与黄瓜抗白粉病紧密连锁的两个snp标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体的说，涉及一种与黄瓜抗白粉病紧 密连锁的SNP标记。
【背景技术】
[0002] 黄瓜（Cucumis sativus L.)是萌芦科（Cucurbitaceae)甜瓜属（Cucumis) - 年生蔓生草本植物，原产温暖湿润的喜马拉雅山南麓的印度北部地区，传入我国栽培已 有2000多年的历史。黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之 一。据世界粮农组织（FAO)统计，2012年我国黄瓜栽培总面积达115. 25万公顷，年产量达 4804. 88万吨，分别占世界总量的54. 63%和73. 77%。黄瓜生产中面临多种病害威胁，其 中白粉病是最为严重的病害之一，常造成严重的产量与质量损失。黄瓜白粉病由专性寄生 菌（Podosphaera xanthii)引起的真菌性病害，主要侵染植株的叶片和莖。白粉病在黄瓜 田间生长的各个时期均可发生，在苗期发病可造成黄瓜生长减弱，在开花期发病可导致后 期黄瓜减产20?40 %，在结瓜期发病，会导致植株叶片枯黄，果实生长缓慢，植株早衰，严 重影响果实的品质和产量。使用化学药剂防治不仅浪费人力物力，污染环境，还使果实农药 残留增加。传统抗病育种周期长，需要大量及多代配置杂交组合及接种白粉病观察。
[0003] 随着分子生物学技术的飞速发展，分子育种技术大大加快了抗病育种的进程，显 著缩短了抗病新品系的选育周期。分子育种的前提是获得与目标性状密切相关的分子标 记或功能基因。利用分子标记辅助选择目标性状，可提高选择效率，缩短育种周期。虽然 白粉病是重要的病害之一，然而对于抗白粉病基因的定位研宄相对薄弱。目前的报道主要 集中于抗白粉病QTL鉴定，尚未有SNP标记用于黄瓜育种性状辅助选择的报道。Sakata 等（2006)检测到6个与黄瓜抗白粉病相关的QTL(Chrl、Chr5、Chrl6、Chr7)(所用标记： STS)。Hofstede和de Ruiter等（2008)检测到两个黄瓜抗白粉病QTL，分别为与叶片抗性 相关的pm-Ι，以及与下胚轴抗性有关的pm-h (所用标记：SSR)。Zhang等（2011)鉴定到三 个位于 Chr5 的 QTLs (pm5. 1，pm5. 2and pm5. 3)，以及 1 个位于 Chr6 的 QTL(pm6. 1)(所用标 记：SSR)。He等（2013)使用WI 2757和True Lemon获得的F2:3群体对黄瓜白粉病基因进 行定位，构建了包含七个连锁群共610. 4cM的连锁图谱，在第5连锁群上检测到两个主效 QTL(pm5. 1，pm5. 2)与两个微效 QTL(pm3. 1，pm4. 1)(所用标记：SSR)。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种与黄瓜抗白粉病QTL紧密连锁的SNP标记及提供用于扩增上述 SNP标记的引物对。
[0005] 本发明所述的两个与黄瓜抗白粉病紧密连锁的SNP标记，是Chr6SNP-pmO 1 和Chr6SNP-pm02,其中Chr6SNP-pm01位于黄瓜基因组第6号染色体4, 450, 551处 Chr6SNP-pm021位于黄瓜基因组第6号染色体6, 822, 412处。Chr6SNP-pm01处碱基为G的 黄瓜高抗白粉病，此处为A的黄瓜高感白粉病。Chr6SNP-pm02处碱基为C的黄瓜高抗白粉 病，此处为T的黄瓜高感白粉病。
[0006] 本发明还提供了一组用于检测上述与黄瓜抗白粉病相关的SNP的dCAPS标记的 引物对，包括 Chr6SNP-pmO 1 的上游引物 5 ' -GGTCGCTTAAGAGCAGTTCAATTTA-3 ' (SEQ ID NO. 1)，反向引物 5' -GTCGAAATGACTCAACAACG-3' (SEQ ID NO. 2) ;Chr6SNP-pm02 的正向引 物 5 ' -TCCATCCGCTTATCAATC-3' (SEQ ID NO. 3)，反向引物 5 ' -TGGCGGTGCTGCCGCCGCTCCA CTT-3r (SEQ ID NO.4)〇
