专利名称：萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域的发酵方法，具体地，涉及一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法。
背景技术：
红曲霉菌(Monascus sp)固态发酵生产的红曲米是我国传统的食品色素添加剂，也是一种传统的中药，在我国已经有一千多年的使用历史。当今采用现代微生物液态深层发酵技术生产红曲红色素，该色素作为食品色素添加剂在东亚国家广泛使用，如中国、日本、韩国、台湾、泰国、越南等。自从发现了红曲霉菌发酵生产红曲色素也产生具有神经毒性和肾毒性的副产物桔霉素以来，红曲红色素在欧美生产已经禁止生产和销售。特别地，红曲色素产品是红曲红色素、红曲红色素、红曲橙色素组成的混合物。除东亚一些国家制定了红曲红色素的国家标准允许其生产和销售外，红曲黄色素和红曲橙色素还没有出台相应的国家标准。为了保障食品安全，红曲色素产品中控制副产物的含量，特别是具有毒副作用的桔霉素的含量，一直是食品微生物的重要研究内容。在发酵过程中，利用现代生物技术手段改造微生物菌株以抑制桔霉素的形成从技术上具有可行性，但是基因工程改造微生物所获得的发酵产品属于基因工程食品。由于食品安全的特殊性，基因工程食品在很多国家获得生产、销售的许可权是非常繁琐和困难的。采用发酵工程技术并结合下游分离技术降低桔霉素的含量成为重要的手段，如调节溶氧等操作参数。微生物次级代谢产物的形成强烈地依赖于发酵条件。在红曲霉菌的发酵过程中，调节发酵介质的PH可以改变红曲色素中各色素组分的分率。在近中性pH条件下，红曲红色素的分率较高，这和传·统工艺采用大米发酵红曲米一致。降低发酵液的PH使红曲橙色素和红曲黄色素的分率相应增加，导致色素颜色变黄。2012年广东“盐煽鸡”食品风波就是因为添加了红曲黄色素。虽然红曲黄色素的安全性得到了国内外研究的证实，但是PH变化对红曲霉菌代谢副产物形成的影响却缺乏研究。部分学者从红曲黄色素本身的安全性推断红曲黄色素产品的安全性，因副产物(如桔霉素、洛伐他仃等)含量和毒性难以得到确凿的证据，不能让消费者信服，也难以得到国家食品管理机构的认可。为了满足市场对红曲黄色素的需求，同时保障食品安全，迫切需要开发桔霉素含量低、红曲色素中色素组分相对单一的红曲霉菌发酵技术。经对现有技术文献的检索发现，Zhiqiang Hu, Xuehong Zhang, Zhenqiang ffu, Hanshi Qi, Zhilong Wang.Export ofintracellular Monascus pigments by two-stage microbial fermentation in nonionicsurfactant micelle aqueous solution.Journal of biotechnology，2012，162:202—209.(胡志强，张雪洪，吴振强，齐翰实，王志龙.“在非离子表面活性剂胶束溶液中应用两段发酵技术释放胞内红曲色素《生物技术学报》，2012，162 =202-209)中介绍，红曲霉菌在非离子表面活性剂胶束溶液中发酵能将胞内红曲色素分泌到细胞外环境，实现了将胞内产物萃取发酵到胞外表面活性剂胶束溶液。但是，不同的发酵培养基和发酵方式对红曲色素组成分率的影响，尤其是对副产物桔霉素形成的影响，还没有研究报道。在进一步的检索中，还没有关于在表面活性剂胶束溶液中萃取发酵与调控pH相结合实现控制色素组成和桔霉素含量的文献报道。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，该方法应用萃取发酵与调控PH技术开发桔霉素含量低的水溶性/疏水性红曲红色素、疏水性红曲橙色素、疏水性红曲黄色素等系列红曲色素产品。本发明提供一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，所述方法通过萃取发酵技术与调控PH技术相结合，制备桔霉素含量低且红曲色素组分相对单一的红曲色素；所述方法包括如下步骤:步骤1，红曲霉菌在种子培养基中进行培养，得种子液，所述的红曲霉菌为中国工业微生物菌株保藏中心提供(Monascus anka, CICC5013)；步骤2，为了保护调节pH可以控制红曲色素的组成，同时可以在低pH条件下控制桔霉素的形成，将所述种子液接种到含氮源的发酵培养液中，进行发酵培养，调节发酵培养液的PH值，离心，得红曲霉菌湿细胞；取红曲霉菌湿细胞预处理，释放胞内产物，检测发酵液pH、细胞内外的色素浓度、细胞内外的桔霉素含量；其中，所述预处理具体为:取0.5g湿细胞在等体积的发酵液70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液中浸泡I小时;步骤3，为了保护萃取发酵可以进一步控制红曲黄色素的形成，同时控制桔霉素的含量，将所述红曲霉菌湿细胞接种到含非离子表面活性剂的发酵培养基中，进行培养，调节发酵培养基的PH值，浊点萃取，分离；取部分细胞预处理，释放胞内产物，检测发酵液pH、细胞内外的色素浓度、细胞内外的桔霉素含量。优选地，所述色素浓度，其检测方法具体为:将胞外发酵液或胞内产物释放液用70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液适当吸收，采用分光光度计分布测定410、470、510nm处的吸光值。上述吸光值乘上吸收倍数得的吸光度单位分别表示黄色素、橙色素和红色素的浓度。对应地，测定样品在可见波长范围(390 540nm)的吸光度，可以检验样品对应的吸收光
