专利名称：：抗白粉病黄瓜品种的鉴定方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种农业
技术领域：
的鉴定方法，具体是一种抗白粉病黄瓜品种的鉴定方法。技术背景黄瓜白粉病(PM，powderymildew)是由专性活体寄生的白粉菌引起，在温室和大田都普遍发生的叶部病害；病原白粉菌主要包括瓜单囊壳(Podo印haeraxanthii)禾口二抱白粉菌(Golovinomycescichoracearum)两禾中；中国以瓜单囊壳(P.xanthii)危害较为普遍。白粉病病原寄主广泛，成熟孢子可随空气气流传播；干燥、凉爽季节易发生，白粉病菌可以感染黄瓜植株叶片、茎和花。根据报道，在开花期感染白粉病可减少产量2040%。喷洒杀菌剂和种植抗病品种是防御此病的主要方法。但长期使用杀菌剂会危害环境安全，且易引起病菌小种变异产生拮抗作用。推广种植抗病品种是安全、环保和高效的控制策略。经对现有技术文献的检索发现，刘秀波等在《中国瓜菜》2006年第1期第10页到13页上发表的"南瓜白粉病病原菌鉴定及抗性鉴定方法研究"，该文中提出白粉病的孢子悬浮液喷雾接种方法，其不足在于由于黄瓜白粉病发生危害大，特别影响黄瓜果实种子的正常成熟，悬浮液喷雾接种方法只能采用鉴定第二代的抗性来推测当代材料的抗性，这不仅延缓了抗病育种的工作进程，而且加大了抗病品种选育的工作量；同时有些遗传材料数量很少，科研有时间需要多个病菌小种对遗传材料同时鉴定，悬浮液喷雾接种方法不能完成这样的鉴定要求。检索中还发现，
专利名称：为"鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列及其鉴定方法"，公开号CN1482132。该专利技术公开了一种鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列及其鉴定方法，引物序列由上游引物5'-CAGTAAATGAAAGAAAAGAAG-3'，下游引物5'-ATACATAGCCATACAAAAAT_3'组成，使用该引物序列的鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，包括如下步骤(l)提取黄瓜基因组的DNA;(2)进行PCR扩增；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性。但是该专利技术是需要应用分子标记数据开展黄瓜种质白粉病抗病性鉴定，一般生产单位很难满足采集分子标记数据的实验要求，且鉴定结果与田间抗病吻合率还不高。
发明内容本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种抗白粉病黄瓜品种的鉴定方法。本发明是根据葫芦科植物叶片大的特点在可控条件下进行抗性鉴定，并根据叶片离体叶盘的抗性表现，对整个植株的抗性进行鉴定，较原有的鉴定方法具有更适用于黄瓜白粉病抗性品种的选育工作，鉴定结果的精确性和准确性更高，拓宽了进行抗性鉴定的时间，并可以同时在一个品种材料上同时鉴定多个白粉病生理小种，更适于遗传学的研究的特点。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤第一步，用不锈钢打孔器在黄瓜幼苗或成株采集取叶盘，对叶盘进行消毒；所述不锈钢打孔器，其直径为2cm。所述对叶盘进行消毒，具体为蒸馏水漂洗3s，2%次氯酸钠溶液漂洗5s，75%酒精溶液漂洗5s，蒸馏水漂洗10s。第二步，采用喷雾接种法对叶盘进行接种；所述采用喷雾接种法对叶盘进行接种，是指使用压力0.05MP/mm(兆帕/平方毫米)的压力器，以及孢子悬浮液浓度为5-7X104孢子/毫升，接种过程在无菌操作台上完成。第三步，接种后，将叶盘放置于放有两层滤纸的培养皿内；所述滤纸用0.01%头孢(质量比)溶液浸湿。第四步，将培养皿放置在光照培养箱内，每间隔4天，滴加无菌水保持滤纸湿润。第12天开始调査叶盘发病情况，根据叶盘测量的平均发病面积做出抗病性鉴定。所述的将培养皿放置在光照培养箱内，是指将培养皿放置在温度23'C的，光照为50u鹏l/s/m2的光照培养箱内12天。所述根据叶盘测量的平均发病面积做出抗病性鉴定，是指借助40倍解剖镜为辅助观察工具，按照叶盘发病面积10%为梯度，0:未发病，100%:叶盘上布满白粉病菌丝。为遗传分析方便，设定发病面积小于20%为抗病，大于20%为感病。