本发明属于细胞生物学、生物化学和分子生物学等技术领域，特别涉及一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法。
背景技术：
拟南芥(Arabidopsis thaliana)，又名鼠耳芥，是目前已知植物基因组中最小的，也是一种应用十分广泛的模式生物。而叶绿体是植物细胞特有的细胞器，是植物进行光合作用的场所，除了光合作用外，还参与氨基酸、脂肪酸、植物生长物质、维生素等的合成。因而，植物叶绿体的发育与功能研究一直倍受人们关注。同时，获得高纯度的叶绿体用于蛋白质功能的研究成为先决条件。目前，关于拟南芥叶绿体提取的方法，大多数由提取菠菜和豌豆叶绿体的方法改进而来。1985年Riet等人的分离方法只用了一种浓度的percoll梯度，得到的叶绿体纯度不够；2008年Daniel Salvi的提取方法需要用到较高条件的高速水平离心机。还有一些方法提取液的配方复杂，花费时间长。本发明提供了一种快速简易的完整叶绿体提取方法，提取时间短，配方简单，离心要求低，进行定量测定后，可以直接运用于叶绿体膜蛋白、基质蛋白及叶绿体DNA的提取等各种后续研究。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种快速简易的完整叶绿体的提取方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)用具预冷；
(2)在培养箱光周期开始2-3h时，取3-4周的拟南芥叶片，置于冰上；
(3)然后在匀浆机中加入200ml的Medium I(缓冲液I)，低速匀浆；
(4)使用miracloth(神奇滤布)或者纱布过滤，1500g水平离心5min，沉淀为墨绿色粗叶绿体，上清为浅绿色；
(5)尽量去除上清，沉淀用约5ml的Medium II(缓冲液II)轻柔悬浮；
(6)配置40％/80％percoll(细胞分离液)梯度，将样品上样至percoll梯度上层，3000g水平离心30min；
(7)完整叶绿体位于上下两个percoll组分的交界处，将完整叶绿体吸出；用SH buffer(SH缓冲液)稀释3倍，1500g水平离心2min，沉淀重悬于25ml SH buffer，1000g离心1min；
(8)沉淀用适量SH buffer悬浮(约5-10ml)，可以立即镜检观察叶绿体，并色素定量。
更为具体地，一种快速简易的完整叶绿体提取方法，包括以下操作步骤：
(1)本方法所有用具(组织捣碎匀浆机、烧杯、试管、试剂等)需在冰上或者-20℃预冷，离心均在4℃条件下。
(2)在培养箱光周期开始2-3h时，取3-4周的拟南芥叶片共20g，置于冰上。
(3)然后在匀浆机中加入200ml的Medium I(缓冲液I)(330mM sorbitol(山梨糖醇)，30mM Tricine-KOH(三甲基甘氨酸-氢氧化钾)pH 8.4，5mM EGTA，5mM EDTA，10mM NaHCO3)，低速匀浆，时间不宜超过5min。
(4)使用3层miracloth(神奇滤布)或者8层纱布过滤至4个50ml圆底离心管中，1500g水平离心5min，沉淀为墨绿色粗叶绿体，上清为浅绿色。
(5)尽量去除上清，沉淀用约5ml的Medium II(缓冲液II)(300mM sorbitol(山梨糖醇)，20mM Hepes-KOH(4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钾)pH 7.6，5mM MgCl2，2.5mM EDTA)轻柔悬浮(枪头剪大口)。
(6)在50ml离心管中配置23ml 40％/80％percoll(细胞分离液)梯度，将样品上样至4个percoll梯度上层，3000g水平离心30min。
(7)完整叶绿体位于上下两个percoll(细胞分离液)组分的交界处(5ml刻度线)，小心将完整叶绿体吸出，每一个percoll交界处可吸出5-10ml叶绿体。用SH buffer(SH缓冲液)(330mM sorbitol，50mM Hepes-KOH pH 8.0，2mM DTT，DTT需现用现加)稀释3倍，1500g水平离心2min，沉淀重悬于25ml SH buffer，1000g离心1min。
(8)沉淀用适量SH buffer(SH缓冲液)(330mM sorbitol，50mM Hepes-KOH pH 8.0，2mM DTT，DTT需现用现加)悬浮(约5-10ml)，可以立即镜检观察叶绿体，并色素定量。
(Percoll(细胞分离液)梯度配制：首先配制含6％(w/v)sorbitol(山梨糖醇)的100％Percoll(细胞分离液)，然后配制Percoll(细胞分离液)梯度。40％组分，7.2ml 100％Percoll+10.8ml SH buffer；80％组分，4ml 100％Percoll+1ml SH buffer。)
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明不需要将拟南芥暗处理过夜，节省步骤和时间。
(2)本发明的三个提取液配方简单，但是能提取到大量有活力的叶绿体。
(3)本发明改进了步骤4、6离心力的大小，大大降低了对离心机的要求。
(4)本发明改进了步骤6离心的时间，使得获得尽可能多的完整叶绿体。
附图说明
图1是使用本发明提取的拟南芥完整叶绿体图，(注：Bar＝5μm)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法
(1)本方法所有用具(组织捣碎匀浆机、烧杯、试管、试剂等)需在冰上或者-20℃预冷，离心均在4℃条件下。
(2)在培养箱光周期开始2-3h时，取3-4周的拟南芥叶片共20g，置于冰上。
(3)然后在匀浆机中加入200ml的Medium I(330mM sorbitol，30mM Tricine-KOH pH 8.4，5mM EGTA，5mM EDTA，10mM NaHCO3)，低速匀浆，时间不宜超过5min。
(4)使用3层miracloth或者8层纱布过滤至4个50ml圆底离心管中，1500g水平离心5min，沉淀为墨绿色粗叶绿体，上清为浅绿色。
(5)尽量去除上清，沉淀用约5ml的Medium II(300mM sorbitol，20mM Hepes-KOH pH 7.6，5mM MgCl2，2.5mM EDTA)轻柔悬浮(枪头剪大口)。
(6)在50ml离心管中配置23ml 40％/80％percoll梯度，将样品上样至4个percoll梯度上层，3000g水平离心30min。
(7)完整叶绿体位于上下两个percoll组分的交界处(5ml刻度线)，小心将完整叶绿体吸出，每一个percoll交界处可吸出5-10ml叶绿体。用SH buffer(330mM sorbitol，50mM Hepes-KOH pH 8.0，2mM DTT，DTT需现用现加)稀释3倍，1500g水平离心2min，沉淀重悬于25ml SH buffer，1000g离心1min。
(8)沉淀用适量SH buffer悬浮(约5-10ml)，可以立即镜检观察叶绿体，并色素定量。
(Percoll梯度配制：首先配制含6％(w/v)sorbitol的100％Percoll，然后配制Percoll梯度。40％组分为7.2ml 100％Percoll+10.8ml SH buffer，80％组分为4ml 100％Percoll+1ml SH buffer，5ml的80％组分用长针头缓慢注射到40％组分底部。)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。