-1'TfeP曰。所述桔霉素含量，其检测方法具体为:将胞外发酵液或胞内产物释放液用70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液适当吸收，采用薄层层析(默克公司硅胶F254板)，溶剂系统为醋酸:甲醇、氯仿=9:21:285，检测波长为365nm，在Rf为0.56处可以检测到桔霉素的荧光强弱。同时，在自然光下，在Rf分别为0.8,0.68和O处可以检测到红曲橙色素，红曲黄色素和红曲红色素。优选地，步骤I中，所述种子培养基由如下含量的各组分组成:7jC 100ml，蛋白胨2g，酵母粉2g，葡萄糖2g。优选地，步骤I中，所述培养在温度为30°C，200rpm的摇床中进行，培养时间为32小时。 优选地，步骤2中，所述发酵培养在温度为30°C，200rpm的摇床中进行，培养时间为5-7天。
优选地，步骤2中，所述发酵培养液的初始pH值为2.5 6，最终pH值为2.3 7。优选地，步骤3中，所述培养是指在温度为30°C，200rpm的摇床中进行，培养时间为3 4天；所述分离是指在70°C的水浴中静置2小时。优选地，步骤3中，所述发酵培养基的初始pH值为3 5，最终pH值为2.2 6.2。优选地，步骤3中，所述发酵培养基由如下含量的各组分组成:水100ml，葡萄糖 5g，KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.lg，CaCl2 0.005g，非离子表面活性剂 I 4g/100ml，氮源5g/100 15g/100ml。优选地，所述氮源包括了常用的无机氮源和有机天然氮源。所述氮源为大米粉、玉米粉、黄豆粉、谷氨酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠。优选地，本发明使用了非离子表面活性剂Triton X-100的胶束溶液实现了胞内色素的萃取发酵和浊点萃取。以硫酸铵、氯化铵等为发酵培养基的氮源，萃取发酵实现了将胞内产物萃取到胞外发酵液，且胞外色素是红曲黄色素，桔霉素含量较低。进一步实现了胞外发酵液的浊点萃取，桔霉素主要分配在表面活性剂稀相而红曲黄色素分配在表面活性剂浓相，从而在分离阶段进一步降低了表面活性剂浓相中桔霉素的含量，可以由表面活性剂浓相获得低桔霉素含量的红曲黄色素产品。优选地，本发明使用了非离子表面活性剂Triton X-100的胶束溶液实现了胞内色素的萃取发酵和浊点萃取。以硝酸钠等发酵培养基的氮源，萃取发酵实现了将胞内产物萃取到胞外发酵液，胞外色素是红曲红色素，桔霉素含量较高。进一步实现了胞外发酵液的浊点萃取，桔霉素主要分配在表面活性剂稀相而红曲红色素分配在表面活性剂浓相，从而在分离阶段进一步降低了表面活性剂浓相中桔霉素的含量，可以由表面活性剂浓相获得低桔霉素含量的红曲红色素产品。
优选地，本发明使用了非离子表面活性剂Triton X-100的胶束溶液实现了胞内色素的萃取发酵和浊点萃取。以谷氨酸钠等为发酵培养基的氮源，萃取发酵实现了将胞内产物萃取到胞外发酵液，胞外色素是水溶性红曲红色素衍生物，桔霉素含量较高。进一步浊点萃取胞外发酵液，桔霉素主要分配在表面活性剂稀相，水溶性红曲红色素衍生物在两相中具有一定的分配，但主要分配在表面活性剂浓相，从而在分离阶段进一步降低了表面活性剂浓相中桔霉素的含量，可以由表面活性剂浓相获得低桔霉素含量的水溶性红曲红色素衍生物产品(亲水性红曲红色素衍生物)。本发明采用调控pH和萃取发酵的目的在于获得组分相对单一、桔霉素含量低的系列红曲色素产品，如水溶性红曲红色素、脂溶性红曲橙色素、脂溶性红曲黄色素和脂溶性红曲红色素等。本发明采用调控pH的目的在于调节红曲色素中色素组分的分率和控制代谢副产物桔霉素的形成。本发明采用萃取发酵技术的目的在于改变红曲色素组分的分率，并将胞内色素分泌到细胞外。本发明采用萃取发酵技术将胞内产物分泌到胞外的目的在于进一步实现胞外发酵液的浊点萃取。本发明采用浊点萃取胞外发酵液的目的在于实现红曲色素与桔霉素在两相系统中的不均匀分配，进一步降低桔霉素的含量。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:本发明采用发酵及控制发酵的pH值，进而控制了红曲色素和桔霉素的形成，本发明同时应用萃取发酵技术和浊点萃取调节色素组成和去除副产物桔霉素，实现了低桔霉素含量的疏水性红曲红色素、疏水性红曲橙色素、疏水性红曲黄色素和水溶性红曲红色素(红曲红色素的谷氨酸衍生物)系列产品开发。本发明方法简单，容易实现，产率高，成本低，重复性强，环保，有较好的应用前景。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例1本实施例涉及一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，所述方法包括如下步骤:步骤I，红曲霉菌在种子培养基水(IOOml，蛋白胨2g，酵母粉2g，葡萄糖2g)中进行培养32小时，得种子液，所述的红曲霉菌为中国工业微生物菌株保藏中心提供(Monascusanka, CICC5013)；步骤2，将所述种子液接种到初始pH值为4，以硝酸钠为氮源的发酵培养液中，在温度为30°C，200rp·m的摇床中进行5天的发酵培养，调节发酵培养液的pH值，离心，得红曲霉菌湿细胞；取红曲霉菌湿细胞预处理,释放胞内产物,检测发酵液pH、细胞内外的色素浓度、细胞内外的桔霉素含量；其中，所述预处理具体为:取0.5g湿细胞在等体积的发酵液70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液中浸泡I小时;分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为2、I和1.8吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为35、25和32吸光度单位。