专利名称：在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，为获得可溶性融合表达蛋白研究提供便利，具有广泛的科研价值和应用前景。
背景技术：
肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，是细菌的一种，由Escherich在1885年发现。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛、最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。肌酸激酶(Creatine Kinase, CK) (ATP -Creatine N-phosphotransferase EC2. 7. 3. 2)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，可作为研究蛋白质折叠的理想模型。肌酸激酶在心肌梗塞和骨骼肌疾病等的临床诊断方面是一个很重要的指标。由于肌酸激酶具有的重要的生理功能，所以其得到广泛关注和深入研究。斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼(Brachydanio rerio)，原产于印度、孟加拉国。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，其基因与人类87%相似，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可作为人类疾病模型。斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，能够诱导外源基因的表达，普遍应用于原核表达系统，使其表达量增高，产物稳定，具有易鉴定，易纯化的优点因此被实验室广泛应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种低温、低速、低诱导剂、高效地在大肠杆菌中使由ckmt2基因所编码蛋白可溶性表达的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，包括以下步骤1)、将导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液于M 沈°C、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为0. 15 0. 25mM,转速150 250rpm的条件下进行诱导表达4 6小时(较佳为5小时)；所述菌液的OD600nm为0. 4 0. 6 ；2)、上述步骤1)所得的诱导表达所得的产物经破碎处理后，再离心，所得的破碎后产物上清中含有可溶性的斑马鱼肌酸激酶融合蛋白。作为本发明的在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法的改进步骤2)为诱导表达所得的产物先离心，弃上清；所得的菌体中加入PBS重悬后，再经破碎处理直至未见有白色菌体(此时呈澄清的淡黄色均质溶液)；将破碎后所得的产物离心，所得的破碎后产物上清中含有可溶性的斑马鱼肌酸激酶融合蛋白。一般而言每Iml步骤1)所得的诱导表达所得的产物配用80 120yL的PBS (PBS缓冲液)进行重悬。作为本发明的在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法的进一步改进所述步骤1)为将导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液于25°C、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为0. 2mM，转速200rpm的条件下进行诱导表达5小时。在本发明中，采用诱导表达后，破碎大肠杆菌后，通过离心、加热等预处理方法，从而获得蛋白，并进行SDS-PAGE验证。本发明通过实验方法得出以下结论，证明了低温、低速、低诱导剂，能在大肠杆菌中高效使由ckmt2基因所编码的蛋白可溶性表达。此方法具有良好的效果，操作简便，可大规模使用。本发明的有益效果如下(1)本发明优化得到一种在大肠杆菌中高效的表达可溶性斑马鱼肌酸激酶蛋白的方法，解决了形成包涵体不利于蛋白活性测试的问题，同时操作起来方便快速；( 通过SDS-PAGE检测破碎后的细胞总蛋白，由该方法获得的蛋白中，溶于上清的是活性蛋白，减少包涵体蛋白变性复性过程的损失，为直接纯化、活性的检测等进一步实验提供实验材料。( 、用大肠杆菌表达斑马鱼的肌酸激酶是首次，为研究该酶在斑马鱼体内的作用以及在分子毒理学，环境毒理学等其他方面的研究提供便利。G)、在此条件下，总蛋白含量表达较高，目的蛋白较高，目的蛋白中可溶性蛋白较高。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。可溶性蛋白主要溶解在上清中，所以主要比较上清电泳检测。图1为IPTG至终浓度1福，220印111，371培养511，1和3为上清中的蛋白，2和4为沉淀中的蛋白，克隆表达的肌酸激酶融合蛋白大小在47KD左右(M表示maker，用来指示蛋白大小，M中第一条带(即M)为最小，分子量为14. 4KD，M中第五条带为45KD)，由图可见蛋白基本在沉淀中。图2为30°C培养釙沉淀电泳图，200rpm，IPTG终浓度1为0. ImM，2为0. 2mM，可见沉淀中还是有目的蛋白。该图中1和2都为沉淀中蛋白电泳结果。图3为30°C培养釙上清电泳图；200rpm，IPTG终浓度1为0. ImM，2为0. 2mM，可见上清中开始出现有目的蛋白。该图中1和2都为上清中蛋白电泳结果。
