专利名称：辅助鉴定抗白粉病植物的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助鉴定抗白粉病植物的方法及其专用引物。
背景技术：
小麦是我国的重要粮食作物，与国家粮食安全、国民经济发展、社会稳定和人民生活水平的提高有着密切的关系。小麦白粉病是一种世界性的小麦病害。随着矮杆和半矮秆小麦品种的推广和水肥条件的改善，种植密度的加大，造成麦田郁闭，使得白粉病在我国造成的危害日益严重，发病面积和范围不断扩大，已由次要病害上升为主要病害，对我国的粮食生产及安全造成了严重威胁。选育并推广抗病品种已被公认为是防治小麦白粉病最为经济、有效和安全的途径，而选育抗病品种的关键在于不断发掘和有效利用新的抗源。培育含有多个抗白粉病基因的小麦品种是拓宽抗谱、提高抗性和维持抗性的有效途径之一。因此，发掘新的抗病基因及其紧密连锁的分子标记，及时开展新抗病基因的定位工作，对于分子辅助育种具有重要
眉、οSSR标记又称微卫星(Microsatellite)标记，是由一组1 6个核苷酸串联在一起的、重复次数介于5 10之间的简单重复序列。它们普遍存在于高等生物中，并随机分布于整个基因组中，由于其重复次数不同而形成DNA序列的多态性。每个SSR座位的两侧一般是相对保守的单拷贝序列，因此这种串联重复序列的多态性可以十分容易地通过两端的保守序列设计特异引物进行PCR扩增检测。SSR分子标记技术具有以下特点(1)位点多、数量丰富，覆盖整个染色体组；(2) 每个位点均有许多等位形式，多态性高；C3)多数是共显性标记，能够区分纯合及杂合基因型，从而提供单个位点上较完整的遗传信息；⑷对模板DNA的质量要求不高，DNA用量少， 易于利用PCR技术分析；(5)操作简单，结果重复性好；(6)多数SSR标记染色体位置已知， 可以方便地应用到基因定位、外源遗传物质鉴定等研究中。小麦SSR标记具有小麦近缘种属间、属内的可转移性，即大部分根据普通小麦的序列信息设计的SSR引物也可以在小麦的近缘种属中发挥作用，扩增出正常的DNA片段。Li等Q009)利用SSR标记对来自野生二粒小麦材料IW2的抗白粉病基因进行分析，发现该抗白粉病基因位于SSR标记)(barC84和Xwmc687之间，遗传距离分别为3. 2cM和 2. OcM，利用中国春缺体-四体系、双端体系、缺失系材料将该基因定位于染色体3BL上，将抗白粉病基因命名为Pm41。Hua等Q009)利用SSR标记对来自于野生二粒小麦的普通小麦抗白粉病品系P63中进行分析，发现该抗白粉病基因位于SSR标记Xwmc257和Xgwml48 之间，遗传距离分别为16cM和6. 7cM，并将该基因定位于染色体2BS上，该抗白粉病基因被命名为Pm42。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定抗白粉病植物的方法及其专用引物。
本发明提供了引物对甲OCcfd50引物对)在制备辅助鉴定白粉病抗病植物的试剂盒中的应用；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链 DNA组成的引物对。所述植物为小麦。所述小麦具体可为小麦材料87-1、小麦材料IW132、 小麦材料农大212、小麦材料农大211、以小麦材料87-1与小麦材料IW132为初始亲本获得的后代(包括杂交后代、回交后代)、所述后代与小麦材料农大212(或小麦材料农大211) 的杂交后代及其自交子代。本发明还保护所述引物对甲和引物对乙(XMag633引物对)在制备辅助鉴定白粉病抗病植物的试剂盒中的应用；所述引物对乙是由序列表的序列3所示单链DNA和序列表的序列4所示单链DNA组成的引物对。所述植物为小麦。所述小麦具体可为小麦材料87-1、 小麦材料IW132、小麦材料农大212、小麦材料农大211、以小麦材料87_1与小麦材料IW132 为初始亲本获得的后代(包括杂交后代、回交后代)、所述后代与小麦材料农大212(或小麦材料农大211)的杂交后代及其自交子代。本发明还保护一种辅助鉴定白粉病抗病植物的试剂盒，包括所述引物对甲。所述试剂盒还可包括所述引物对乙。本发明还保护所述引物对甲在辅助鉴定白粉病抗病植物中的应用。本发明还保护所述引物对甲和所述引物对乙在辅助鉴定白粉病抗病植物中的应用。