发酵液最终pH为6.8，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明含量高，在胞内外都有明显分配，更倾向于分配在胞外发酵液。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲红色素。步骤3，将发酵培养的细胞0.5g，加入初始pH为4的发酵培养基(水100ml，葡萄糖 5g，KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.lg, CaCl2 0.005g，硫酸铵 5g/100ml、Triton X-1004g/100ml)中培养5天后，分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为65,45和22吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为25、20和15吸光度单位。发酵最终pH为2.2，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明基本不含桔霉素。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲黄色素。进一步在70度水浴中浊点萃取胞外发酵液，表面活性剂浓相中410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为120、60和20吸光度单位；表面活性剂稀相中410、470和510nm处的吸光度分别为15、8和7吸光度单位。实施效果:本实施例产品经薄层层析分析结果可得:在表面活性剂稀相能检测到桔霉素的存在，在表面活性剂浓相检测不到。实施例2本实施例涉及一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，所述方法包括如下步骤:步骤I，红曲霉菌在种子培养基(IOOml，蛋白胨2g，酵母粉2g，葡萄糖2g)中进行培养32小时，得种子液，所述的红曲霉菌为中国工业微生物菌株保藏中心提供(Monascusanka, CICC5013)；步骤2，将所述种子液接种到初始pH值为4，以谷氨酸钠为氮源的发酵培养液中，进行发酵培养7天后，调节发酵培养液的pH值，离心，得红曲霉菌湿细胞；取红曲霉菌湿细胞预处理，释放胞内产物，检测发酵液pH值、细胞内外的色素浓度、细胞内外的桔霉素含量；其中，所述预处理具体为:取0.5g湿细胞在等体积的发酵液70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液中浸泡I小时；分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为10、8和12吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为30、22和32吸光度单位。发酵液最终pH为6.5，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明含量高，在胞内外都有明显分配，更倾向于分配在胞外发酵液。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲红色素衍生物。步骤3，将发酵培养的细胞0.5g，加入初始pH为4的发酵培养基(水100ml，葡萄糖 5g，KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.lg, CaCl2 0.005g，硫酸铵 15g/100ml、Triton X-1003g/100ml)中培养3天后，分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为45,25和20吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为35、30和18吸光度单位。发酵最终pH为2.2，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明基本不含桔霉素。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲黄色素。进一步在70度水浴中浊点萃取胞外发酵液，表面活性剂浓相中410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为110、60和30吸光度单位；表面活性剂稀相中410、470和510nm处的吸光度分别为15、8和7吸光度单位。实施效果:本实施例产品经薄层层析分析结果可得:薄层层析分析能在表面活性剂稀相能检测到桔霉素的存在，在表面活性剂浓相检测不到。实施例3本实施例涉及一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，所述方法包括如下步骤:步骤I，红曲霉菌在种子培养基(IOOml，蛋白胨2g，酵母粉2g，葡萄糖2g)中进行培养32小时，得种子液，所述的红曲霉菌为中国工业微生物菌株保藏中心提供(Monascusanka, CICC5013)；步骤2，将所述种子液接种到初始pH值为6，以谷氨酸钠为氮源的发酵培养液中，进行发酵培养7天后， 调节发酵培养液的pH值，离心，得红曲霉菌湿细胞；取红曲霉菌湿细胞预处理，释放胞内产物，检测发酵液pH值、细胞内外的色素浓度、细胞内外的桔霉素含量；其中，所述预处理具体为:取0.5g湿细胞在等体积的发酵液70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液中浸泡I小时；分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为5、3和5吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为20、12和22吸光度单位。