一株蜡状芽孢杆菌及其在氧化无机硫化物中的应用的制作方法

本发明涉及一株蜡状芽孢杆菌，可应用于在pH4.5～9.1的微酸性到碱性范围、好氧条件下对还原态无机硫化物的生物去除，属于生物和环境保护技术领域。

背景技术：

在一些食品加工的生产中会释放出大量的恶臭对人体有毒害的硫化氢废气(H₂S是一种还原态无机硫化物)，导致周边环境污染。例如，在我国的禽畜屠宰行业中，屠宰加工车间产生的恶臭废气主要成分是硫化氢，浓度可高达8.0mg/m³。动物蛋白饲料鱼粉的加工，由于多以新鲜度低的鱼、和腐败的臭鱼烂虾及水产品加工厂的下脚料为原料，在高温蒸煮和干燥工序中，也释放出大量的硫化氢废气。

针对以上现象，需要能够快速去除硫化氢、适用于多种设施且成本低廉的脱硫除臭方法。目前脱臭方法主要是物理法、化学法和生物法。生物脱臭法是指利用微生物降解恶臭物质，达到去除臭味的方法。微生物处理臭气的基本原理是利用微生物把溶解于水中的恶臭物质吸收于微生物体内，在有氧条件下，通过微生物的代谢活动使其降解的一种过程，即对恶臭物质进行氧化分解获得营养物和能量，并实现微生物的增殖过程。生物脱硫除臭法，具有处理效率高、无二次污染、所需设备简单、管理维护方便、比物理法和化学法运转成本低等优点。

硫化物是自然界中的一种重要物质，无机硫和其化合物在自然界中分布范围很广，能以不同形式的离子或分子形式存在，种类可达30多种，其中仅有5种无机硫化物在室温和一个大气压下在溶液中具有稳定性，它们是SO₄^2-、HSO₄^-、S⁰、H₂S、HS^-。其它形式的硫例如多硫化合物、硫代硫酸盐和连多硫酸盐也可在自然环境中发现，但它们是不稳定的。硫的生物循环过程与物理化学过程紧密结合，共同构成了硫的自然界循环圈。硫的自然界循环主要是通过硫的生物循环来实现的，包括(1)无机硫化物在好氧硫细菌的作用下被氧化为单质硫和硫酸盐的过程，称为硫元素氧化过程；(2)硫酸盐在细菌的作用下被转化为有机硫的过程，被称为硫的同化还原过程；(3)在厌氧环境条件下，硫酸盐经过硫酸盐还原菌作用被还原为低价硫化物的过程，称为异化还原过程。

自然界中能氧化无机硫化物的细菌种类很多，大部分属于化能自养型，主要可分为三大类：无色硫细菌、光合硫细菌、硫杆菌属。微生物参与硫素循环的各个过程，起着重要的作用。目前用于脱除硫化氢的微生物主要是自养硫杆菌属细菌，此类细菌利用还原态的硫化物作为能源，由此将硫的不完全氧化物转化为硫酸等物质，从而去除硫化氢等恶臭物质。微生物催化的硫素转化途径为：S^2-→S⁰→SO₃^2-→SO₄^2-

然而目前通常利用的自养型硫氧化细菌进行还原态无机硫化物的去除应用存在如下缺点：1、在氧化硫化物的同时产生硫酸，一方面抑制了硫氧化菌活性，大量产酸还会导致菌体自溶降低除硫速率；2、需要加入碱进行中和，增加了处理的成本。

目前能够在pH4.5～9.1的微酸性到碱性条件下将还原态无机硫化物氧化生成硫酸盐的化能异养型细菌蜡状芽孢杆菌的研究未见有报道。因此，筛选一株比较容易培养、在自然环境下能够高效去除还原态无机硫化物的异养型细菌菌株非常重要。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有技术中硫氧化细菌在去除无机硫化物应用中，氧化硫化物的同时产生硫酸，抑制了硫氧化菌活性，导致菌体自溶、降低除硫速率的问题，提供一株可以耐受最高S^2-浓度达300mg/L的蜡状芽孢杆菌及其脱除还原态无机硫化物方面的应用，该菌株具有可以在pH 4.5～9.1范围内高效脱硫的特点。