本发明还保护一种辅助鉴定白粉病抗病植物的方法，包括步骤甲；所述步骤甲包括如下步骤以待测植物的基因组DNA为模板，用所述引物对甲进行PCR扩增；如果PCR扩增产物中具有两条特异性片段，待测植物为候选的白粉病抗病植物；如果PCR扩增产物中不具有所述两条特异性片段，待测植物为候选的白粉病感病植物；所述两条特异性片段中的一条为 505-5Mbp，另一条为 485-4%bp。所述方法还可包括步骤乙；所述步骤乙包括如下步骤以待测植物的基因组DNA 为模板，用所述引物对乙进行PCR扩增；如果PCR扩增产物中具有一条特异性片段，待测植物为候选的白粉病抗病植物；如果PCR扩增产物中不具有所述一条特异性片段，待测植物为候选的白粉病感病植物；所述一条特异性片段为565-57^p的DNA片段。所述植物为小麦。所述小麦具体可为小麦材料87-1、小麦材料IW132、小麦材料农大212、小麦材料农大211、以小麦材料87-1与小麦材料IW132为初始亲本获得的后代(包括杂交后代、回交后代)、所述后代与小麦材料农大212(或小麦材料农大211)的杂交后代及其自交子代。将所述步骤甲和所述步骤乙的鉴定结果可进行相互验证。如果同一所述待测植物在所述步骤甲和所述步骤乙中的鉴定结果一致，该待测植物为进一步确定的候选的白粉病抗病植物或进一步确定的候选的白粉病感病植物。如果同一所述待测植物在所述步骤甲和所述步骤乙中的鉴定结果不一致，可结合其它现有方法确定该待测植物对白粉病的抗感性。野生二粒小麦(Triticumdicoccoides, 2n = 4X = 28，AABB)是普通小麦的二级基因源，对小麦叶锈病、秆锈病和白粉病具有良好的抗性，在小麦抗病性遗传改良中有着巨大的应用潜力。野生二粒小麦是普通小麦的四倍体祖先种，与普通小麦杂交容易成功，杂种Fl部分或完全可育，其抗病性可以通过杂交和回交等方法便捷地转移到普通小麦中。因此，充分发掘野生二粒小麦的白粉病抗源，并将其导入到普通小麦中，对于提高小麦抗病基因的多样性及基因累加，具有重要的现实意义。抗白粉病基因M17K65的发现也进一步证实了野生二粒小麦在普通小麦抗白粉病上的作用，也为小麦新品种的选育提供了依据。本发明筛选到了 2个与抗白粉病基因M17K65紧密连锁的分子标记)(Cfd50和Xmag633。该两个标记可有效地用于M17K65基因的标记辅助选择。以该标记为路标，可以进行M17K65基因的精细定位或通过染色体步移法接近M17K65基因，从而为M17K65基因的克隆打下基础。应用本发明提供的引物组合物和方法，可以辅助鉴定白粉病抗性植物，具有操作简便、成本低廉、可以实现早期选育的优点。本发明的引物组合物和方法可以用于植物遗传育种，对于培育抗白粉病植物新品种具有重大价值。
图1为应用)(cfd50引物对PCR鉴定7K65/农大211-F2代植株的结果。图2为应用)(Cfd50引物对PCR鉴定7K65/农大212-F2代植株的结果。图3为应用XMag633引物对PCR鉴定7K65/农大211-F2代植株的结果。图4为应用XMag633引物对PCR鉴定7K65/农大212-F2代植株的结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。小麦材料87-1(易感染小麦白粉病的普通小麦)河北省邯郸农科院；公众可以从中国农业大学获得；参考文献张连松，华为，关海英，李根桥，张宏涛，解超杰，杨作民，孙其信，刘志勇野生二粒小麦导入普通小麦的抗白粉病基因MlffE^分子标记定位，作物学报 2009，35(6) :998-1005。小麦材料IW132(高抗白粉病的野生二粒小麦)以色列海法大学；公众可以从中国农业大学获得；参考文献解超杰，孙其信，杨作民以色列野生二粒小麦苗期抗病性鉴定。麦娄作物学报2003，23 (2) :39 42。小麦材料Morocco (易感染小麦白粉病的普通小麦)公众可以从中国农业大学获得；参考文献刘慧远，K Suenaga，何中虎，王竹林，梁闪闪，马均，M Bernard, PSourdille， 夏先春普通小麦白粉病成株抗性的QTL分析。作物学报2006,32( :197_202。小麦材料农大212(易感染小麦白粉病的普通小麦)中国农业大学农学与生物技术学院小麦组培育小麦新品种，公众可从北京市通州区种子公司购得。小麦材料农大211(易感染小麦白粉病的普通小麦)中国农业大学农学与生物技术学院小麦组培育小麦新品种，公众可从北京市通州区种子公司购得。小麦材料薛早(易感染小麦白粉病的普通小麦)北京市农科院作物所；公众可以从中国农业大学获得；参考文献张连松，华为，关海英，李根桥，张宏涛，解超杰，杨作民， 孙其信，刘志勇野生二粒小麦导入普通小麦的抗白粉病基因MlTO^分子标记定位。作物学报 2009，35(6) :998-1005。
