专利名称：甜橙mlo型抗白粉病基因快速鉴定的制作方法
技术领域：
本发明是借助于甜橙测序全基因组序列，利用植物比较基因组学、遗传学、生物信息学和候选基因策略等方法快速鉴定甜橙白粉病基因，主要涉及到甜橙全基因组序列的下载，候选基因的鉴定，基因的比对，聚类等手段，进而鉴定出白粉病基因，属于植物生物技术科学领域。
背景技术：
甜橙为芸香科(Rutaceae)柑橘亚科柑橘属(Citurs)果树,别名黄果、橙子、金球、金橙等，原产于热带及亚热带地区，主要分布在年平均温度15°C以上的地区，我国是甜橙的原产国之一，主产区主要在四川、广东、台湾、广西、福建、湖南、江西、湖北等省份。在世界柑橘生产中，甜橙占的比例最大，年产量约占橘类总产量的2/3。 甜橙白粉病是甜橙生产上常见的ー类真菌性病害，此类病害主要危害甜橙幼嫩枝叶及幼果，发病初期会在嫩叶正、反两面呈现白色霉斑，外观疏松，霉斑常由中心向外扩展。霉层下面叶片组织最初呈水溃状，以后逐渐失绿，形成黄斑。严重时病斑扩及全叶，往往引起大量落叶、落果、枝条干枯，这类病害严重影响了甜橙的产量和品质。因此，控制此类病害的发生及蔓延，是使甜橙产业健康快速发展的前提保障。生产上单纯的通过药剂防治白粉病的扩散，并不能从根本上解决此类病害的蔓延。选育抗病品种一直以来是公认的最有效最直接解决此类病害的方法，但由于甜橙树体大、童期长，遗传上高度杂合，难以建立理想的分离群体，这给传统的育种方式带来了很大的难度。随着分子生物技术的迅猛发展，利用分子标记及转基因技术将抗病基因转入到优质的甜橙树中将加速甜橙的育种进程，所以挖掘和分析抗白粉病基因是利用生物技术培育抗白粉病甜橙的前提和基础。MLO型抗病基因是植物特异的一类抗病基因。研究者最早发现MLOresistance locus 2)基因对白粉病抗性是始于1937-1938年，由德国人在埃塞俄比亚采集了很多品种的大麦，其中的两个株系对白粉病菌QUunwriei gremiriis f. sp. hordei)所有己知的生理小种都具有高效抗性。进ー步研究表明，大麦中MLO基因的隐性突变mlo可以使大麦对几乎所有己知大麦白粉病菌的生理小种产生持久、广谱的抗性。最近，研究者发现很多植物的抗白粉病基因都是MLO型基因控制，如番茄，豌豆、拟南芥、薔薇、辣椒、百脉根等等。因此挖掘植物中的MLO型抗病基因对植物抗白粉病育种具有重要的作用。目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有图位克隆，转座子标签等方法。但是由于甜橙的基础研究不够深入，因此利用这些方法不仅时间长而且很难准确地克隆这些基因。因此，如何快速鉴定甜橙中的MLO型抗病基因将成为甜橙抗白粉病育种的重要前提。植物比较基因组学(Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序基础上,对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利用模式植物基因组与其它植物基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆其他植物基因，掲示基因功能和分子机制，阐明物种进化关系及基因组的内在结构。本专利所采用的方法及思路模式植物拟南芥基因组研究已经掲示了 MLO型基因的功能，利用基因其顺序上的同源性克隆甜橙MLO型抗病基因，根据模式植物拟南芥实验系统上的优越性和已知MLO型抗病基因的特点，快速“捕捉”甜橙抗白粉病基因。近年来，甜橙基因组测序的完成为我们快速挖掘甜橙白粉病基因提供了条件。本专利介绍了以甜橙全基因组序列为前提，结合比较基因组学、遗传学、基因组学、生物信息学和候选基因策略等知识，快速挖掘白粉病基因。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种通过结合植物比较基因组学、植物遗传学、基因组学和生物信息学等知识，快速挖掘甜橙抗白粉病基因。其结果一方面可用于甜橙白粉病基因紧密连锁分子标记的开发，进行分子标记辅助选择育种，另一方面也为其他作物白粉病基因鉴定提供參考依据。技术方案
主要原理第一个植物抗白粉病基因(MLO)是从大麦中克隆的，研究发现此基因是ー类特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多数NBS (nucleotide-binding site)类型抗病基因；随后，研究者相继从番茄、拟南芥、豌豆、辣椒、百脉根等植物中克隆了白粉病基因，研究发现这些基因编码的都是MLO型抗病基因。随后，众多研究者通过多次试验证实MLO型抗病基因已经成为植物特有的ー类抗白粉病基因。进ー步发现，植物MLO类型基因是ー个基因家族；而且对来源于不同物种的MLO基因家族进行系统发育关系分析发现，不同物种中抗白粉病基因总是聚类一起，成为ー类，这ー类MLO基因都具有抗白粉病基因序列的典型特征。甜橙基因组测序的完成为挖掘白粉病基因提供了一条便利途径。因此，可以借助于已经测序的甜橙全基因组中MLO基因家族和已经克隆的MLO白粉病基因的系统发育关系以及对于维持白粉病基因MLO重要功能的氨基酸保守性来鉴定甜橙白粉病基因。主要步骤如下