一个品种可以取多个叶盘，叶盘测量的平均发病面积对应的病情梯度为该品种的病情梯度，并依此做出抗病性鉴定。本发明提供了一种黄瓜白粉病叶盘鉴定法，该方法较孢子悬浮液喷雾接种方法具有以下优点(1)更适用于黄瓜白粉病抗性品种的选育工作。由于采用了叶盘鉴定，叶盘直径仅2cm，对植株损伤性小，植株可以继续生长，满足其它实验和生产目的需要。可以当代选择，大大加快了品种选育的进程，也减少了育种的工作量。(2)由于取叶盘进行鉴定，可以在每个单株上取多个叶盘进行重复鉴定，利用平均值作为鉴定结果与悬浮液喷雾接种的单株接种鉴定结果相比，鉴定数据统计学意义更准确。(3)可以同时在同一植株叶片上取多个叶盘，用于多个病原小种的鉴定；这对于悬浮液喷雾接种方法接种鉴定是无法实现的。(4)对同一材料在一个生长季节中可以多次分离叶盘进行抗性鉴定，较悬浮液喷雾接种的一次性鉴定增加了鉴定的次数；鉴定的时间可以保证在一年中的任何时间进行，从而拓宽了抗性鉴定的时间。(5)更适合遗传学的研究。遗传学需要充分利用遗传群体中抗病材料和感病材料间存在的差异，而进行抗性鉴定的感病单株往往容易产生死苗，既无法收获果实，也不利于采集叶片进行核酸分析，而本方法则可以很好的解决这些问题。具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1、申绿2号和长春密刺的接种鉴定黄瓜白粉病抗性品种申绿2号为商业黄瓜品种，购买于上海市种子公司。黄瓜白粉病感病品种长春密刺，也为商业黄瓜品种购买于上海市种子公司。抗性鉴定方法如下一、接种黄瓜材料的准备将供试黄瓜品种单独播种于温室穴盘中(d=12cm，基质成分为1份泥炭+1份煤渣+2份蛭石)。当幼苗长至2叶一心时(约播种后20d)，在每株第一片真叶取叶盘l-2个，进行室内无菌叶盘鉴定。7天后对取走叶盘的植株，人工喷雾接种病菌孢子悬液。二、接种鉴定叶盘接种使用直径为2cm的不锈钢打孔器在黄瓜幼苗或成株采集取叶盘(直径二2cm)，对叶盘进行如下消毒过程，蒸馏水漂洗3s，2"/。次氯酸钠溶液漂洗5s，75。/。酒精溶液漂洗5s，蒸熘水漂洗10s。使用接种方法为喷雾接种法，利用压力0.05MP/腿(兆帕/平方毫米)的压力器，使用菌液浓度为5-7乂104孢子/毫升；过程在无菌操作台上完成。接种后，将叶盘放置于放有两层滤纸的培养皿内，滤纸用0.01%头孢溶液浸湿。培养皿放置在温度23。C的，光照为50umol/s/m2的光照培养箱内12天，每间隔4天，滴加10ml无菌水保持滤纸湿润。第12天开始调査叶盘发病情况，借助40倍解剖镜为辅助观察工具，按照叶盘发病面积10%为梯度，0:未发病，100%:叶盘上布满白粉病菌丝。幼苗人工接种采用孢子悬浮液喷雾接种法，孢子悬浮液浓度为5-7X104孢子/毫升；温室中白天温度22-28。C，夜晚温度15-18。C，日照时间17h左右，接种后24h内，用加湿器喷雾保持相对湿度在70%左右。接种12d后开始调査发病情况，病情统计方法参照(MorishitaM，JapanAgriculturalResearchQuarterly(日本农业研究季刊)，2003，37(1):714)。四、幼苗人工接种鉴定和叶盘接种鉴定结果的比较试验结果表明对黄瓜白粉病有不同抗感反应的黄瓜品种在苗期鉴定和叶盘鉴定时抗性表现基本一致，表明该项方法可用于鉴定品种的黄瓜白粉病抗性。结果如表l所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2、申绿2号和长春密刺F2遗传群体白粉病抗性遗传分析黄瓜白粉病抗性品种申绿2号为商业黄瓜品种，购买于上海市种子公司。黄瓜白粉病感病品种长春密刺，也为商业黄瓜品种购买于上海市种子公司。用申绿2号作母本和长春密刺作父本杂交，构建遗传F2群体，包括108个单株。接种鉴定方法如下一、接种黄瓜材料的准备将供试申绿2号和长春密刺组配的遗传F2群体播种于温室穴盘中(d=12cm，基质成分为1份泥炭+1份煤渣+2份蛭石)。当幼苗长至2叶一心时(约播种后20d)，在每株第一片真叶取叶盘l-2个，进行室内无菌叶盘鉴定。7天后对取走叶盘的植株，人工喷雾接种病菌孢子悬液。二、接种鉴定叶盘接种使用直径为2cm的不锈钢打孔器在黄瓜幼苗采集取叶盘(直径=2crii)，对叶盘进行如下消毒过程，蒸馏水漂洗3s，2%次氯酸钠溶液漂洗53，75%酒精溶液漂洗5s，蒸馏水漂洗10s。