作简单，快速，能够短时间处理大批量的样本，在节省成本和时间的同时获得目的蛋白。综上所述，本发明所建立的快速、经济、高效破碎大肠杆菌获得目的蛋白并通过 SDS-PAGE验证的方法，数据可靠，具有广泛的科研价值和应用前景。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1为直接液氮环境下反复冻融和加了溶菌酶反复冻融的上清和沉淀SDS-PAGE 分析图的一部分；图2为直接液氮环境下反复冻融和加了溶菌酶反复冻融的上清和沉淀SDS-PAGE 分析图的另一部分；图1和图2中7到12为液氮反复冻融三次，不加溶菌酶的上清，15和16分别是其7和10的沉淀。1到6为液氮反复冻融三次，溶菌酶终浓度为200 μ g/mL的上清，13和14为其2和5 的沉淀。可看出加油溶菌酶获得蛋白含量明显多于没有加的，此外作者实验克隆表达的蛋白在47KD左右(m表示maker，第一条带(最下面为第一条带)为最小，分子量为14. 4KD， 第五条带为45KD)，加有溶菌酶的在沉淀和上清都有，没有加的都在沉淀里面，其上清蛋白基本没有。图3超声波破碎后上清和沉淀图；图3中1、3为沉淀，2、4为上清，可见目的蛋白，但是只适合在小体积应用(m表示 maker，第一条带为最小，分子量为14. 4KD，第五条带为45KD)。图4为直接加溶菌酶处理后是SDS-PAGE检测图；图4中6和8为处理后上清，7和9为沉淀。可见上清中并没有目的条带，而沉淀处理后更难以分清，可见单独处理的效过并不佳。(m表示maker，第一条带为上图中maker 的五条带，大小为45KD)；图中的1为空白孔道，2到3为重复实验上清，4、5为沉淀。可见沉淀处理结果处理并不理想，沉淀电泳时更是陈现模糊状态，破碎效果不佳。因此，在此处理下，上清中并没有目的条带，沉淀电泳结果显示破碎处理效果并不佳。图5为west-blot检测克隆的蛋白，同全鱼提取的作为对照(如图中1_6所示，为全鱼提取的蛋白做west-blot检测，共提取6条鱼做的重复，显示条带为肌酸激酶蛋白)， 7-9为纯化后蛋白，验证克隆表达的为目的所需蛋白，因克隆表达纯化需要，克隆蛋白上有组氨酸标签，比全鱼提取大十几KD。(m为maker，图上第4条带大小为40KD，第5条带为 55KD)。
具体实施例方式以下实施例中使用的均为以构建好的表达菌种样本。实验试剂均为常用的分子生物学试剂，主要有IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)、溶菌酶，聚丙烯酰胺等常用试剂均购于上海生工公司。纯化镍柱购自北京中科院过程研究所， 一抗购自北京博奥森生物技术有限公司，二抗购自碧云天生物技术研究所。实施前处理操作(依次进行以下步骤)(1)提取斑马鱼totalRNA，根据下述设计的引物扩增斑马鱼ckmt2基因，引物的两端加入合适的双酶切酶切位点，对扩增后片段和质粒PETjSa同时进行双酶切、割胶回收等操作后16°C连接过夜，转化进大肠杆菌DH5 α感受态，在含kana终浓度为50 μ g/ml的固体LB培养基上涂板挑斑验证，提取质粒送上海生工测序，测序验证后进行第二次转化，转化进大肠杆菌BL21感受态，在含kana终浓度为50 μ g/ml的固体LB培养基上涂板挑斑验证，同样提取质粒送上海生工测序，比对结果后对已验证的菌种，在含有终浓度为50μ g/ml kana (卡那霉素)的LB固体培养基上划线涂板，37°C过夜。CKMT2Forward primer (弓 |物)CCGGATCCATGTTCAGTCGAGTGTCKMT2Reserve primer (弓 |物)ATTTGCGGCCGCTTTCTTGAACTGGGAC加的双酶切位点为Bam HI Not I。(2)、IPTG诱导蛋白表达，依次进行以下步骤①、从平板中挑取1环单菌落加入5mL含有50 μ g/ml kana的LB液体培养基中。②、放入37°C培养摇床振荡培养，220rpm培养过至OD6tltlnm为0. 5 (0D是optical density (光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，nanodrop仪器检测)。③、取50 μ L培养液(上述步骤②所得)加入5mL含有50 μ g/ml kana的LB培养基中。④、放入37°C培养摇床振荡培养，220rpm培养至OD6tltlnm为0. 5 (约2 3小时)。 得处理菌液。实施例1、一种快速、经济、高效地破碎大肠杆菌获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法，进行以下步骤1)、取上述处理菌液2. 5ml加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至IPTG的终浓度 ImM ；220rpm、37°C培养摇床振荡继续培养5小时，收集菌液。2)、取步骤1)所得的菌液lml，12000g离心lOmin，弃上清，所得的沉淀中加入 100 μ L PBS重悬，重悬后加入溶菌酶，使溶菌酶的终浓度为200 μ g/mL ；3)、先将上述步骤的所得物于37°C处理lOmin，然后于液氮中冰冻40秒；在室温中自然解冻至液态；4)、重复上述步骤3) 2次；5)、如上处理后，对步骤4)的所得物12000g离心5min，从而使样品上清和沉淀分开，吸取上清至新的离心管，沉淀中再加入IOOyL PBS重悬。