专利名称：：黄瓜中的白粉病抗性和无坏死的制作方法黄瓜中的白粉病抗性和无坏死本发明涉及无坏死的抗白粉病黄瓜(Cwcw迈"w)植物。另外，本发明涉及获得无坏死的、抗白粉病黄瓜植物的方法。黄瓜植物(也就是植物物种黄瓜的植物)属于葫声科(Cwci/r6/"ceae)的葫,家族，例如甜瓜和南瓜。黄瓜是所述植物的可食用果实，其是圆柱形、绿色外皮的果实，由大约96%水組成。黄瓜植物已经被培育了很长时间，其是一种重要的世界范围的园艺作物。黄瓜通常在未成熟期中收获，并可用于腌渍工业或新鲜市售。白粉病是在田地和温室中的黄瓜植物中已知的主要真菌疾病之一。白粉病可由单丝壳菌(i^AaerofAeca/*w//g//2ea)(Schlecht.exFr.)(最近4皮重新命名为囊壳菌(尸ocTos/7力aerafa/7f力//))和/或二孑包白粉菌(Erysiphecichoracearum)DC(exM6ratemend.Salm)(最近#皮重新命名为Co/oF//20/z//cesc/c力oracearw迈)引起。在温室培育中，白粉病主要由第一种引起。所述真菌主要发生在叶上，叶在展开后2-3周最易感。然而，在严重感染的植物中，所述真菌也出现在茎和甚至是果实上。严重感染的叶变得干燥易碎，或者枯萎并死亡。因为此感染，果实在尺寸上更小，在数量上更少，更不易成功储存，被阳光灼伤，不完全成熟，以及风味不佳。植物也倾向于更易受其他病原体的伤害。最终，植物死亡。至今，应用杀真菌剂和使用具有一定真菌抗性的品种是疾病控制的主要方法。因此，已经在多种商业培育品种中证明了抗这两种真菌的抗性。已经证明下胚轴抗性是基于隐性基因(s)，而叶抗性是由显性叶基因(R)所控制的。这两种基因都是在整个植物水平的高水平抗性所必需的(Shanmugasundaram，etal.，Phytopathology61:1218-1221，1971)。然而，白粉病(PM)抗性品种通常在低光照条件下遭受坏死(即，植物暴露于光的条件是植物接受低于2000J/cm2能量-每天少于286J/cm2)，特别是与高果实负载組合，即每节上至少一个处于可收获的阶段的完全发育的果实。这种条件经常发生在秋天、冬天和早春，特别是在北欧国家和加拿大的产区。抗白粉病抗性与植物坏死相关的事实严重限制了这些白粉病抗性植物的实际应用。与黄瓜中白粉病抗性相关的坏死的症状开始于叶的主脉之间的变黄(萎黄病)，最终导致坏死(即叶的死亡)。已经证明了霉病抗性和坏死敏感性的正相关，其得到如下结论2种特征是遗传紧密相关的，或者坏死是一种或多种所述抗性基因的多效结果。在EP1433378中，描述了一种黄瓜品系(DC-1)的白粉病抗性和叶坏死之间的遗传联系的断裂。然而，与坏死现象相关的白粉病抗性的遗传控制还没有被阐明，许多黄瓜生产商仍然遭受抗白粉病黄瓜品种中发生坏死之苦。因此，黄瓜生产仍然包括使用杀真菌剂，用于作物保护以控制白粉病的感染，这不仅增加了所包括的成本，而且从健康环境的角度考虑也是不希望的。为了减少杀真菌剂的使用，因此有必要提供对白粉病有抗性并且是无坏死的植物，或者发现用于提供这种植物的新方法。本发明的目的是提供黄瓜植物，其对白粉病感染具有抗性并且是无坏死的。由本发明通过提供在其基因组中包含坏死抑制遗传因子的抗白粉病黄瓜植物来实现这个目的，所述植物对白粉病有抗性并且是无坏死的。因此，本发明的植物对白粉病有抗性并且在低光照条件(即，植物暴露于光的条件是植物接受低于2000J/ci^能量-每天少于286J/cm2)不显示出叶坏死的症状，特别是在与高果实负载组合时。根据本发明，已经鉴定了新的坏死抑制遗传因子。另外，已经开发出了合适的分子标记物，其可用于鉴定和提供对白粉病有抗性并且是无坏死的黄瓜植物。已发现该新的遗传因子抑制白粉病相关的坏死。该坏死抑制遗传因子是半显性遗传因子，即当以杂合和纯合形式时，表型都是"无坏死"。如本发明所证明的(见下文)，EP1433378中所描述的黄瓜植物不包含所述坏死抑制遗传因子。在本发明的一个优选实施方式中，所述植物包含已知的下胚轴抗性基因(s)和叶抗性基因(R)，赋予对白粉病病原体的高水平抗性。可使用特异性连接至白#^抗性基因的特定^分子标记物来确定这些抗性基因的存在。