专利名称：致泻性大肠杆菌检测试剂盒及其检测分型方法
技术领域：
本发明属于分子生物学及微生物检测技术领域，尤其涉及一种致泻性大肠杆菌检测试剂盒及其检测分型方法。
背景技术：
大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。而某些血清型菌株具有较强的致病性，可引起腹泻，此种菌株可通过饮食导致腹泻。致泻性大肠杆菌(DEC)是细菌性腹泻的常见病原菌，它包括肠致病性大肠杆菌(enteropathogenie E.coli, EPEC)> 肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenicE.coli, ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive E.coli, EIEC)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli, EHEC)和肠粘附性大肠杆菌(enteroaggregative E.coli,EAEC)。DEC感染主要见于婴幼儿，近年来其在成人腹泻病人中的检出率有所增加，并成为部分地区致腹泻的主要病原菌，且对常用药物出现了较高的耐药性，因此受到了广泛的关注。传统的分离培养技术是DEC鉴定、检测的标准方法，但常规的细菌培养与鉴定方法不足以将各种DEC鉴别开，因为许多血清型与基因型不一致。且传统方法需要经过一系列复杂的实验步骤，检测周期长，操作繁琐，准确性低，耗时费力，无法满足临床和实际工作的需要。DEC引起的临床症状多为水样腹泻，无法从症状判读型别指导临床用药，因此这需要既能快速检测又能实现多重检测。随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术已被广泛应用于细菌的检测和分类。然而常规PCR技术的后电泳容易导致污染， 易产生假阳性，使检测结果不准确。实时定量PCR以快速、准确等突出优点被广泛应用，但目前所采用的实时定量PCR方法多为单一的荧光定量PCR方法，只能检测一种致病菌，不能满足多重检测的要求，因此效率有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种致泻性大肠杆菌检测试剂盒，旨在解决现有检测技术中检测对象单一，检测效率低，准确度不高的问题。本发明实施例是这样实现的，一种致泻性大肠杆菌检测试剂盒，包括PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，还包括以下引物和探针:针对stp基因的引物和探针:stp-F:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAAAAAGCGAGTGCACCTCGACA-3’ (SEQ ID NO:1),stp-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGTTGACTGACTAAAAGAGGGG-3’(SEQ ID NO:2)，stp-probe:5，-CGCGTCTCAAATATCCGTGAAACAACATGACGCG-3’ (SEQ ID NO:3)；针对sth基因的引物和探针:sth-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTGGTCCTGAAAGCATGAATAG-3’ (SEQ ID NO:4)，sth-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAACAAAGCAACAGGTACATACG-3，(SEQ ID NO:5),sth-probe:5’-CGCGGTGAATTGTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGCG-3’ (SEQ ID NO:6)；
针对It基因的引物和探针:lt-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAACAGGAGGTTTCTGCGTTAG-3’ (SEQ ID NO:7)，lt-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGTGGGAAACCTGCTAATCT-3’ (SEQ ID NO:8),lt-probe:5’-CGCCGGTATTACAGAAATCTGAATATAGCTCCGGCG-3’ (SEQ ID NO:9)；针对aggR基因的引物和探针:aggR-F:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAATGCAAAAGAAGAAATCAACAGT-3， (SEQ IDNO:10),aggR-R:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGAATCGTCAGCATCAGCTAC-3， (SEQ IDNO:11),aggR-probe:5’-CGGACAAAAGTAGATGCTTGCAGTTGTCCG-3’ (SEQ ID NO: 12)；针对eaeA基因的引物和探针:eaeA-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTAACCAGGCTTCGTCACA-3’ (SEQ ID NO: 13)，eaeA-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGAAAAAACGCTGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 14)，eaeA-probe:5，-CCCAGTGGTAATAACTTTGACGGTAGTTCACTGGG-3，(SEQ ID NO: 15)；针对escV基因的引物和探针:escV-F:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3’ (SEQ IDNO:16)，escV-R:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGGAAAGAAGTTAGTTCAAGAGGAT-3’ (SEQ IDNO:17)，escV-probe:5，-CCCGCGCAACAGTTGTGGTGGATATCATTATCGCGGG-3， (SEQ ID NO:18)；针对stxl基因的引物和探针:stxl-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAASAGCGGTTACATTGTCTGGT-3，(SEQ ID NO:19)，stxl-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACTGCGTCAGTGAGGTTCCA-3’ (SEQ ID NO:20)，stxl-probe:5，-CCGCGTACGGGGATGCAGATAAATCGCGG-3’ (SEQ ID NO:21)；针对stx2基因的引物和探针:stx2-F: 5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACATGACAACGGACAGCAGTTA-3，(SEQ ID NO:22)，stx2-R:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAATCTGGTCATTGTATTACCACTGAA-3’ (SEQ IDNO:23)，stx2-probe:5，-CCGCCACTCACTGGTTTCATCATATCTGGCGG-3’ (SEQ ID NO:24)；针对ipaH基因的引物和探针:ipaH-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGAAAACCCTCCTGGTCCATC-3’ (SEQ ID NO:25)，ipaH-R:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTT-3， (SEQ IDNO:26)，ipaH-probe:5，-CCCGGCTGGAGGACATTGCCCGGG-3’ (SEQ ID NO:27)；其中各条探针序列5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团；该检测试剂盒还包括如下Homo-tag:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3，(SEQ ID NO:28)。本发明实施例的另一目的在于提供一种致泻性大肠杆菌检测和分型方法，该检测和分型方法利用本发明的致泻性大肠杆菌检测试剂盒，步骤如下:
获得并处理样品，加入至致泻性大肠杆菌检测试剂盒中，进行荧光定量PCR反应，获得检测结果。本发明提供的致泻性大肠杆菌检测试剂盒及其检测方法，根据目前国际上对致泻性大肠杆菌的五种分类(肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠粘附性大肠杆菌(EAEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和肠出血性大肠杆菌(EHEC))设计同源加尾引物和改良分子信标探针，利用实时荧光定量PCR技术，对五种致泻性大肠杆菌同时进行检测和分型，本发明的检测方法特异性好，灵敏度高，操作简便，结果易于判读，避免了假阳性的出现，适用于对致泻性大肠杆菌的快速筛查和分型。
具体实施例方式为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供一种基于改进的荧光定量PCR技术的致泻性大肠杆菌检测试剂盒，包含PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，同时该检测试剂盒还包括以下引物和探针:针对stp基因的引物和探针:stp-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAAAAAGCGAGTGCACCTCGACA-3’ (SEQ ID NO:1),stp-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGTTGACTGACTAAAAGAGGGG-3’(SEQ ID NO:2)，stp-probe:5， -CGCGTCTCAAATATCCGTGAAACAACATGACGCG-3’ (SEQ ID NO:3)；针对sth基因的引物和探针:sth-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTGGTCCTGAAAGCATGAATAG-3’ (SEQ ID NO:4)，
sth-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAACAAAGCAACAGGTACATACG-3’ (SEQ ID NO:5)，sth-probe:5，-CGCGGTGAATTGTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGCG-3’ (SEQ ID NO:6)；针对It基因的引物和探针:lt-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAACAGGAGGTTTCTGCGTTAG-3’ (SEQ ID NO:7)，lt-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGTGGGAAACCTGCTAATCT-3，(SEQ ID NO:8)，lt-probe:5，-CGCCGGTATTACAGAAATCTGAATATAGCTCCGGCG-3’ (SEQ ID NO:9)；针对aggR基因的引物和探针:aggR-F:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAATGCAAAAGAAGAAATCAACAGT-3， (SEQ IDNO:10),aggR-R:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGAATCGTCAGCATCAGCTAC-3， (SEQ IDNO:11),aggR-probe:5’-CGGACAAAAGTAGATGCTTGCAGTTGTCCG-3’ (SEQ ID NO: 12)；针对eaeA基因的引物和探针:eaeA-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTAACCAGGCTTCGTCACA-3’ (SEQ ID NO: 13)，eaeA-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGAAAAAACGCTGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 14)，eaeA-probe:5，-CCCAGTGGTAATAACTTTGACGGTAGTTCACTGGG-3，(SEQ ID NO: 15)；
