一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法与流程

文档序号:11899047阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法,其特征在于,包括以下操作步骤:

(1)用具预冷;

(2)在培养箱光周期开始2-3h时,取3-4周的拟南芥叶片,置于冰上;

(3)然后在匀浆机中加入200ml的Medium I(缓冲液I),低速匀浆;

(4)使用miracloth(神奇滤布)或者纱布过滤,1500g水平离心5min,沉淀为墨绿色粗叶绿体,上清为浅绿色。

(5)尽量去除上清,沉淀用约5ml的Medium II(缓冲液II)轻柔悬浮;

(6)配置40%/80%percoll(细胞分离液)梯度,将样品上样至percoll梯度上层,3000g水平离心30min;

(7)完整叶绿体位于上下两个percoll组分的交界处,将完整叶绿体吸出;用SH buffer(SH缓冲液)稀释3倍,1500g水平离心2min,沉淀重悬于25ml SH buffer,1000g离心1min;

(8)沉淀用适量SH buffer悬浮(约5-10ml),可以立即镜检观察叶绿体,并色素定量。

2.根据权利要求1所述的提取方法,其特征在于,用具预冷包括将组织捣碎匀浆机、烧杯、试管、试剂在冰上或者-20℃预冷。

3.根据权利要求1所述的提取方法,其特征在于,所述Medium I的配方为:330mM sorbitol,30mM Tricine-KOH pH 8.4,5mM EGTA,5mM EDTA,10mM NaHCO3

4.根据权利要求1所述的提取方法,其特征在于,所述Medium II的配方为:300mM sorbitol,20mM Hepes-KOH pH 7.6,5mM MgCl2,2.5mM EDTA。

5.根据权利要求1所述的提取方法,其特征在于,所述SH buffer的配制方为:330mM sorbitol,50mM Hepes-KOH pH 8.0,2mM DTT,DTT需现用现加。

6.根据权利要求1所述的提取方法,其特征在于,Percoll梯度配制方法为:首先配制含6%(w/v)sorbitol的100%Percoll,然后配制Percoll梯度;40%组分为7.2ml 100%Percoll+10.8ml SH buffer,80%组分为4ml 100%Percoll+1ml SH buffer,5ml的80%组分用长针头缓慢注射到40%组分底部。

7.根据权利要求1所述的一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法,其特征在于:使用3层miracloth或者8层纱布过滤至50ml圆底离心管中,1500g水平离心5min。

8.根据权利要求1所述的一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法,其特征在于:在50ml离心管中配置23ml 40%/80%percoll梯度,将样品上样至percoll梯度上层,3000g水平离心30min。

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