图4为上清蛋白电泳图；转速都为200rpm，5h，1为IPTG浓度为0. 4mM，2和3为IPTG浓度为0. 8mM(说明由于设置2时有气泡，所以在旁边重新上样品电泳作为3)，这三个温度都为30°C ；4为IPTG浓度为0. lmM，5为IPTG浓度为0. 2mM，这二个温度为；6为IPTG浓度为0. ImM, 7为IPTG浓度为0. 2mM,诱导温度为20°C。可见在上清都开始表达，且条带也开始变浓，在^°C，IPTG浓度为0. 2mM时上清浓度最高。图5为沉淀蛋白电泳；转速都为200rpm，5h，l为IPTG浓度为0.4mM，2为IPTG浓度为0. 8mM,这二个温度都为30°C ;3为IPTG浓度为0. ImM, 4为IPTG浓度为0. 2mM,这二个温度为;5为IPTG浓度为0. ImM, 6为IPTG浓度为0. 2mM,诱导温度为20°C。可见在上清都开始表达，且条带也开始变浓，在，IPTG浓度为0. 2mM时上清浓度最高。可见在沉淀中浓度明显还是高于上清，在上清浓度最高的其沉淀里面含量也是比较高的，可知在目的蛋白产量比较高。图6为转速都为200rpm电泳图；1、3为IPTG浓度为0. 2mM，2、4为IPTG浓度为0. lmM，l和2为16°C处理，3、4为18°C处理，都为上清，可见3有表达；5和6为16°C沉淀，5、7为IPTG浓度为0. 2mM，6、8为IPTG浓度为0. ImM，7和8为18°C处理，都为沉淀，可见7
和8沉淀还是存在有表达，但是含量明显减少。图 7 为 16°C处理，200rpm，5h ；其中 1 为 16°C、IPTG 浓度为 0. ImM，2 为 16°C、IPTG浓度为0. 2M，都为沉淀中蛋白，7和8分别是其对应上清中蛋白；3为IPTG浓度为0. 4mM,沉淀中蛋白，9为IPTG浓度为0. 4mM，上清；可见在上清和沉淀都有表达，但是沉淀比较多，不过上清浓度较30°C有提高，较同样温度处理下，上清浓度增多。4、5、6分别对应1、2、3相同处理但不加IPTG处理后的沉淀蛋白，10、11、12对应和1、2、3相同处理但不加IPTG处理后的上清中的蛋白，200rpm,釙。图 8 为 25°C处理，200rpm, 5h。1 为 25°C IPTG 浓度为 0. ImM, 2 为 25°C IPTG 浓度为0. 2mM，都为沉淀中蛋白，5到6为对应1到2，都是上清。虽然上清和沉淀都有表达，但是沉淀明显增多，其中6沉淀中目的蛋白明显少于5，在上清中则稍多。3、4对应1、2相同处理，但是不加IPTG的沉淀蛋白，7、8对应1、2相同处理，但不加IPTG的上清中的蛋白。综合浓度和实验操作如调温等方便，在25°C，IPTG浓度为0. 2M，转速200rpm为最经济高效方法。图9为镍柱纯化上清蛋白后进行west-blot检测获得的克隆的蛋白，同全鱼提取的作为对照(如图中1-6所示，为全鱼提取的蛋白做west-blot检测，共提取6条鱼做的重复，显示条带为肌酸激酶蛋白)，7-9为大肠柑橘克隆表达并且有那个镍柱纯化后的蛋白，验证克隆表达的为目的所需蛋白，因克隆表达后纯化需要，克隆蛋白上有组氨酸标签，比全鱼提取大十几KD。(m为maker，图上第4条带大小为40KD，第5条带为55KD)。
具体实施例方式以下实施例中使用的均为以构建好的表达菌种样本。实验试剂均为常用的分子生物学试剂，主要有IPTG，聚丙烯酰胺等常用试剂均购于上海生工公司，宁波新芝kientz-II D超声波破碎仪，纯化镍柱购自北京中科院过程研究所，一抗购自北京博奥森生物技术有限公司，二抗购自碧云天生物技术研究所。实施前处理操作(依次进行以下步骤)(1)提取斑马鱼totalRNA，根据下述设计的引物扩增斑马鱼ckmt2基因，引物的两端加入合适的双酶切酶切位点，对扩增后片段和质粒PETjSa同时进行双酶切、割胶回收等操作后16°C连接过夜，转化进大肠杆菌DH5ci感受态，在含kana终浓度为50μ g/ml的固体LB培养基上涂板挑斑验证，提取质粒送上海生工测序，测序验证后进行第二次转化，转化进大肠杆菌BL21感受态，在含kana终浓度为50 μ g/ml的固体LB培养基上涂板挑斑验证，同样提取质粒送上海生工测序，比对结果后对已验证的菌种，在含有终浓度为50 μ g/ml kana (卡那霉素)的LB固体培养基上划线涂板，37°C过夜。CKMT2Forward primer (弓 |物)CCGGATCCATGTTCAGTCGAGTGT,CKMT2Reserve primer (弓 |物)ATTTGCGGCCGCTTTCTTGAACTGGGAC ；加的双酶切位点为Bam HI Not I。(2)从平板中挑取1环单菌落加入5mL含有50 μ g/ml kana的LB液体培养基中。(3)放入37°C培养摇床振荡培养，220rpm培养过至OD6tltlnm约为0. 5 (0D是optical density (光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，nanodrop仪器检测)。