发酵液最终pH为7，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明含量高，在胞内外都有明显分配，更倾向于分配在胞外发酵液。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲红色素衍生物。步骤3，将发酵培养的细胞0.5g，加入初始pH为5.5的发酵培养基(水100ml，葡萄糖 5g，KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.lg, CaCl2 0.005g，硝酸钠 15g/100ml、Triton X-1003g/100ml)中培养4天后，分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为55,40和53吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为
15、8和12吸光度单位。发酵最终pH为6.2，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析在细胞内外明显存在桔霉素，桔霉素更倾向于分配在胞外。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲红色素。进一步在70度水浴中浊点萃取胞外发酵液，表面活性剂浓相中410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为108、80和110吸光度单位；表面活性剂稀相中410、470和510nm处的吸光度分别为5、2和5吸光度单位。实施效果:本实施例产品经薄层层析分析结果可得:薄层层析分析能在表面活性剂稀相能明显检测到桔霉素的存在，在表面活性剂浓相几乎检测不到。实施例4本实施例涉及一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，所述方法包括如下步骤: 步骤I，红曲霉菌在种子培养基(IOOml，蛋白胨2g，酵母粉2g，葡萄糖2g)中进行培养32小时，得种子液，所述的红曲霉菌为中国工业微生物菌株保藏中心提供(Monascusanka, CICC5013)；步骤2，将所述种子液接种到初始pH值为2.5，以谷氨酸钠为氮源的发酵培养液中，进行发酵培养5天后，调节发酵培养液的pH值，离心，得红曲霉菌湿细胞；取红曲霉菌湿细胞预处理，释放胞内产物，检测发酵液pH值、细胞内外的色素浓度、细胞内外的桔霉素含量；其中，所述预处理具体为:取0.5g湿细胞在等体积的发酵液70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液中浸泡I小时；分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为1、0.3和0.8吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为30、45和12吸光
度单位。发酵液最终pH为2.5，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明基本不含桔霉素。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲橙色素。步骤3，将发酵培养的细胞0.5g，加入初始pH为3.5的发酵培养基(水100ml，葡萄糖 5g，KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.lg, CaCl2 0.005g，硝酸钠 15g/100ml、Triton X-1003g/100ml)中培养4天后，分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为53,40和50吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为
14、9和12吸光度单位。发酵最终pH为6.2，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析在细胞内外明显存在桔霉素，桔霉素更倾向于分配在胞外。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲红色素。进一步在70度水浴中浊点萃取胞外发酵液，表面活性剂浓相中410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为100、80和108吸光度单位；表面活性剂稀相中410、470和510nm处的吸光度分别为5、2和5吸光度单位。实施效果:本实施例产品经薄层层析分析结果可得:薄层层析分析能在表面活性剂稀相能明显检测到桔霉素的存在，在表面活性剂浓相几乎检测不到。实施例5本实施例涉及一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，所述方法包括如下步骤:步骤I，红曲霉菌在种子培养基(IOOml，蛋白胨2g，酵母粉2g，葡萄糖2g)中进行培养32小时，得种子液，所述的红曲霉菌为中国工业微生物菌株保藏中心提供(Monascusanka, CICC5013)；步骤2，将所述种子液接种到初始pH值为6，以谷氨酸钠为氮源的发酵培养液中，进行发酵培养5天后，调节发酵培养液的pH值，离心，得红曲霉菌湿细胞；取红曲霉菌湿细胞预处理，释放胞内产物，检测发酵液pH值、细胞内外的色素浓度、细胞内外的桔霉素含量；其中，所述预处理具体为:取0.5g湿细胞在等体积的发酵液70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液中浸泡I小时；分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为5、3和5吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为20、32和18吸光度单