分别加入2 X SDS-PAGE Loading buffer 100 μ L，混勻，沸水中煮 lOmin，后 12000rpm 离心 SDS-PAGE 检测。检测结果为如图1和图2中的1到6和13、14所示，1到6为上清，13、14为沉淀，可见在上清中出现高比例的目的蛋白。实施例2、一种破碎大肠杆菌获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法，将实施例1中步骤幻的预处理改成以下内容不加溶菌酶，其余同实施例1。结果如图1和图2的7-12，以及15、16，7_12为上清，15、16为沉淀，可见蛋白基本在沉淀中出现。对照例、一种破碎大肠杆菌获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法，将步骤幻的预处理改成以下内容将菌液超声波破碎15min，采用宁波新芝kientz-II D超声波破碎仪，功率950W，工作k后间歇3s，共处理15min ；其余同实施例1。结果如图3，沉淀中基本没有目的蛋白，在上清中目的蛋白含量较多，此方法结果能取得同样的效果，且时间较短，且操作简单，同时可大面积的操作。实施例3、一种破碎大肠杆菌获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法，取消步骤i)的离心，即，在步骤1)所得的菌液中直接加溶菌酶至终浓度为200 μ g/mL,然后进行步骤3)。结果如图4，6和8为处理后上清，7和9为沉淀。可见上清中并没有目的条带，而沉淀处理后更难以分清，可见单独处理的效过并不佳。实验=SDS-PAGE检测不同处理方法获得的蛋白，粗略比较上述四种方法获得的总蛋白含量和目的蛋白含量。镍柱纯化后用west-blot检测。本发明设计了一种新的从大肠杆菌中快速、经济、高效地获得克隆表达的可溶性斑马鱼肌酸激酶蛋白，操作起来简便，并不需要特别的仪器，对所有的实例图进行分析， bandscan5. 0 (条带分析软件)分析可溶性蛋白在总蛋白中的含量，发现能获得25%以上的可溶性蛋白，达到了并且超过了常规的超声波仪器破碎的效果，同时远远超过了其他处理。 但超声波仪器昂贵且破碎往往只适应于小体积操作，本发明能大体积操作且价格便宜，结果适合其他实验继续操作。具体如表1所示。表 权利要求
1.获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法，其特征是依次包括以下步骤1)、在导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液中加入IPTG至IPTG的终浓度为0.9 1.ImM ； 220rpm、36. 5 37. 5°C培养摇床振荡继续培养4. 5 5. 5小时；所述菌液的OD6tltlnm为0. 4 0. 6 ；2)、将步骤1)的所得菌液先于IlOOOg 13000g离心9 llmin，弃上清，所得的沉淀中先加入PBS重悬，重悬后再加入溶菌酶，使溶菌酶的终浓度为180 220 μ g/mL ；3)、先将上述步骤的所得物于36.5 37. 5°C处理8 12min，然后于液氮中冰冻38 42秒；再于室温中自然解冻至液态；4)、重复上述步骤；3)2次；5)、将步骤4)的所得物先于IlOOOg 13000g离心9 llmin，取上清，所述上清中含有可溶性的斑马鱼肌酸激酶融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法，其特征是所述步骤1)为在导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液加入IPTG至IPTG的终浓度ImM; 220rpm、37°C培养摇床振荡继续培养5小时；所述步骤2、为使溶菌酶的终浓度为200 μ g/mL ；所述步骤幻为先将上述步骤的所得物于37°C处理lOmin，然后于液氮中冰冻40秒； 再于室温中自然解冻至液态。
全文摘要
本发明公开了一种获得可溶性克隆表达的斑马鱼肌酸激酶蛋白方法，依次包括以下步骤1)、在导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液中加入IPTG至IPTG的终浓度为0.9～1.1mM；摇床培养；菌液的OD600nm为0.4～0.6；2)、将步骤1)的所得菌液先离心，弃上清，所得的沉淀中先加入PBS重悬，重悬后再加入溶菌酶，使溶菌酶的终浓度为180～220μg/mL；3)、先将上述步骤的所得物于36.5～37.5℃处理8～12min，然后于液氮中冰冻38～42秒；再于室温中自然解冻至液态；4)、重复上述步骤3)2次；5)、将步骤4)的所得物先离心，取上清，上清中含有可溶性的斑马鱼肌酸激酶融合蛋白。
文档编号C12N9/12GK102533690SQ201210035220
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者丁先锋, 赵铁军, 郭江峰, 马琴琴, 黄涵年 申请人:浙江理工大学