O甜橙全基因组序列的下载及其MLO型基因的采集
首先从甜橙测序基因组数据库(http://www. phytozome. net/search, php)下载甜橙全基因组序列；使用“DNAT00LS”软件对获得的甜橙全基因组氨基酸序列数据建立数据库，然后用 pfam 数据库(蛋白家族数据库，http://pfam.janelia.org/search/sequence)中的隐马尔可夫模型(HMM)对MLO结构域的氨基酸序列与已建立的甜橙全基因组氨基酸序列数据库进行Blastp (E-Value=O. 001)序列比对，初步筛选出候选基因序列。其次，利用已经公布的MLO型基因序列，对甜橙基因组数据库进行BLAST比对，获得候选基因序列。2)甜橙MLO型基因家族的鉴定
将上述结果中得到的同源核苷酸序列的候选基因，通过Pfam(E-Value=LO)进行分析，去除无‘ML0’结构域的基因序列(图I)。再将候选抗病基因序列通过MEGA3. I软件提供的ClustalW工具(多序列比对程序)进行多序列比对，去除重复序列。3)通过植物MLO型基因的系统发育关系鉴定候选的甜橙MLO型白粉病基因
由于先前的研究已经证明，双子叶植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系统发育树同一区组，因此在系统发育关系研究中，我们把拟南芥的MLO型基因家族和一些其他作物的MLO型抗白粉病基因和甜橙MLO型基因一起聚类分析，以获得候选的甜橙抗白粉病基因(图2)。
4)甜橙白粉病基因与已知的植物MLO白粉病基因的比对
利用BioXM 2.6软件将甜橙候选的MLO型白粉病基因和拟南芥、番茄、豌豆、大麦的MLO白粉病基因的氨基酸序列转换成Fasta格式的文件，将这些文件导入BioEdit 7. O软件，运用此软件中Clustal软件进行多序列比对，掲示候选白粉病基因重要氨基酸残基及区域的保守性。从而进一歩鉴定甜橙候选的白粉病基因(图3)。本发明的积极效果
O缩短了甜橙白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鉴定。采用常规方法(图位克隆、转座子标签等)挖掘抗白粉病基因不仅耗时耗力、效率低，且难以成功。本发明基于植物比较基因组学、遗传学、生物信息学方法快速挖掘甜橙白粉病基因，不仅可以缩短时间，还可以提闻白粉病基因鉴定效率。2)甜橙(GirM是全世界重要果树之一。由于甜橙遗传基础狭窄，种·质资源多样性低，因此通过常规的分子标记(RAPD、ISSR、SSR、AFLP等)鉴定甜橙白粉病基因比较困难。通过鉴定的候选白粉病基因开发相应的共分离功能性标记(SNP、SCAR等)，可以快速的用于抗病基因的分子标记辅助选择，准确性高。3)多抗性育种材料的创制。基于新鉴定的白粉病基因开发的功能性分子标记，结合已经定位的其他抗病基因的分子标记，进行多抗性育种材料的创制，可以缩短育种年限，提闻育种效率。4)为阐述甜橙抗白粉病分子机制奠定了基础。甜橙抗白粉病基因的鉴定，通过转基因技术、RNAi、病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术等研究抗白粉病的分子机制提供了基因资源，有利于快速阐述甜橙抗白粉病的作用机理。
图I甜橙MLO基因的鉴定；
本图显示的是15个MLO型基因鉴定結果，每ー个基因都含有ー个‘ML0’保守结构域。图2植物MLO基因家族的系统发育关系分析及其甜橙MLO型白粉病基因的鉴定； 拟南芥是植物科学研究的模式植物，在构建系统发育树中，拟南芥的15个MLO型基因
(其中3个基因是白粉病基因AtML002，AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因(SlMLO)、大麦白粉病基因(HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因(PsMLO)被选择用来和甜橙MLO型基因聚类分析。共鉴定出2个甜橙候选的MLO型白粉病基因。图中斜体标记的基因就是候选甜橙白粉病基因。图3甜橙MLO型白粉病基因的比对分析；