合适的标记物是本领域公知的，并且被描述在例如W02007/053015中。因此如WO2007/053015所述，通过在所述植物中，与所述白粉病抗性基因相关联的特异单核苷酸多态性(SNP)标记物的存在来指示下胚轴抗性基因(即在W02007/053015中引述为/^-力的、负责白粉病抗性的基因组区域)的存在。通过特异单核苷酸多态性(SNP)标记物或表示为5-bp插入5-AATTT-3"的特异插入突变标记物的存在来显示叶抗性基因(即在WO2007/053015中引述为；/b-7的、负责白粉病抗性的基因组区域)的存在。可用于检测所述白粉病抗性基因存在的其他标记物是AFLP标记物E16/M50-F-194，E11/M48-F-251，E23/M38-M001,E23/M40-M003,E24/M46-M002,E24/M46-M003,E12/M48-M003，E26/M43-M003,E14/M59-F-l34和E14/M59-F-200,在W02007/053015中有更详细的描述，本文中对其引用。根据本发明，已经证明了相对所述白粉病抗性基因s和R,所述坏死抗性遗传因子位于另一个染色体上。这是通过在黄瓜染色体图谱上，分别进行所述白粉病抗性基因和所述坏死抗性基因的特异标记物的定位而完成的。在本发明的一个优选实施方式中，所述植物的基因组中的坏死抑制遗传因子也与至一种或多种DM标记物相关联，并且可通过使用一种或多种所述DM标记物来测定。通过使用DNA标记物，可简单地鉴定具有白粉病抗性和坏死抑制遗传因子的预期组合的植物，而不需要进行费时费力的坏死测试。DNA标记物可揭示遗传差异，所述差异可通过凝胶电泳和化学品(溴化乙锭)的染色来显示或者使用放射活性探针来检测，这些都是本领域技术人员已知的。根据本发明的一个优选实施方式，所述坏死抑制遗传因子与一种或多种DNA标记物相关联，并通过所述DNA标记物来鉴定，所述DM标记物选自通过SEQIDNO:1(GACTGCGTACCAATTCAA)和SEQIDNO:2(GATGAGTCCTGAGTAACCC)标识的大约65bp的笫一DNA标记物和通过SEQIDNO:3(GACTGCGTACCAATTCAC)和SEQIDNO:4(GATGAGTCCTGAGTAATCG)标识的大约123bp的第二DNA标记物。根据本发明的一个优选实施方式，通过至少一种所述DNA标记物的不存在来鉴定所述植物的基因组中所述坏死抑制遗传因子的纯合性存在。优选地，通过第一DNA标记物和第二DM标记物两者的不存在在产生本发明的研究中，证明了在抗性植物中本发明的所述特异分子标记物的不存在是所述无坏死表型的标志。因此本发明的分子标记物被称为"反，，标记物。DNA片段(等位基因)的纯合性存在与所述坏死抑制遗传因子的不存在相关，并因此是不希望的坏死表型的标志。因此，该DNA标记物的不存在是所述坏死抑制遗传因子的纯合性存在的标志，即当所述DM标记物不存在时，表示所述坏死抑制遗传因子在植物的基因组中纯合性存在。根据本发明的另一个优选实施方式，通过所述DM标记物的杂合性存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的杂合性存在。已经发现所述坏死抑制遗传因子是半显性遗传因子，即当以纯合性和杂合性形式存在时，表型是"无坏死"。因此，根据本发明的DNA标记物的杂合性存在是所述植物中所述坏死抑制遗传因子的杂合性存在的标志.可通过例如使用合适的软件，例如由Keygene开发的AFLP-QuantaWiV0(Wageningen,TheNetherlands)来确定所述DNA标记物的杂合性存在。在特别的优选实施方式中，所述植物包含衍生自黄瓜植物的坏死抑制遗传因子，所述黄瓜植物的种子于2006年2月16日已经保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209，美;掛V保藏号是PTA-7394,8本发明还涉及上文所述植物的种子和/或其他植物部分。根据本发明的植物部分是例如衍生自植物的植物细胞、花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、茎、种子、原生质体和愈伤组织。