针对escV基因的引物和探针:escV-F:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3’ (SEQ IDNO:16)，escV-R:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGGAAAGAAGTTAGTTCAAGAGGAT-3’ (SEQ IDNO:17)，escV-probe:5，-CCCGCGCAACAGTTGTGGTGGATATCATTATCGCGGG-3， (SEQ ID NO:18)；针对stxl基因的引物和探针:stxl-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAASAGCGGTTACATTGTCTGGT-3，(SEQ ID NO:19)，stxl-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACTGCGTCAGTGAGGTTCCA-3’ (SEQ ID NO:20)，stxl-probe:5，-CCGCGTACGGGGATGCAGATAAATCGCGG-3，(SEQ ID NO:21)；针对stx2基因的引物和探针: stx2-F: 5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACATGACAACGGACAGCAGTTA-3，(SEQ ID NO:22)，stx2-R:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAATCTGGTCATTGTATTACCACTGAA-3’ (SEQ IDNO:23)，stx2-probe:5，-CCGCCACTCACTGGTTTCATCATATCTGGCGG-3’ (SEQ ID NO:24)；
针对ipaH基因的引物和探针:ipaH-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGAAAACCCTCCTGGTCCATC-3’ (SEQ ID NO:25)，ipaH-R:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTT-3， (SEQ IDNO:26)，ipaH-probe:5，-CCCGGCTGGAGGACATTGCCCGGG-3’ (SEQ ID NO:27)；以及Homo-tag:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3，(SEQ ID NO:28)，其中上述探针序列SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 12、SEQID NO: 15,SEQ ID NO: 18,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:27 的 5’ 端连接有荧光
基团，3’端连接有淬灭基团。具体地，连接至探针5’端的荧光基团可发出荧光信号，连接至探针3’端的淬灭基团可以抑制荧光基团发出的荧光信号，在荧光定量PCR反应过程中，淬灭基团与荧光基团分离，荧光基团可以发出荧光信号，通过检测荧光信号的积累可以对未知模板进行定量分析。其中，上述连接于5’端的荧光基团可以为FAM、HEX、R0X或Cy5，上述连接于3’端的淬灭基团可以为DABCYL或BHQ，优选为DABCYL。具体地，在本发明实施例的检测试剂盒中，上述9组引物和探针分装至两个反应管体系中，其中第一反应管体系中包含针对Stp，sth, It, aggR四种基因的引物和探针，gpSEQ ID NOil-SEQ ID NO: 12，该反应管体系用于肠产毒性大肠杆菌(ETEC)和肠粘附性大肠杆菌(EAEC)的检测分型，且其中四种探针序列SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:6、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 12的5’端的荧光基团分别为FAM、HEX、ROX和Cy5 ;第二反应管体系包含针对eaeA、escV、stxl、stx2 和 ipaH 五种基因的引物和探针，即 SEQ ID N0:13_SEQ ID N0:27,用于肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和肠出血性大肠杆菌(EHEC)的检测分型，其中五种探针序列 SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 18,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:24,SEQ ID N0:27的5’端的荧光基团选自FAM、HEX、R0X和Cy5，其中有两条探针使用同一种荧光基团，另外三条对应于其他三种荧光基团。通过上述组合，使得两种反应管体系分别构成四重反应体系和五重反应体系，即第一反应管体系中包括四组引物探针，第二反应管体系中包括五组引物探针，分成两个反应管体系使得检测结果更易识别，减少了相互干扰，提高了检测准确度。更具体地，上述第一反应管体系的引物和探针所针对的基因中，stp，sth, It用于检测ETEC，aggR用于检测EAEC ;在上述第二反应管体系的引物和探针所针对的基因中，eaeA和escV用于检测EPEC和EHEC，同时stxl和stx2用于检测EHEC，由此结合上述EPEC和EHEC的检测结果可对EPEC和EHEC进行检测分型，而ipaH用于检测EIEC。