(4)取50 μ L培养液(上述步骤(3)所得)加入5mL含有50 μ g/ml kana的LB培养基中。(5)放入37°C培养摇床振荡培养，220rpm培养至OD6tltlnm约为0. 5 (大约2到3小时)。得处理菌液(即构建好的表达菌种)。实施例1、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，依次进行以下步骤1)、取上述处理菌液2. 5ml加入IPTG至IPTG的终浓度ImM ；于220rpm，37°C，继续培养5h，收集菌液。取Iml所收集的菌液进行12000g离心lOmin，弃上清，菌体加100 μ L PBS重悬， 采用宁波新芝kientz-II D超声波破碎仪破碎，具体为于200w的功率下破碎，破碎2s, 停3s，如此反复约8分钟，此时溶液为淡黄色均质溶液澄清，未见有白色菌体，12000g离心 5min,吸取上清，使上清和沉淀分离，沉淀再加100 μ L PBS重悬。2)、如上处理后，上清和重悬后的沉淀中分别加入IOOyL 2XSDS凝胶载样缓冲液(艮P，2X SDS-PAGE Loading buffer)，混勻，沸水中煮 lOmin，后 12000rpm 离心 5min， SDS-PAGE检测，结果如图1所示，1和3为上清，2和4为沉淀，克隆表达的肌酸激酶融合蛋白大小在47KD左右(M表示maker，用来指示蛋白大小，图中第一条带(即M)为最小，分子量为14. 4KD，图中第五条带为45KD)，由图可见蛋白基本在沉淀中。实施例2、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 1福，301，200印111，继续培养釙，步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。沉淀如图2中1所示结果，上清如图3中1所示结果。由此可见沉淀中还是有目的蛋白，上清中开始出现有目的蛋白。实施例3、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 2福，301，200印111，继续培养釙，步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。沉淀如图2中2所示结果，上清如图3中2所示结果由此可见沉淀中上清中蛋白检测结果和IPTG至终浓度0. ImM检测结果相差不大。实施例4、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 4福，301，200印111，继续培养釙，步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。上清如图4中1所示结果，沉淀如图5中1所示结果。由此可见沉淀和上清中蛋白都有增加。实施例5、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 8福，301，200印111，继续培养釙，步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。上清如图4中2和3所示结果，沉淀如图5中2所示结果；由此可见沉淀和上清中蛋白都有增加。实施例6、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 1福，201，200卯111，继续培养釙，步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。上清如图4中6所示结果，沉淀如图5中5所示结果；由此可见上清和沉淀中都有目的蛋白，但是含量不高。实施例7、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 2福，201，200印111，继续培养釙，步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。上清如图4中7所示结果，沉淀如图5中6所示结果；由此可见上清和沉淀中都有目的蛋白，但是含量不高。实施例8、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 1福，观1，200印111，继续培养釙，步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。上清如图4中4所示结果，沉淀如图5中3所示结果；由此可见沉淀蛋白多于上清蛋白。实施例9、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 2福，观1，200印111，继续培养釙，步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。上清如图4中5所示结果，沉淀如图5中4所示结果。由此可见沉淀蛋白少于上清蛋白。实施例10、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 1福，161，200印111，继续培养釙，步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。上清如图6中2所示结果，沉淀如图6中6所示结果；由此可见沉淀和上清都无目的蛋白。实施例11、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 2福，161，200印111，继续培养釙，步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。