在一个优选实施方式中，本发明涉及衍生自上述植物的黄瓜果实。本发明还涉及获得无坏死的抗白粉病黄瓜植物的方法，所述方法包括向白粉病抗性植物的基因组中引入坏死抑制遗传因子。根据本发明，使用已知的技术，例如经典的育种技术和/或分子生物学技术，将所述白粉病抗性基因和所述坏死抑制遗传因子引入所述植物的基因组中。根据所述方法的优选实施方式，所述白粉病抗性基因包括已知的下胚轴抗性基因(s)和叶抗性基因(R)。如上所述，使用与所述白在。合适的标记物是本领域公知的，并且例如如上文所描述。在优选实施方式中，使用一种或多种特定的DM标记物来确定所述坏死抑制遗传因子的存在。因此，本发明提供了保证能鉴定目的植物而不需要进行任何抗性和/或坏死测试的简单可靠的方法。优选地，用于鉴定所述坏死抑制遗传因子的所述DNA标记物选自通过SEQIDN0:1(GACTGCGTACCAATTCAA)和SEQIDNO:2(GATGAGTCCTGAGTAACCC)标识的大约65bp的第一DNA标记物和通过SEQIDNO:3(GACTGCGTACCAATTCAC)和SEQIDNO:4(GATGAGTCCTGAGTAATCG)标识的大约123bp的第二DNA标记物。在一个优选实施方式中，通过至少一个所述DNA标记物的不存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的的纯合性存在。优选地，通过第一和第二DNA标记物两者的不存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的纯合性存在。根据本发明的另一个优选实施方式，通过所述DNA标记物的杂合性存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的杂合性存在。在特别的优选实施方式中，所述坏死抑制遗传因子衍生自其种子以序号PTA-7394保藏在ATCC的黄瓜植物。本发明还涉及通过上文所述方法可得到的抗白粉病黄瓜植物，所述植物是无坏死，并且也涉及所述植物的种子和/或其他植物部分和果实。另外，本发明涉及用于鉴定黄瓜植物的坏死耐受性的方法，其包括使用一种或多种DNA标记物在所述植物的基因组中检测坏死抑制遗传因子的存在，其中所述DM标记物选自通过SEQIDNO:1(GACTGCGTACCAATTCAA)和SEQIDNO:2(GATGAGTCCTGAGTAACCC)标识的大约65bp的第一DNA标记物和通过SEQIDNO:3(GACTGCGTACCAATTCAC)和SEQIDNO:4(GATGAGTCCTGAGTAATCG)标识的大约123bp的第二DNA标记物。使用本发明的方法，在黄瓜植物，并且已经在幼苗和/或秧苗中能够简单地检测坏死耐受性。在优选实施方式中，通过至少一种所述DNA标记物的不存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的纯合性存在。优选地，通过第一和第二DNA标记物两者的不存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的存在。根据本发明的另一个优选实施方式，通过所述DNA标记物的杂合性存在来鲞定所述坏死抑制遗传因子的杂合性存在。对定义的解释白粉病抗性的症状可分类如下根据本发明，白粉病(PM)抗性水平可分类如下水平1-在人工接种后，小于10%的第一真叶表面受到PM的影响，没有孢子形成，分类R/抗性；水平2=在人工接种后，10-50%的第一真叶表面受到PM的影响，有一定的孢子形成，分类IR/中等抗性；水平3=在人工接种后，大于50%的第一真叶表面受到PM的影响，有孢子形成，分类S/易感。根据本发明，坏死可分类如下水平1:叶为绿色，并且植物具有功能且发育良好(分类无坏死)；水平2:叶上出现黄斑，并且有一定的叶生长减少(分类中等水平的坏死)；水平3:带有许多黄斑的黄绿色叶，非常严重的生长问题，最终产生部分地或完全地死亡叶(坏死)和有时候甚至是植物的死亡(分类坏死)。措辞"低光照条件"涉及这样的条件，其中植物暴露于光的条件是植物接受低于2000J/cW能量-每天少于286J/cm2。