位。·发酵液最终pH为4，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明含量高，在胞内外都有明显分配，更倾向于分配在胞外发酵液。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲橙色素。步骤3，将发酵培养的细胞0.5g，加入初始pH为5的发酵培养基(水100ml，葡萄糖 5g, KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.lg, CaCl2 0.005g，谷氨酸钠 15g/100ml、Triton X-1003g/100ml)中培养3天后，分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为50,35和50吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为
15、10和14吸光度单位。发酵最终pH为6.2，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析在细胞内外明显存在桔霉素，桔霉素更倾向于分配在胞外。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲红色素衍生物。进一步在70度水浴中浊点萃取胞外发酵液，表面活性剂浓相中410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为90、75和98吸光度单位；表面活性剂稀相中410、470和510nm处的吸光度分别为15、12和13吸光度单位。实施效果:本实施例产品经薄层层析分析结果可得:薄层层析分析能在表面活性剂稀相能明显检测到桔霉素的存在，在表面活性剂浓相几乎检测不到。实施例6本实施例涉及一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，所述方法包括如下步骤:步骤I，红曲霉菌在种子培养基(IOOml，蛋白胨2g，酵母粉2g，葡萄糖2g)中进行培养32小时，得种子液，所述的红曲霉菌为中国工业微生物菌株保藏中心提供(Monascusanka, CICC5013)；
步骤2，将所述种子液接种到初始pH值为3.5，以谷氨酸钠为氮源的发酵培养液中，进行发酵培养6天后，调节发酵培养液的pH值，离心，得红曲霉菌湿细胞；取红曲霉菌湿细胞预处理，释放胞内产物，检测发酵液pH值、细胞内外的色素浓度、细胞内外的桔霉素含量；其中，所述预处理具体为:取0.5g湿细胞在等体积的发酵液70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液中浸泡I小时；分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为5、2.5和5吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为21、33和17吸光度单位。发酵液最终pH为3.7，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明含量高，在胞内外都有明显分配，更倾向于分配在胞外发酵液。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲橙色素。步骤3，将发酵培养的细胞0.5g，加入初始pH为3的发酵培养基(水100ml，葡萄糖 5g, KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.lg, CaCl2 0.005g，谷氨酸钠 15g/100ml、Triton X-1003g/100ml)中培养3天后，分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为60,35和20吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为25,10和8吸光度单位。发酵最终pH为3.5，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析在细胞内外存在少量桔霉素，桔霉素更倾向于分配在胞外。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲橙色素。进一步在70度水浴中浊点萃取胞外发酵液，表面活性剂浓相中410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为110、75和35吸光度单位；表面活性剂稀相中410、470和510nm处的吸光度分别为5、2和I吸光度单位。实施效果:本实施例产品经薄层层析分析结果可得:薄层层析分析能在表面活性剂稀相能明显检测到桔霉素的存在，在表面活性剂浓相几乎检测不到。