具体地，本发明的致泻性大肠杆菌检测试剂盒的两个反应管体系中都包括Homo-tag 序列(SEQ ID NO: 28),该 Home-tag 序列与上述 stp, sth, It, aggR, eaeA, escV,stxl,stx2和ipaH九种基因的各对引物(即加尾引物)的标签部分序列相同。该Homo-tag序列系统可有效地抑制引物二聚体的产生，减小多重PCR体系中各基因间扩增效率的差异，提高定量的精确度。具体地，本发明实施例的致泻性大肠杆菌检测试剂盒的第一和第二反应管体系中均包含PCR反应缓冲液、MgCl2, dNTP、DNA聚合酶，其中MgCl2的工作浓度为2-4mmol，优选为3mmol ；dNTP的浓度为0.1-0.3mmol，优选为0.2mmol ；DNA聚合酶浓度为0.8-1.2U，优选为IU0在本发明实施例中使用的DNA聚合酶可使用任何适用于荧光定量PCR反应的DNA聚合酶，优选为rTaq酶。在本发明实施例的致泻性大肠杆菌检测试剂盒中，第一反应管体系中各对引物，即 SEQ ID NO:1 与SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4与SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:7与SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10与SEQ ID NO: 11的工作浓度范围均优选为0.2-0.3 μ mol，各条探针，即SEQID NO:3,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 12 的浓度范围均优选为0.2-0.25 μ mol。
在本发明实施例的致泻性大肠杆菌检测试剂盒中，第二反应管体系中各对引物，即 SEQ ID NO: 13 与 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16 与 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19 与 SEQID NO:20、SEQ ID NO:22 与 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25 与 SEQ ID NO:26 的浓度范围均优选为 0.3-0.5 μ mol，各条探针，即 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 21、SEQ IDN0:24和SEQ ID NO:27的浓度范围均优选为0.2-0.24 μ mol。在本发明实施例的致泻性大肠杆菌检测试剂盒中，第一和第二反应管体系中均包含Home-tag序列，该Home-tag序列浓度优选为0.5-1.0 μ mol,更优选为0.5 μ mol。本发明实施例还提供一种致泻性大肠杆菌检测和分型方法，该检测和分型方法利用本发明的致泻性大肠杆菌检测试剂盒进行，该方法包括以下步骤:SOl获得样品并进行提取核酸处理，然后加入至本发明的致泻性大肠杆菌检测试剂盒中；S02在荧光PCR仪上进行荧光定量PCR反应；S03获得检测结果并进行分析。具体地，本发明实施例的致泻性大肠杆菌检测和分型方法可使用25μ L反应体系或其他体积的反应体系进行检测和分型。其中，对于25 μ LPCR反应体系，模板(即待检测样品)加入量为5 μ L，对于其他体积的PCR反应体系，可对模板加入量进行等比例调节。
具体地，对于上述步骤S01，其中所述样品不限于任何检测样品，只要能对其中的核酸进行提取即可进行检测及分型。且其中提取核酸可以采用水煮法使菌体破裂而获得DNA，但不限于此。在步骤S02中，PCR反应程序为:95°C 预变性 3min ；95°C变性 10s，58°C退火 20s，72°C延伸 15s，共 5 个循环；95°C变性 10s，55°C退火 20s，72°C延伸 15s，共 40 个循环。在步骤S03中，对荧光定量PCR反应体系的荧光强度进行测量分析，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准，其中O < Ct < 35为阳性，Ct ^ 38或为O时判断为阴性，Ct值在35至38之间时，在35 < Ct < 38且有明显指数扩增判断为阳性，否则为阴性。本发明实施例的荧光定量PCR检测和分型方法可对待检测样本中的致泻性大肠杆菌的存在进行检测 并对其分型，利用该检测及分型结果，还可广泛用于临床及实验室中对于致泻性大肠杆菌的分析和研究，还可用于对于食品等的致泻性大肠杆菌的检测，以防止食品污染，避免由此引起的腹泻。本发明实施例的荧光定量PCR检测和分型方法特异性好，灵敏度高，操作简便，结果易于判读。以下结合具体实施方式
对本发明的致泻性大肠杆菌检测试剂盒及检测方法进行详细阐述。实施例一致泻性大肠杆菌检测试剂盒的制备1.合成针对 stp, sth, It, aggR, eaeA, escV, stxl, stx2 和 ipaH 九种基因的引物和探针，即SEQ ID NOil-SEQ ID NO:27，其中各探针序列3’端均连接有DABCYL，各条探针序列对应的荧光基团如下:SEQ ID NO: 3 对应于 HEX，SEQ ID NO:6 对应于 FAM，SEQ ID NO:9 对应于 ROX，SEQID勵:12对应于〇丫5，SEQ ID NO: 15 对应于 Cy5，SEQ ID NO: 18 对应于 HEX，SEQ ID N0:21 对应于 R0X，SEQ ID NO: 24 对应于 ROX，SEQ ID NO: 27 对应于 FAM ；合成Homo-tag序列(SEQ ID NO: 28),均制备成50 μ M浓度的储存液；2.分别制备PCR缓冲液，MgCl2溶液，dNTP溶液，rTaq酶溶液；3.取PCR反应八联管，向其中加入PCR缓冲液，MgCl2溶液，dNTP溶液，rTaq酶溶液，使其在25 μ L体系中符合以下最终浓度要求:MgCl2 3mmoldNTP 0.2mmolrTaq 酶 IU，并向其中分别加入0.25 μ L的Homo_tag(50 μ Μ),该Homo-tag在25 μ L反应体系中最终浓度为0.5 μ mol ；4.