在这些条件下，坏死的症状会发生在不包含本发明的坏死抑制遗传因子的植物上。根据本发明的高果实负载涉及每节上至少一个完全成熟(即处于可收获阶段)的果实的果实负载。如本发明使用的术语"坏死抑制遗传因子，，涉及决定坏死抑制特性并将坏死抑制特性从亲代传递至子代的DNA片段。根据本发明发现，所述无坏死遗传因子是半显性的，即当纯合性和杂合性存在时，都观察到无坏死表型。根据本发明的DNA标记物是指能通过简单测定法(例如PCR及其后续的电泳)鉴定的DNA序列，使得可以推断基因组的相邻片段的存在或者不存在。所述标记物例如是AFLP标记物。通过以下实施例进一步示例说明本发明。实施例在产生本发明的研究中，在黄瓜植物中鉴定了一个新的坏死抑制因子。产生白粉病下胚轴和叶抗性、坏死黄瓜(B号，见表1)X白粉病下胚轴和叶抗性、无坏死黄瓜(A号，以PTA-7394在2006年2月16日保藏在ATCC)的分离群体。使用混合分组分析法(BulkedSegregantAnalysis,BSA)(Michelmoreetal.，PNAS88:9828-98232，1991)鉴定与所述坏死抑制遗传因子相关联的AFLP标记物。与所述坏死抑制遗传因子相关联的标记物被定位在不同于包括所述白粉病抗性基因的连锁群的连锁群上。ii已知的分子生物学方法，筛选所述分离群体和繁殖系的特定组的植物上的这些标记物。在WO2007/053015中描述并在表3中标识的所述分子标记物用于确定所述白粉病抗性基因的存在/不存在。表l.坏死抑制遗传因子标记物得到不同的表型<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>+=存在标记物--不存在标记物'=根据EP1433378的植物数字l-3如上文所解释。从而明显地，在本发明的植物(A号)中，已经被鉴定与本发明的新的坏死抑制遗传因子相关联的2个DM标记物都不存在，说明所述坏死抑制遗传因子的存在，以及因此无坏死表型的存在。相反地，在B号所指的植物(抗性、坏死)和上文参考的EP1433378中描述的植物中，这2种DNA标记物都存在，说明这些植物不包括本发明的坏死抑制遗传因子。使用所述分子标记物(表3中所列)，也测试了这些植物的所述白粉病抗性基因的存在。2种标记物的分析结果总结在表2中。这些结果清楚的表明A号和B号(基因型A和B)标识的植物对所有的白粉病标记物是纯合的，并且显示出最高水平的白粉病抗性，而cv.火鹤花(即EP1433378的植物)对SEQIDN0:7和8标识的所述PM标记物是杂合的，并且显示出更低水平的白粉病抗性。死标记物的独立的分离性质。这清楚地证明了所述白粉病抗性和所述坏死抑制遗传因子是不连锁的。组合的PM/坏死幼苗测试方法植物材料在荷兰进行该实验的时间是从ll月1日至2月1日(低光照条件，<每周2000J/cn^能量-每天少于286J/cm2)。将幼苗(测试植物和对照)培养在24。C下，用沙子覆盖的蛭石中。4-5天后(子叶刚刚伸展)，将所述幼苗转移到地格(groundtable)中。对照是坏死易感的、PM抗性植物。病原体在Karaaron繁殖的单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea,Podosphaeraxanthii))品系2，是一个商购可得的Fl杂交林。表2.白粉病抗性标记物结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>接种物的制备取良好孢子形成的叶，将孢子擦除进水中；通过将接种物通过覆盖完全湿透的粗棉布的管道来对接种物过篩。通过使用在FDA(荧光双羧酸盐)染色后的UV显微镜观察来检查孢子的生存力，并且在计数后，将存活的孢子的浓度调整到大约1X105个存活的孢子Anl,用于对下胚轴的第一次接种，并且将大约5X1(T个存活的孢子/ml,用于对第一叶的第二次接种。接种移植后1-2天，接种(用喷雾器)所述幼苗。当第一叶刚伸展出时(接种(a.t.)后4-6天)，进行第二次感染。通过接种后直接湿润土壤来提高湿润度，从而刺激感染。夜间温度是18-20。