上清如图6中1所示结果，沉淀如图6中5所示结果；由此可见沉淀和上清都无目的蛋白。实施例12、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 4mM, 16°C,200rpm,继续培养釙，步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。上清为图7中9所示结果，沉淀为图7中3所示结果；由此可见上清和沉淀中出现目的蛋白，但含量都不高，且沉淀蛋白多于上清。实施例13、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 1福，181，200印111，继续培养釙，收集菌液其余同实施例1。步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。上清如图6中4所示结果，沉淀如图6中8所示结果；由此可见沉淀中有蛋白，上清中基本没有。实施例14、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 2福，181，200印111，继续培养釙，收集菌液其余同实施例1。步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。上清如图6中3所示，沉淀如图6中7所示结果；由此可见上清中出现蛋白，但沉淀还是有。实施例15、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 1福，251，200印111，继续培养釙，收集菌液其余同实施例1。步骤1)的其余内容和步骤2)同实施例1。上清如图8中1所示结果，沉淀如图8中5所示结果；由此可见总蛋白含量都有增加，沉淀蛋白稍多于上清。实施例16、在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，将步骤1)的预处理改成以下内容上述处理菌液加入IPTG至终浓度0. 2福，251，200印111，继续培养釙，收集菌液。其余同实施例1。步骤1)的其余内容和步骤幻同实施例1。上清如图8中2所示结果，沉淀如图8中6所示结果，该上清中斑马鱼肌酸激酶融合蛋白的浓度为8mg/ml。由此可见总蛋白含量都有增加，上清稍多于沉淀。对所有的实例图进行分析，bandSCan5. 0(条带分析软件)分析可溶性蛋白在总蛋白中的含量，和目的蛋白在总蛋白的含量发现，如表1，在实施例16的条件下，上清蛋白含量最多，总的目的蛋白在总蛋白含量中占近22. 4% (上清和沉淀中目的蛋白比值相加/2)， 同时对比图1-8条带总条带情况，在此条件下总蛋白含量大(颜色较深条带多)。表 权利要求
1.在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，其特征是包括以下步骤1)、将导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液于M ^rc、异丙基硫代半乳糖苷浓度为0. 15 0. 25mM，转速150 250rpm的条件下进行诱导表达4 6小时；所述菌液的0D600nm为0. 4 0. 6 ；2)、诱导表达所得的产物经破碎处理后，再离心，所得的破碎后产物上清中含有可溶性的斑马鱼肌酸激酶融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，其特征是所述步骤2)为诱导表达所得的产物先离心，弃上清；所得的菌体中加入PBS重悬后，再经破碎处理直至未见有白色菌体；将破碎后所得的产物离心，所得的破碎后产物上清中含有可溶性的斑马鱼肌酸激酶融合蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，其特征是所述步骤1)为将导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液于25°C、异丙基硫代半乳糖苷浓度为0. 2mM，转速200rpm的条件下进行诱导表达5小时。
全文摘要
本发明公开了一种在大肠杆菌中高效表达可溶性斑马鱼肌酸激酶的方法，包括以下步骤1)、将导入ckmt2基因的大肠杆菌的菌液于24～26℃、异丙基硫代半乳糖苷浓度为0.15～0.25mM，转速150～250rpm的条件下进行诱导表达4～6小时；所述菌液的OD600nm为0.45～0.55；2)、诱导表达所得的产物经破碎处理后，再离心，所得的破碎后产物上清中含有可溶性的斑马鱼肌酸激酶融合蛋白。采用本发明的方法，能在大肠杆菌中高效使由ckmt2基因所编码的蛋白可溶性表达。
文档编号C12N9/12GK102559629SQ20121003521
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者丁先锋, 赵铁军, 郭江峰, 马琴琴, 黄涵年 申请人:浙江理工大学