将步骤3获得的八联管分成两组:A组和B组，其中A组中加入针对stp，sth,lt，aggR四种基因的引物和探针，即SEQ ID N0:1-SEQ ID NO: 12，其中各对引物，即SEQID NO:1 与 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4 与 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 与 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10与SEQ ID NO: 11在25 μ I体系中的最终浓度均为0.3 μ mol，各条探针，SPSEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 12 在 25 μ I 体系中的最终浓度均为0.2 μ mol ；向B组中加入针对eaeA、escV、stxl、stx2和ipaH五种基因的引物和探针，即 SEQ ID N0:13-SEQ ID NO: 27，其中各对引物，即 SEQ ID NO: 13 与 SEQ ID NO: 14,SEQ IDNO:16 与 SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19 与 SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22 与 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO: 25与SEQ ID NO: 26在25 μ I体系中的最终浓度均为0.5 μ mol，各条探针，SPSEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24 和 SEQ ID N0:27 在 25μ1 体系中的最终浓度均为0.2 μ mol ；5.向上述步骤4中获得的A组管和B组管中分别加入去离子水使反应混合物体积为 20 μ I ;6.组装制得致泻性大肠杆菌检测试剂盒。实施例二1.合成针对 stp, sth, It, aggR, eaeA, escV, stxl, stx2 和 ipaH 九种基因的引物和探针，即SEQ ID NOil-SEQ ID NO: 27，其中各探针序列3’端均连接有BHQ，各条探针序列对应的荧光基团如下:SEQ ID NO:3 对应于 FAM，SEQ ID NO:6 对应于 ROX，SEQ ID NO:9 对应于 Cy5，SEQID NO: 12 对应于 HEX，SEQ ID NO: 15 对应于 FAM，SEQ ID NO: 18 对应于 FAM，SEQ ID NO: 21 对应于 Cy5，SEQ ID NO: 24 对应于 HEX，SEQ ID NO: 27 对应于 ROX ；合成Homo-tag序列(SEQ ID NO: 28)，均制备成50 μ M浓度的储存液；2.分别制备PC R缓冲液，MgCl2溶液，dNTP溶液，rTaq酶溶液；3.取PCR反应八联管，向其中加入PCR缓冲液，MgCl2溶液，dNTP溶液，rTaq酶溶液，使其在25 μ L体系中符合以下最终浓度要求:MgCl2 2mmo1dNTP 0.3mmolrTaq 酶 1.2U,并向其中分别加入0.3μ L的Homo-tag (50 μ M)，该Homo-tag在25 μ L反应体系中最终浓度为0.6 μ mol ；4.将步骤3获得的八联管分成两组:A组和B组，其中A组中加入针对stp，sth,lt，aggR四种基因的引物和探针，即SEQ ID N0:1-SEQ ID NO: 12，其中各对引物，即SEQID NO:1 与 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4 与 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 与 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10与SEQ ID NO: 11在25 μ I体系中的最终浓度均为0.2 μ mol，各条探针，SPSEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 12 在 25 μ I 体系中的最终浓度均为0.25 μ mol ;向B组中加入针对eaeA、escV、stxl、stx2和ipaH五种基因的引物和探针，即 SEQ ID N0:13-SEQ ID NO: 27，其中各对引物，即 SEQ ID NO: 13 与 SEQ ID NO: 14,SEQ IDNO:16 与 SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19 与 SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22 与 SEQ ID NO:23、SEQ ID N0:25与SEQ ID N0:26在25 μ I体系中的最终浓度均为0.3 μ mol，各条探针，SPSEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24 和 SEQ ID N0:27 在 25μ1 体系中的最终浓度均为0.24 μ mol ；5.向上述步骤4中获得的A组管和B组管中分别加入去离子水使反应混合物体积为 20 μ I ;
6.组装制得致泻性大肠杆菌检测试剂盒。实施例三特异性分析获得204株涉及肠杆菌、球菌、弧菌等细菌，利用实施例一的检测试剂盒进行特异性实验并以阳性菌株作为对照，检测菌株的情况见表1，其中检测结果均为阴性。表I特异性分析结果
权利要求