C,白天温度是22-25°C。生长测量在低湿润度情况下(感染)5天后，通过每天1次或2次湿润土壤来刺激孢子形成。症状的发展在最后一次接种后大约14天，对小植物的坏死进行评分。如上文所述确定坏死的评分。在最后一次接种后大约14天，也对下胚轴和叶上的白粉病感染进行评分。如上文所述确定白粉病的评分。表3标记物序列白粉病>PMHypocotyll-SEQIDNO:5CTATCCAACAAATTACAATCAAGGCACTTCTGGAATGAGATAGTCA>PMHypocotyl2-SEQIDNO:6TGGTGTAGAACAGTTGATCACAGTTCCTACGGACTA>PM-Leafl-SEQIDNO:7CATCTTCTCTTAGGTGCCACAATCGAGAGGGTTTATCTTCATCTTTC权利要求1.抗白粉病黄瓜植物，在其基因组中包含坏死抑制遗传因子，所述植物抗白粉病并且无坏死。2.根据权利要求1的植物，其中所述植物包含下胚轴抗性基因(s)和叶抗性基因(R)。3.根据权利要求1或2的植物，其中通过一种或多种特定的标记物来确定所述抗性基因的存在，所述特定的标记物选自包含通过表3中SEQIDNO:5-8标识的核苷酸序列的标记物、以及AFLP标记物B16/M50-F-194、E11/M48-F-251、E23/M38-M001、E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46—M003、E12/M48-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134和E14/M59-F-200。4.根据权利要求1、2或3的植物，其中通过一种或多种特定的DNA标记物来确定在所述植物的基因組中所述坏死抑制遗传因子的存在。5.根据权利要求4的植物，其中通过一种或多种特定的DNA标记物来确定所述坏死抑制遗传因子的存在，所述DNA标记物选自通过SEQIDNO:l(GACTGCGTACCAATTCAA)和SEQIDNO:2(GATGAGTCCTGAGTAACCC)标识的大约65bp的笫一DNA标记物和通过SEQIDNO:3(GACTGCGTACCAATTCAC)和SEQID冊4(GATGAGTCCTGAGTAATCG)标识的大约123bp的第二DM标记物'6.根据权利要求4或5的植物，其中通过至少一种所述DNA标记物的不存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的纯合性存在。7.根据权利要求6的植物，其中通过第一DNA标记物和笫二DNA标记物两者的不存在来指示所述坏死抑制遗传因子的纯合性存在。8.根据权利要求4或5的植物，其中通过至少一种所述DNA标记物的杂合性存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的杂合性存在。9.根据权利要求8的植物，其中通过第一DNA标记物和第二DM标记物两者的茶备:jt存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的杂合性存在。10.才艮据权利要求1-9中任一项的植物，在其基因组中包含衍生自黄瓜植物的所述坏死抑制遗传因子，所述黄瓜植物的种子以保藏号PTA-7394于2006年2月16日已经保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。11.根据权利要求1-10中任一项的植物的种子和/或其他植物部分。12.来自根据权利要求1-10中任一项的植物的黄瓜果实。13.获得无坏死的、抗白粉病黄瓜植物的方法，其包括将坏死抑制遗传因子引入白粉病抗性植物的基因组中。14.根据权利要求13的方法，其中所述白粉病抗性基因包含下胚轴抗性基因(s)和叶抗性基因(R)。15.