实施例7本实施例涉及一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，所述方法包括如下步骤:步骤I，红曲霉菌在种子培养基(IOOml，蛋白胨2g，酵母粉2g，葡萄糖2g)中进行培养32小时，得种子液，所述的红曲霉菌为中国工业微生物菌株保藏中心提供(Monascusanka, CICC5013)；步骤2，将所述种子液接种到初始pH值为2.5，以谷氨酸钠为氮源的发酵培养液中，进行发酵培养6天后，调节发酵培养液的pH值，离心，得红曲霉菌湿细胞；取红曲霉菌湿细胞预处理，释放胞内产物，检测发酵液pH值、细胞内外的色素浓度、细胞内外的桔霉素含量；其中，所述预处理具体为:取0.5g湿细胞在等体积的发酵液70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液中浸泡I小时；分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为3、1和I吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为24、38和18吸光度单位。发酵液最 终pH为2.8，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明含量明显将低，在胞内外都有明显分配。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲橙色素。步骤3，将发酵培养的细胞0.5g，加入初始pH为5的发酵培养基(水100ml，葡萄糖 5g, KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.lg, CaCl2 0.005g，大米粉 5g/100ml、Triton X-1003g/100ml)中培养3天后，分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为54,40和51吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为
16、9和12吸光度单位。发酵最终pH为6.2，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析在细胞内外明显存在桔霉素，桔霉素更倾向于分配在胞外。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲红色素。进一步在70度水浴中浊点萃取胞外发酵液，表面活性剂浓相中410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为100、80和108吸光度单位；表面活性剂稀相中410、470和510nm处的吸光度分别为5、2和5吸光度单位。实施效果:本实施例产品经薄层层析分析结果可得:薄层层析分析能在表面活性剂稀相能明显检测到桔霉素的存在，在表面活性剂浓相几乎检测不到。实施例8本实施例涉及一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，所述方法包括如下步骤:步骤I，红曲霉菌在种子培养基(IOOml，蛋白胨2g，酵母粉2g，葡萄糖2g)中进行培养32小时，得种子液，所述的红曲霉菌为中国工业微生物菌株保藏中心提供(Monascusanka, CICC5013)；步骤2，将所述种子液接种到初始pH值为6，以谷氨酸钠为氮源的发酵培养液中，进行发酵培养6天后，调节发酵培养液的pH值，离心，得红曲霉菌湿细胞；取红曲霉菌湿细胞预处理，释放胞内产物，检测发酵液pH值、细胞内外的色素浓度、细胞内外的桔霉素含量；其中，所述预处理具体为:取0.5g湿细胞在等体积的发酵液70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液中浸泡I小时；分析胞外发酵液 410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为5、2和6吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为21、30和24吸光度单位。发酵液最终pH为4.3，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明含量高，在胞内外都有明显分配，更倾向于分配在胞外发酵液。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲橙色素。步骤3，将发酵培养的细胞0.5g，加入初始pH为5的发酵培养基(水100ml，葡萄糖 5g, KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.lg, CaCl2 0.005g，大米粉 5g/100ml、Triton X-1003g/100ml)中培养3天后，分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为54,40和51吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为