使用接种方法为喷雾接种法，利用压力0.05MP/mm(兆帕/平方毫米)的压力器，使用菌液浓度为5-7X104孢子/毫升；过程在无菌操作台上完成。接种后，将叶盘放置于放有两层滤纸的培养皿内，滤纸用O.01%头孢溶液浸湿。培养皿放置在温度23。C的，光照为50umol/s/m2的光照培养箱内12天，每间隔4天，滴加10ml无菌水保持滤纸湿润。第12天开始调査叶盘发病情况，借助40倍解剖镜为辅助观察工具，按照叶盘发病面积10%为梯度，0:未发病，100%:叶盘上布满白粉病菌丝。设定发病面积小于20%为抗病，大于20%为感病。统计申绿2号和长春密剌遗传F2群体单株白粉病抗性。幼苗人工接种采用孢子悬浮液喷雾接种法，孢子悬浮液浓度为5-7X104孢子/毫升；温室中白天温度22-28'C，夜晚温度15-18'C，日照时间17h左右，接种后24h内，用加湿器喷雾保持相对湿度在70%左右。接种12d后开始调查申绿2号和长春密刺遗传F2群体单株发病情况，病情统计方法参照(MorishitaM，JapanAgriculturalResearchQuarterly(日本农业研究季刊)，2003，37(1):714)。四、幼苗人工接种鉴定和叶盘接种鉴定申绿2号和长春密刺遗传F2群体结果的比较试验结果表明对申绿2号和长春密刺遗传F2群体在应用叶盘鉴定和苗期鉴定和抗性遗传规律表现完全一致，申绿2号和长春密刺遗传F2群体表现白粉病抗性由隐性单基因控制，其抗感分离比例为l:3。结果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1、一种抗白粉病黄瓜品种的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤第一步，用不锈钢打孔器在黄瓜幼苗或成株采集取叶盘，对叶盘进行消毒；第二步，采用喷雾接种法对叶盘进行接种；第三步，接种后，将叶盘放置于放有两层滤纸的培养皿内；第四步，将培养皿放置在光照培养箱内，间隔滴加无菌水保持滤纸湿润，第12天开始调查叶盘发病情况，根据叶盘测量的平均发病面积做出抗病性鉴定。2、根据权利要求l所述的抗白粉病黄瓜品种的鉴定方法，其特征是，第一步中，所述不锈钢打孔器，其直径为2cm。3、根据权利要求1或2所述的抗白粉病黄瓜品种的鉴定方法，其特征是，第一步中，所述对叶盘进行消毒，具体为蒸馏水漂洗3s，2%次氯酸钠溶液漂洗5s，75y。酒精溶液漂洗5s，蒸馏水漂洗10s。4、根据权利要求1所述的抗白粉病黄瓜品种的鉴定方法，其特征是，第二步中，所述采用喷雾接种法对叶盘进行接种，是指使用压力0.05MP/mm的压力器，以及孢子悬浮液浓度为5-7乂104孢子/毫升，接种在无菌操作台上完成。5、根据权利要求l所述的抗白粉病黄瓜品种的鉴定方法，其特征是，第三步中，所述滤纸用质量百分比为0.01%的头孢溶液浸湿。6、根据权利要求l所述的抗白粉病黄瓜品种的鉴定方法，其特征是，第四步中，所述的将培养皿放置在光照培养箱内，是指将培养皿放置在温度23°C的，光照为50mnol/s/m2的光照培养箱内12天。7、根据权利要求1或6所述的抗白粉病黄瓜品种的鉴定方法，其特征是，第四步中，所述间隔，是指每间隔4天。8、根据权利要求1或6所述的抗白粉病黄瓜品种的鉴定方法，其特征是，第四步中，所述根据叶盘测量的平均发病面积做出抗病性鉴定，是指借助40倍解剖镜为辅助观察工具，按照叶盘发病面积10%为梯度，0:未发病，100%:叶盘上布满白粉病菌丝，设定发病面积小于20%为抗病，大于20%为感病，一个品种可取多个叶盘，叶盘测量的平均发病面积对应的病情梯度为该品种的病情梯度，并依此做出抗病性鉴定。全文摘要本发明公开了一种农业
技术领域：
的抗白粉病黄瓜品种的鉴定方法。步骤为第一步，使用不锈钢打孔器在黄瓜幼苗或成株采集取叶盘，对叶盘进行消毒；第二步，采用喷雾接种法对叶盘进行接种；第三步，接种后，将叶盘放置于放有两层滤纸的培养皿内；第四步，将培养皿放置在光照培养箱内，间隔滴加无菌水保持滤纸湿润，第12天开始调查叶盘发病情况，根据叶盘测量的平均发病面积做出抗病性鉴定。本发明鉴定结果的精确性和准确性更高，拓宽了进行抗性鉴定的时间，并可以同时在一个品种材料上同时鉴定多个白粉病生理小种，更适于遗传学的研究的特点。文档编号G01N33/48GK101236196SQ20081003399公开日2008年8月6日申请日期2008年2月28日优先权日2008年2月28日发明者何欢乐,刘龙洲,驰张,潘俊松,润蔡申请人:上海交通大学