根据权利要求13或14的方法，其中通过一种或多种特定的标记物来确定所述白粉病抗性基因的存在，所述特定的标记物选自包含通过SEQIDNO:5-8标识的核苷酸序列的标记物、以及AFLP标记物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、E23/M38-M001、E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M48-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134和E14/M59-F-200。16.根据权利要求13、14或15的方法，其中使用一种或多种特定的DM标记物来确定所述坏死抑制遗传因子的存在。17.根据权利要求16的方法，其中用于确定所述坏死抑制遗传因子的存在的DNA标记物选自通过SEQIDNO:1(GACTGCGTACCAATTCAA)和SEQIDNO:2(GATGAGTCCTGAGTAACCC)标识的大约65bp的第一DNA标记物和通过SEQIDNO:3(GACTGCGTACCAATTCAC)和SEQIDNO:4(GATGAGTCCTGAGTAATCG)标识的大约123bp的第二DNA标记物。18.根据权利要求13-17中任一项妁方法，其中通过至少一种所述DNA标记物的不存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的纯合性存在。19.根据权利要求18的方法，其中通过第一DNA标记物和第二DNA标记物两者的不存在,l"定所述坏死抑制遗传因子的纯合性存在。20.根据权利要求13-17中任一项的方法，其中通过至少一种所述DM标记物的杂合性存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的杂合性存在。21.根据权利要求20的方法，其中通过第一DNA标记物和第二DM标记物两者的杂合性存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的杂合性存在。22.根据权利要求13-21中任一项的方法，其中所述坏死抑制遗传因子衍生自黄瓜植物，所述黄瓜植物的种子以保藏号PTA-7394已经保藏在ATCC。23.通过根据权利要求13-21中任一项的方法可得到的黄瓜植物，所述植物抗白粉病并且无坏死。24.根据权利要求23的植物的种子和/或其他植物部分。25.来自根据权利要求23的植物的黄瓜果实。26.用于在黄瓜植物中鉴定坏死耐受性的方法，其包括使用一种或多种DNA标记物在所迷植物的基因组中检测坏死抑制遗传因子的存在，其中所述DNA标记物选自通过SEQIDNO:l(GACTGCGTACCAATTCAA)和SEQIDNO:2(GATGAGTCCTGAGTAACCC)标识的大约65bp的第一DNA标记物和通过SEQIDNO:3(GACTGCGTACCAATTCAC)和SEQIDNO:4(GATGAGTCCTGAGTAATCG)标识的大约123bp的第二DNA标记物。27.根据权利要求26的方法，其中通过至少一种所述DM标记物的不存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的纯合性存在。28.根据权利要求27的方法，其中通过第一DNA标记物和第二DNA标记物两者的不存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的纯合性存在。29.根据权利要求26的方法，其中通过至少一种所述MA标记物的杂合性存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的杂合性存在。30.根据权利要求29的方法，其中通过第一DNA标记物和第二DNA标记物两者的杂合性存在来鉴定所述坏死抑制遗传因子的杂合性存在。全文摘要本发明涉及抗白粉病黄瓜植物，在其基因组中包括坏死抑制遗传因子，该植物既抗白粉病也是无坏死的。本发明还涉及获得抗白粉病和无坏死的黄瓜植物的方法，其包括将坏死抑制遗传因子引入抗白粉病的基因组中。文档编号C12N15/82GK101495639SQ200780025851公开日2009年7月29日申请日期2007年7月6日优先权日2006年7月7日发明者B·V·梵卡本,J·J·M·拉姆鲍克,J·P·马泽鲁夫,M·C·M·斯库恩马克申请人:安莎种子公司