[0007] 本发明还公开了所述的SNP及衍生的dCAPS引物在黄瓜抗白粉病分子标记辅助育 种中的应用。
[0008] 本发明所述的应用，具体方法是：
[0009] 1)提取待检测黄瓜基因组DNA ;
[0010] 2)以待检测黄瓜基因组DNA为模板，利用上述SNP衍生的dCAPS引物引物对，进行 PCR扩增反应；
[0011] 3)使用AluI限制性内切酶酶切Chr6SNP-pm01引物对所扩增的PCR产物，使用 DdeI限制性内切酶酶切Chr6SNP-pm02引物对所扩增的PCR产物酶切；
[0012] 4)经上述限制性内切酶酶切反应后，产物经琼脂糖电泳，如条带与Jin5-508 - 致，则为抗白粉病品系；如条带与D8 -致，则为感白粉病品系。
[0013] 本发明利用变异组学与群体遗传学的方法筛选到与黄瓜抗白粉病紧密连锁的SNP 标记，通过测序和转化为dCAPS标记的方法检测黄瓜基因型，根据基因型即可判断黄瓜抗 白粉病差异性，从而加速黄瓜抗白粉病品系选育进程。同时，这两个SNP标记也为黄瓜抗白 粉病基因的克隆奠定了基础。
【附图说明】
[0014] 图1是亲本及各级病叶（Pl :感白粉病亲本，P2 :抗白粉病亲本JIN5-508)
[0015] 图2是部分SSR标记亲本间（Pl :感白粉病亲本，P2 :抗白粉病亲本JIN5-508)聚 丙烯酰胺凝胶电泳多态性。
[0016] 图3是SSR标记在F2中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测。
[0017] 图4是SNP标记在亲本间的琼脂糖凝胶电泳多态性检测。
[0018] 图5是Chr6SNP-pm01 (图5左）和Chr6SNP-pm02 (图5右）在F2中的琼脂糖凝 胶电泳多态性检测。
[0019] 图6是基于？2重组株对黄瓜抗白粉病QTL进行精细定位（X :重组株）。
[0020] 图7是Chr6SNP-pm01在八个黄瓜品系中的琼脂糖凝胶电泳多态性检测（Pl:感 白粉病亲本，P2 :抗白粉病亲本 JIN5-508, 1:LL017,2:CJ223,3:EP56,4:SD41 ;5:R210， 6:EP112,7:GY114,8:JD65)。
[0021] 图8是Chr6SNP-pm02在八个黄瓜品系中的琼脂糖凝胶电泳多态性检测（PI:感 白粉病亲本，P2 :抗白粉病亲本 JIN5-508, 1:LL017,2:CJ223,3:EP56,4:SD41 ;5:R210， 6:EP112,7:GY114,8:JD65)。
【具体实施方式】
[0022] 实施例一
[0023] -、遗传分离群体的构建与交换单株的鉴定
[0024] UF2群体的构建
[0025] D8(母本），高感白粉病自交系；引自美国北卡罗来纳大学，茎杆粗壮，节间长 到12-14节时顶端以一束雌花封顶而停止生长，叶片暗绿色，果实短，果肉厚，果皮暗绿 色JIN5-508 (父本），高抗白粉病；为蔓生品系，植株高大，节间长，系从国内品种"津春5 号"（天津科润农业科技股份有限公司）连续自交分离8代，在每一个子代中选择高抗白粉 病的植株，自交至第8代性状不再分离而获得的高抗黄瓜白粉病、长果型自交系。本实施案 例利用这两个亲本配置了杂交组合F 1, F1自交产生F 2群体。在121株F 2群体中，鉴定白粉 病病情指数。病情指数的鉴定方法参照Qi等（2010)的实验标准进行：
[0026] 如图 1 :
[0027] 0级：整张叶片无粉斑；
[0028] 1级：有少数粉斑，但粉斑面积少于叶片面积的1/3 ;
[0029] 2级：粉斑增多占全叶面积的1/3-2/3 ;
[0030] 3级：粉斑逐渐连接成片，所占面积超过叶面积的2/3 ;
[0031] 4级：粉斑铺满整张叶片，碰触叶片，白粉振落；
[0032] 5级：粉斑布满整张叶片，叶片开始黄化，逐渐枯死。
[0033] 计算病情指数：
[0034] 公式为：DI =Σ (sini)/5NX100
[0035] DI =病情指数，si =发病级别，n