2个甜橙白粉病基因与大麦(HvMLO)、番茄(SlMLO)、豌豆(PsMLO)、拟南芥白粉病基因(AtML002，AtML006和AtML012)进行比对，鉴定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸残基和区域的保守型。图中TM1-TM7表示甜橙MLO型白粉病基因的7个转模区域；黑色圆点表示白粉菌侵染重要的氨基酸残基；CaMBD表示钙调蛋白结合区；1和II表示对白粉菌侵染重要的氨基酸区域。
具体实施例方式抗病基因的鉴定在作物抗病遗传理论研究和抗病品种选育中具有重要的作用。本方法可以快速鉴定出甜橙白粉病基因。具体实施过程如下
I)甜橙MLO型基因的采集及鉴定
为了获得甜橙全部的MLO型基因家族成员，我们首先以拟南芥的MLO型基因，番茄、豌豆、辣椒、蔷薇、辣椒、百脉根的抗白粉病MLO基因序列构建HMM模型，从甜橙基因组序列中收索MLO型基因；其次以不同作物中已经发表的MLO基因序列作为靶序列(来自 DFCI 数据库TC171015, TC267529, DFCI: TC327983, TC289653, TC312087,TC132500, TC133436, TC317623, TC317025, TC315947, TC325903, TC315944, TC315912,TC322759, TC322059, TC330654, TC282713, TC293173, TC281861, TC283253, TC283383,TC285032, TC290021, TC302716, TC283487, TC282866, TC283441, TC281428, TC285118,TC285090;来自 GenBank 数据库AY967408, AF384145, AF384144, AY029312-AY029315,AY029317-AY029319, Z95352, AF369563-AF369565, AF369567, AF369569-AF369576，Z83834, Z95496, AY581255),对甜澄数据库(http://www. phytozome. net/search.php)进行BLAST比对，选择相似度最高的序列进行下载，共获得了 15条候选的MLO 型基因(orangel. Ig041242m. g; orangel. Ig042041m. g; orangel. Ig010670m. g ; orange I. lg008373m. g; orange I. IgOl28 59m. g ; orange I. lg023637m.g ; orange I. lg009223m. g ; orange I. Ig008408m. g ; orangel. I gO10805m.g; orange I. lg048528m. g; orange I. IgOl 1363m. g; orange I. Ig047450m. g;orangel. Ig044857m. g; orangel. Ig010450m. g; orangel. Ig008391m. g;)。2)甜橙MLO型基因家族的鉴定
为了进ー步验证这些MLO基因准确性，我们对这15个候选的MLO基因进行了保守结构域“ML0”的鉴定。以每ー个候选的MLO型基因的氨基酸序列为基准，在PFAM(http://pfam.sanger. ac.uk/)网站上进行‘ML0’保守结构域的鉴定,具体结果见图I。3)甜橙MLO型基因的系统发育关系分析
在先前的研究中，发现双子叶植物白粉病基因聚合成一个区组；因此，在构建系统发育树中，我们选择了模式植物拟南芥的15个MLO型基因(其中3个基因是白粉病基因AtML002，AtML006和AtMLOl2)、番茄抗白粉病基因、大麦白粉病基因和豌豆的白粉病基因和甜橙MLO型基因聚类分析一起聚类分析。将甜橙MLO型基因和其他作物白粉病基因蛋白质序列进行多序列联配(采用Clustal X I. 83软件进行),并利用Genedoc软件(http://www. nrbsc. org/gfx/genedoc/index, html)显不多序列联配的结果。将Clustal多序列联配的结果输出到MEGA 4.0软件中，并利用此软件分别构建了邻接树(neighbor-joining,NJ),利用Bootstrapping方法对这些进化树进行了评估。结果发现在双子叶植物抗白粉病基因区组内，存在2个甜橙候选的MLO型白粉病基因(见图2)。4)甜橙MLO型抗病基因的比对
在大麦MLO型白粉病基因研究中，研究中相继发现了ー些重要区域和单个氨基酸，它们对大麦白粉菌侵染有着不可替代的作用。为了鉴定2个候选的甜橙白粉病基因中，这 些重要区域和氨基酸是否高度保守，我们对来自拟南芥的3个抗白粉病基因(AtML002、AtML06和AtMLO12)、番茄白粉病基因(S1ML0)、豌豆白粉病基因(PsMLO)进行了比对分析。发现甜橙2个候选的白粉病基因与已知的MLO型白粉病基因7个跨膜区，30个重要的氨基酸，I个钙调蛋白结合区(CaMBD)和两个重要的区域(I和II)高度保守(图3)。