16、9和12吸光度单位。发酵最终pH为6.2，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析在细胞内外明显存在桔霉素，桔霉素更倾向于分配在胞外。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲红色素。进一步在70度水浴中浊点萃取胞外发酵液，表面活性剂浓相中410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为100、80和108吸光度单位；表面活性剂稀相中410、470和510nm处的吸光度分别为5、2和5吸光度单位。实施效果:本实施例产品经薄层层析分析结果可得:薄层层析分析能在表面活性剂稀相能明显检测到桔霉素的存在，在表面活性剂浓相几乎检测不到。实施例9
本实施例涉及一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，所述方法包括如下步骤:步骤I，红曲霉菌在种子培养基(IOOml，蛋白胨2g，酵母粉2g，葡萄糖2g)中进行培养32小时，得种子液，所述的红曲霉菌为中国工业微生物菌株保藏中心提供(Monascusanka, CICC5013)；步骤2，将所述种子液接种到初始pH值为4，以谷氨酸钠为氮源的发酵培养液中，进行发酵培养6天后，调节发酵培养液的pH值，离心，得红曲霉菌湿细胞；取红曲霉菌湿细胞预处理，释放胞内产物，检测发酵液pH、细胞内外的色素浓度、细胞内外的桔霉素含量；其中，所述预处理具体为:取0.5g湿细胞在等体积的发酵液70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液中浸泡I小时；分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为4、1.5和0.8吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为45、35和30吸光
度单位。发酵液最终pH为2.3，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明基本不含桔霉素。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲橙色素。步骤3，将发酵培养的细胞0.5g，加入初始pH为4的发酵培养基(水100ml，葡萄糖 5g, KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.lg, CaCl2 0.005g，玉米粉 15g/100ml、Triton X-1003g/100ml)中培养3天后，分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为35、15和10吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为
15、10和7吸光度单位。发酵最终pH为2.2，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明基本不含桔霉素。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲黄色素。进一步在70度水浴中浊点萃取胞外发酵液，表面活性剂浓相中410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为80、30和10吸光度单位；表面活性剂稀相中410、470和510nm处的吸光度分别为15、8和7吸光度单位。实施效果:本实施例产品经薄层层析分析结果可得:薄层层析分析能在表面活性剂稀相能检测到桔霉素的存在，在表面活性剂浓相检测不到。实施例10本实施例涉及一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，所述方法包括如下步骤:步骤I，红曲霉菌在种子培养基(IOOml，蛋白胨2g，酵母粉2g，葡萄糖2g)中进行培养32小时，得种子液，所述的红曲霉菌为中国工业微生物菌株保藏中心提供(Monascusanka, CICC5013)；步骤2，将所述种子液接种到初始pH值为4，以谷氨酸钠为氮源的发酵培养液中，进行发酵培养6天后，调节发酵培养液的pH值，离心，得红曲霉菌湿细胞；取红曲霉菌湿细胞预处理，释放胞内产物，检测发酵液PH值、细胞内外的色素浓度、细胞内外的桔霉素含量；其中，所述预处理具体为:取0.5g湿细胞在等体积的发酵液70% (V/V)的乙醇(pH=2)溶液中浸泡I小时；
分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为4、1.5和0.8吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为45、35和30吸光度单位。发酵液最终pH为6.3，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明基本不含桔霉素。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲橙色素。步骤3，将发酵培养的细胞0.5g，加入初始pH为4的发酵培养基(水100ml，葡萄糖 5g, KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.lg, CaCl2 0.005g，黄豆粉 15g/100ml、Triton X-1003g/100ml)中培养3天后，分析胞外发酵液410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为45,25和15吸光度单位；胞内色素经乙醇溶液提取后410、470和510nm处的吸光度分别为18、13和6吸光度单位。发酵最终pH为2.2，胞内外桔霉素含量经薄层层析分析表明基本不含桔霉素。薄层层析表明红曲色素主要成分是红曲黄色素。