E09号生理小种中国农科院植保所；公众可以从中国农业大学获得；参考文献 张连松，华为，关海英，李根桥，张宏涛，解超杰，杨作民，孙其信，刘志勇野生二粒小麦导入普通小麦的抗白粉病基因MlTO^分子标记定位。作物学报2009，35 (6) :998_1005。植物对小麦白粉病致病菌的抗性和感性的划分依据于接种小麦白粉病致病菌后植物的苗期反应型，分级标准见表1。表1接种小麦白粉病致病菌后植物的苗期反应型分级标准(Liu et al. 1999)
权利要求
1.引物对甲在制备辅助鉴定白粉病抗病植物的试剂盒中的应用；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对。
2.引物对甲和引物对乙在制备辅助鉴定白粉病抗病植物的试剂盒中的应用；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对； 所述引物对乙是由序列表的序列3所示单链DNA和序列表的序列4所示单链DNA组成的引物对。
3.一种辅助鉴定白粉病抗病植物的试剂盒，包括引物对甲；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括引物对乙；所述引物对乙是由序列表的序列3所示单链DNA和序列表的序列4所示单链DNA组成的引物对。
5.引物对甲在辅助鉴定白粉病抗病植物中的应用；所述引物对甲是由序列表的序列1 所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对。
6.引物对甲和和引物对乙在辅助鉴定白粉病抗病植物中的应用；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对；所述引物对乙是由序列表的序列3所示单链DNA和序列表的序列4所示单链DNA组成的引物对。
7.一种辅助鉴定白粉病抗病植物的方法，包括步骤甲；所述步骤甲包括如下步骤以待测植物的基因组DNA为模板，用引物对甲进行PCR扩增；如果PCR扩增产物中具有两条特异性片段，待测植物为候选的白粉病抗病植物；如果 PCR扩增产物中不具有所述两条特异性片段，待测植物为候选的白粉病感病植物；所述两条特异性片段中的一条为505-5Mbp，另一条为485-4%bp ；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法还包括步骤乙；所述步骤乙包括如下步骤以待测植物的基因组DNA为模板，用引物对乙进行PCR扩增；如果PCR扩增产物中具有一条特异性片段，待测植物为候选的白粉病抗病植物；如果 PCR扩增产物中不具有所述一条特异性片段，待测植物为候选的白粉病感病植物；所述一条特异性片段为5635-575bp的DNA片段；所述引物对乙是由序列表的序列3所示单链DNA 和序列表的序列4所示单链DNA组成的引物对。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于如果同一所述待测植物在所述步骤甲和所述步骤乙中的鉴定结果一致，该待测植物为进一步确定的候选的白粉病抗病植物或进一步确定的候选的白粉病感病植物。
10.如权利要求1或2或5或6所述的应用，或如权利要求 3或4所述的试剂盒，或如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于所述植物为小麦。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴定抗白粉病植物的方法及其专用引物。本发明提供的专用引物包括序列表的序列1和序列2所示DNA组成的Xcfd50引物对，还可包括序列表的序列3和序列4所示DNA组成的XMag633引物对。本发明提供的专用引物可用于辅助鉴定白粉病抗病植物。应用本发明提供的引物组合物和方法，可以辅助鉴定白粉病抗性植物，具有操作简便、成本低廉、可以实现早期选育的优点。本发明的引物组合物和方法可以用于植物遗传育种，对于培育抗白粉病植物新品种具有重大价值。
文档编号C12Q1/68GK102559911SQ20121003503
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者倪中福, 刘志勇, 孙其信, 杨作民, 沈红霞, 解超杰, 辛明明 申请人:中国农业大学