权利要求
1.甜橙抗白粉病基因，其特征在于选自下列2个基因或其之一 orangel. Ig008391m. g 氨基酸MAEKKVYERTLEETPTffAVAAVFFVLIAVSVVIEHLIHIIGKWLNNRHKKALFEAVEKVKAELMLLGFISLLLTVLQEPISGICVSKSVANSWHPCTDKLEKDAYSSDNKESRRRLLSFLDSGTASTRRSLATKGYDKCADEGKVAFVSAYGIHQLHIFIFVLAVFHVLYCLFTLALGRTKMKKWKAWENETKTIEYQYYNDPERFRFARDTSFGRRHLNIWSKSSISLWIVCFFRQFLGSVNKIDYHTLRHGFIMAHLAPGSETKFDFQKYISRSLEEDFKDVVGITPILWFIATLFLLTNTHGWFAYLWLPFIPLFIILLVGAKLQVIITKLGLRIQERGDWKGAPWQP ⑶ DLFWFGRPRFILFLIHLVLFQNAFQLAFFSWSTYEFALKSCFHKKTEDIAIRISMGVLIQILCSYVTLPLYALVTQMGSTMKPTIFNDRVAAALKNWHHIAKKHTKQGRLSGSNTPMSSRPQTPTHGMSPVHLLHNYPNSSYHSNFEHEHWDPENQIRSPRHHREIMNESPPHYAESSEQEVAALEEPRQIEMQLPPGPGFIHTHHEFSFGK核苷酸ATGGCGGAGAAAAAGGTTTATGAGCGTACGTTGGAGGAAACTCCAACATGGGCTGTTGCTGCGGTCTTTTTTGTGTTGATTGCCGTTTCAGTCGTCATTGAACATCTCATTCACATTATTGGAAAGTGGTTGAATAACAGACACAAGAAAGCTCTCTTCGAAGCAGTTGAAAAAGTTAAAGCAGAGCTTATGCTATTGGGGTTCATATCATTGCTGCTAACAGTGTTACAAGAACCAATTTCTGGTATTTGTGTATCAAAGAGTGTTGCAAATTCTTGGCATCCTTGCACTGACAAATTAGAAAAAGATGCATATAGCAGTGATAATAAAGAGAGTCGCCGGAGACTTCTTTCGTTTCTTGATTCCGGAACAGCCAGCACTCGCCGGAGTTTAGCAACTAAAGGTTATGACAAATGCGCGGATGAGGGCAAAGTTGCATTTGTGTCTGCATATGGGATTCATCAGCTCCATATATTCATATTTGTTTTAGCTGTTTTCCATGTCCTTTACTGCTTATTCACCTTGGCTTTGGGAAGAACAAAGATGAAGAAATGGAAGGCATGGGAGAATGAGACAAAGACAATTGAGTACCAATACTACAATGATCCAGAAAGGTTTCGGTTTGCAAGGGACACTTCATTTGGTCGTAGGCATTTGAATATTTGGAGTAAATCATCAATCAGCTTGTGGATTGTTTGCTTCTTCAGGCAATTCCTTGGATCTGTTAACAAAATTGATTACCACACACTGAGACATGGATTCATCATGGCTCATTTGGCTCCTGGAAGTGAAACAAAATTCGATTTTCAGAAATACATCAGCAGATCGCTTGAAGAAGATTTCAAAGATGTTGTGGGAATAACTCCAATTCTATGGTTCATTGCAACGTTGTTCTTGCTCACCAATACACATGGATGGTTTGCTTACTTGTGGTTACCATTTATCCCCTTATTTATAATTCTGTTGGTGGGTGCTAAACTACAAGTGATTATAACGAAACTGGGCCTGAGAATTCAAGAGAGAGGTGATGTGGTGAAGGGGGCACCAGTGGTTCAGCCTGGTGATGACCTTTTCTGGTTCGGACGCCCGCGGTTCATTCTCTTTCTCATTCACTTGGTTCTTTTCCAGAATGCATTTCAGCTGGCATTTTTCAGTTGGAGCACGTATGAATTTGCGCTTAAATCTTGCTTCCACAAGAAAACTGAGGATATAGCTATCAGAATCTCAATGGGGGTGCTCATTCAGATTCTATGCAGTTATGTGACACTACCTCTATATGCCTTAGTGACACAGATGGGATCTACAATGAAACCAACAATATTTAATGATAGAGTGGCAGCAGCACTGAAAAACTGGCACCATATTGCCAAAAAACACACAAAACAGGGCAGGCTTTCTGGGAGTAACACACCAATGTCAAGCAGGCCACAAACTCCTACACATGGAATGTCACCGGTCCATCTCTTGCATAATTACCCGAACAGCAGCTACCACTCGAACTTCGAGCACGAGCATTGGGATCCCGAGAATCAGATTCGTTCGCCGCGCCACCACCGCGAGATCATGAATGAGTCTCCTCCACATTATGCAGAATCTAGTGAACAAGAAGTGGCAGCACTTGAAGAGCCTAGGCAAATTGAAATGCAGCTGCCTCCAGGTCCCGGATTCATTCATACACATCACGAATTTTCATTTGGGAAATGAorangel. Ig023637m. g氨基酸MAGASGGRSLEETPTWAVAVVCFVLVTISIIIEHIIHLIGKffLTKKHKRALYEALEKIKSELMLLGFISLLLTVAGSWISKICIPESVANTWHPCDKEREPELNNEKETTEQETTEHENRRRLLEAVAASGGSIRRALAAGSTTEKCSK、GKVPFVSEDGLHQLHIFIFVLALFHVLYSILTMALSRAKMKKWKKWEKETRTIDYQFSHDPERFRFARETSFGRRHLSSWTKTPVLIWIVCFFRQFVRSVPKVDYLTLRHGFVTVIFLCFQSLAISIKYY 核苷酸ATGGCCGGAGCTAGCGGAGGAAGATCTTTGGAGGAGACGCCGACATGGGCCGTTGCGGTCGTTTGTTTTGTT TTGGTTACGATTTCAATAATTATCGAGCACATAATCCATCTTATCGGAAAGTGGCTGACAAAGAAACACAAGAGAGCTTTATACGAGGCACTCGAGAAGATCAAATCAGAGTTGATGCTACTGGGGTTCATATCGTTGCTACTAACAGTAGCAG GTAGTTGGATATCAAAAATATGCATACCAGAAAGTGTGGCAAATACATGGCATCCATGCGATAAGGAAAGAGAACCAGAGCTAAACAATGAGAAGGAGACTACTGAACAAGAAACGACAGAACACGAAAACCGCCGGAGACTTCTGGAGGCGGTGGCCGCCTCGGGTGGAAGTATCCGAAGAGCTTTGGCGGCGGGATCAACAACCGAAAAATGTTCCAAGGGCAAAGTTCCATTTGTGTCTGAGGACGGTCTCCATCAACTCCATATTTTCATCTTTGTCTTAGCACTTTTCCATGTCCTTTACAGTATCCTTACAATGGCCTTGAGCAGAGCCAAGATGAAGAAATGGAAGAAATGGGAAAAGGAAACAAGAACAATTGATTATCAGTTCTCTCACGATCCTGAGAGGTTTAGATTTGCAAGAGAGACGTCGTTTGGCAGGAGGCATTTGAGTTCGTGGACCAAGACACCTGTCCTCATTTGGATAGTTTGTTTCTTCAGGCAATTTGTTCGGTCGGTTCCCAAGGTTGATTACTTAACTCTCAGGCATGGATTTGTCACGGTAATTTTCTTGTGTTTTCAAAGTTTGGCAATTTCAATCAAATATTATTAAo
2.权利要求I所述快速鉴定甜橙白粉病基因的应用，包括 I)育种材料的创制。.3.2)抗白粉病的育种实践。
.4.3)抗白粉病基础理论研究。
全文摘要
本发明是快速鉴定甜橙抗白粉病基因；涉及到植物比较基因组学，遗传学和生物信息学等学科知识，属于植物生物技术科学领域。该发明主要步骤为1)甜橙全基因组序列的下载及MLO型基因的采集；2)MLO型基因的鉴定；3)MLO型基因系统发育关系；4)MLO型白粉病基因的比对。该发明有效的缩短了甜橙白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鉴定；通过鉴定的候选白粉病基因开发相应的共分离功能性标记(SNP、SCAR等)，还可以快速的用于抗白粉病基因的分子标记辅助选择，准确性高；结合其它抗病基因分子标记可进行多抗性育种材料的创制，缩短育种年限，提高育种效率；为阐述甜橙抗白粉病分子机制奠定了基础。
文档编号C12Q1/68GK102719446SQ201210094998
公开日2012年10月10日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者袁伟, 钱孝英 申请人:常熟市支塘镇新盛技术咨询服务有限公司