1.一种致泻性大肠杆菌检测试剂盒，包括PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，其特征在于，还包括以下9组引物和探针: 针对stp基因的引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2以及探针SEQ ID N0:3, 针对sth基因的引物对SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5以及探针SEQ ID N0:6, 针对It基因的引物对SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8以及探针SEQ ID N0:9, 针对aggR基因的引物对SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11以及探针SEQ ID NO: 12, 针对eaeA基因的引物对SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14以及探针SEQ ID NO: 15, 针对escV基因的引物对SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17以及探针SEQ ID NO: 18, 针对stxl基因的引物对SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20以及探针SEQ ID NO:21, 针对stx2基因的引物对SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23以及探针SEQ ID NO:24, 针对ipaH基因的引物对S EQ ID NO:25和SEQ ID NO:26以及探针SEQ ID NO:27, 其中各条所述探针5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团； 该检测试剂盒还包括序列为SEQ ID NO:28的Homo-tag。
2.如权利要求1所述的致泻性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述9组引物和探针分装至两个反应管体系中，使 SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 12 与 SEQ ID N0:13_SEQ ID NO: 27分隔开。
3.如权利要求1所述的致泻性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为rTaq 酶。
4.如权利要求1所述的致泻性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述MgCl2的工作浓度为2-4mmol，所述dNTP的工作浓度为0.1-0.3mmol，所述DNA聚合酶工作浓度为0.8-1.2U。
5.如权利要求1所述的致泻性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述引物序列SEQID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ IDNO: 10和SEQ ID NO: 11的工作浓度范围为0.2-0.3 μ mol，所述探针序列SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 12 的工作浓度范围为 0.2-0.25 μ mol ;所述引物序列 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ IDNO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID N0:25 和 SEQ ID NO:26 的工作浓度范围为0.3-0.5 μ mol，所述探针序列 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 27的工作浓度范围为0.2-0.24 μ mol。
6.如权利要求1所述的致泻性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述Home-tag序列工作浓度为0.5-1.0 μ mol。
7.如权利要求1所述的致泻性大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX和Cy5，所述淬灭基团选自DABCYL和BHQ。
8.一种致泻性大肠杆菌检测和分型方法，包括如下步骤: 获得并处理样品，加入至致泻性大肠杆菌检测试剂盒中， 进行荧光定量PCR反应， 获得检测结果， 其特征在于，所述荧光定量PCR反应利用如权利要求1-7中任一项所述的致泻性大肠杆菌检测试剂盒进行。
9.如权利要求8所述的致泻性大肠杆菌检测和分型方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的反应程序为: 95°C预变性3min ； 95°C变性10s，58。。退火20s，72。。延伸15s，共5个循环； 95°C变性10s，55°C退火20s，72°C延伸15s，共40个循环。
10.如权利要求8所述的致泻性大肠杆菌检测和分型方法，其特征在于，所述获得检测结果步骤中判定结果的方式如下: O< Ct彡35为阳性， Ct彡38或为O时判断为阴性， Ct值在35至38之间时，在35 < Ct < 38且有明显指数扩增判断为阳性，否则为阴性。
全文摘要
本发明适用于分子生物学及微生物检测技术领域，提供一种致泻性大肠杆菌检测试剂盒及检测和分型方法，该检测试剂盒包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，还包括stp、sth、lt、aggR、eaeA、escV、stx1、stx2、ipaH基因的引物及探针SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:27，还包括序列为SEQ ID NO:28的Homo-tag。该检测和分型方法包括以下步骤获得并处理样品，加入至检测试剂盒中；进行荧光定量PCR反应；获得检测结果。本发明的检测和分型方法特异性好，灵敏度高，操作简便，结果易于判读，适用于对致泻性大肠杆菌的快速筛查和分型。
文档编号C12Q1/10GK103215358SQ20131012354
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月10日 优先权日2013年4月10日
发明者扈庆华, 石晓路, 李迎慧, 林一曼, 邱亚群, 陈琼城, 陈清凉, 姜伊祥 申请人:深圳市疾病预防控制中心