进一步在70度水浴中浊点萃取胞外发酵液，表面活性剂浓相中410、470和510nm处红曲色素的吸光度分别为90、35和15吸光度单位；表面活性剂稀相中410、470和510nm处的吸光度分别为15、8和7吸光度单位。实施效果:本实施例产品经薄层层析分析结果可得:薄层层析分析能在表面活性剂稀相能检测到桔霉素的存在，在表面活性剂浓相检测不到。本发明通过萃取发酵技术与调控pH技术相结合，实现了微生物发酵生产桔霉素含量低且红曲色素组分相对单一的水溶性/疏水性红曲红色素、疏水性红曲橙色素、疏水性红曲黄色素等系列红曲色素产品。采用萃取发酵技术，微生物在非离子表面活性剂胶束溶液中发酵培养能将胞内红曲色素释放到胞外表面活性剂胶束溶液，且在控制发酵液低pH条件下产生桔霉素含量低的胞外红曲黄色素。升高温度可以实现浊点萃取，浊点萃取能使桔霉素分配在表面活性剂稀相而红曲色素分配在表面活性剂浓相。在低pH萃取发酵时，形成桔霉素含量低的胞外黄色素发酵液，浊点萃取能进一步去除其中的桔霉素而获得桔霉素含量低的疏水性红曲黄色素。在高PH萃取发酵时，形成桔霉素含量高的水溶性/疏水性红曲红色素发酵液，浊点萃取也能去除其中的桔霉素而获得桔霉素含量低的水溶性/疏水性红曲红色素。以上是本发明·优选实施例的描述，应当理解的是，本发明的实施并不局限于上述的情形，本发明特别适合于细胞内产物的发酵过程，如细胞内微生物酶的生产、细胞内有机小分子物质的生产以及细胞内油脂类化合物的生产等，可以有效地解除胞内产物抑制，提高微生物发酵产物的浓度和调节微生物发酵次级代谢产物的组成。从而提高了微生物发酵的体积产率和提高了胞内产物发酵、产物释放等过程的效率。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
权利要求
1.一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，其特征在于，所述方法通过萃取发酵技术与调控PH技术相结合，制备桔霉素含量低且红曲色素组分相对单一的红曲色素；所述方法包括如下步骤: 步骤1，红曲霉菌在种子培养基中进行培养，得种子液； 步骤2，将所述种子液接种到含氮源的发酵培养液中，进行发酵培养，调节发酵培养液的pH值，离心，得红曲霉菌湿细胞； 步骤3，将所述红曲霉菌湿细胞接种到含非离子表面活性剂的发酵培养基中，进行培养，调节发酵培养基的PH值，浊点萃取，分离，即可。
2.根据权利要求1所述的萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，其特征在于，步骤2中，所述发酵培养液的最终pH值为2.5以下时，微生物发酵产生红曲橙色素，且桔霉素含量低。
3.根据权利要求1或2所述的萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，其特征在于，步骤2中，所述发酵培养液的初始pH值为2.5 6，最终pH值为2.3 7。
4.根据权利要求1所述的萃取发酵和调控PH制备红曲色素的方法，其特征在于，步骤3中，所述发酵培养基的最终pH值为2.5以下时，微生物发酵产生红曲黄色素，且桔霉素含量低。
5.根据权利要求1或4所述的萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，其特征在于，步骤3中，所述发酵培养基的初始pH值为3 5，最终pH值为2.2 6.2。
6.根据权利要求1或4所述的萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，其特征在于，步骤3中，所述培养是指 在温度为30°C，200rpm的摇床中进行，培养时间为3 4天；所述分离是指在70°C的水浴中静置2小时。
7.根据权利要求1所述的萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，其特征在于，步骤3中，所述发酵培养基中由如下含量的各组分组成:水100ml，葡萄糖5g，KH2PO4 0.4g，MgSO4 0.lg，CaCl2 0.005g，非离子表面活性剂 I 4g/100ml，氮源 5g/100 15g/100ml。
8.根据权利要求1或7所述的萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，其特征在于，所述氮源为大米粉、玉米粉、黄豆粉、谷氨酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠。
9.根据权利要求1或7所述的萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂为Triton X-100。
全文摘要
本发明提供了一种萃取发酵和调控pH制备红曲色素的方法，包括如下步骤步骤1，红曲霉菌在种子培养基中进行培养，得种子液；步骤2，将所述种子液接种到含氮源的发酵培养液中，进行发酵培养，调节发酵培养液的pH值，离心，得红曲霉菌湿细胞；步骤3，将所述红曲霉菌湿细胞接种到含非离子表面活性剂的发酵培养基中，进行培养，调节发酵培养基的pH值，浊点萃取，分离，即可。本发明采用调节发酵的pH值，控制红曲色素和桔霉素的形成，同时应用萃取发酵和浊点萃取调节色素组成去除副产物桔霉素，制得桔霉素含量较低的红曲红色素。本发明方法简单，容易实现，产率高，成本低，重复性强，环保，有较好的应用前景。
文档编号C12P1/02GK103224958SQ20131012351
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月10日 优先权日2013年4月10日
发明者王志龙, 康碧玉 申请人:上海交通大学