本发明的目的可以通过采取以下技术方案达到：

一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ZJNB-B3，于2016年6月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏号为：CCTCC NO.M2016337，于2016年6月30日鉴定样本存活。

一株蜡状芽孢杆菌CCTCC NO：M 2016337的应用，能够用于还原态无机硫化物脱除。

进一步地，所述蜡状芽孢杆菌CCTCC NO：M 2016337的应用，该菌株可在pH 4.50～9.10范围生长，能够将还原态无机硫化物氧化生成硫酸盐；分批培养显示，该菌株氧化无机硫化物最适初始pH为7.0，最适温度为30℃，最适初始硫化物S^2-浓度为250mg/L，该菌株在48h能够将标定浓度244mg/L S^2-降为6.32mg/L，脱硫率达97.4％。

本发明的有益效果

本发明提供一株蜡状芽孢杆菌CCTCC NO：M 2016337，以及其应用于氧化还原态无机硫化物的应用。蜡状芽孢杆菌CCTCC NO：M 2016337是具有对还原态无机硫化物有较高氧化能力的细菌。所述菌株属于异养菌，对生长营养条件要求简单，生长快速，可以在pH 4.5～9.1较宽范围生长。所述菌株能够氧化还原态无机硫化物成为硫酸根，可以不加入碱在pH 4.5～9.1环境下进行还原态无机硫化物的氧化去除，因此可以应用于禽畜屠宰加工、饲料鱼粉加工和其他一些食品加工产生的无机硫化物恶臭硫化氢气体的脱除无害化处理。

附图说明

图1是蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3菌株的扫描电子显微镜照片。

图2是蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3菌株能够耐受不同硫化物S^2-浓度，48小时累计产生的硫酸根图。

图3是蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3菌株在氧化初始S^2-浓度为250mg/L，培养温度为30℃，在不同初始pH值为5、6、7条件下的代谢产生硫酸根变化曲线图。

图4是蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3菌株在氧化初始S^2-浓度为250mg/L，最适初始pH值为7时，在25℃、30℃、35℃不同温度培养下代谢产生硫酸根变化曲线图。

图5是蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3菌株在氧化初始S^2-浓度为250mg/L，最适初始pH值为7，最适培养温度为30℃时，硫酸根、硫化物、pH值随时间变化曲线图。

具体实施方式

现参照图1至图5以及具体实施例1阐述本发明：

具体实施例1突变菌株蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3的来源。

申请人在2015年取鱼粉加工厂污水排放处沉淀的湿污泥250g，通过不断添加Na₂S的方法富集、分离得到一株能够利用无机硫化物的细菌，鉴定结果为蜡状芽孢杆菌XJ-2菌株，脱硫率达87.1％，分离与鉴定XJ-2菌株的研究论文《一株鱼粉加工硫化氢恶臭气体脱除菌株的分离与鉴定》发表在2015年9月的环境工程学报，2015,9(9)：4465～4470。因为菌株XJ-2的脱硫率不是很高，在该论文中所述的XJ-2可以在pH5.0～8.5生长的条件都是在不含有无机硫化物的培养液体下的菌体自然生长状态。菌株XJ-2在含有无机硫化物S^2-条件下，能够耐受最高的硫化物S^2-浓度和氧化产生多少浓度的硫酸根的生理代谢功能尚为不明。

在此前期研究背景下，申请人在2016年使用紫外线诱变技术对蜡状芽孢杆菌XJ-2菌株进行了诱变，通过筛选得到了脱硫率高达97.4％的突变细菌，经过鉴定为蜡状芽孢杆菌，突变菌株命名为蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3，保藏于中国典型培养物保藏中心。随后，研究了ZJNB-B3菌株能够耐受的最高硫化物S^2-浓度，获得了在含有无机硫化物S^2-条件下，将S^2-氧化产生硫酸根的最适初始pH值、最适培养温度的生理代谢参数。

用紫外线对XJ-2菌株进行诱变：

将保存的XJ-2菌种转接到细菌斜面培养基上，30℃活化培养24h，将活化菌苔转移到装有玻璃珠的无菌水三角瓶中，置于30℃、150r/min的条件下摇瓶，制成单细胞菌悬液,细胞浓度约10⁸个/ml。取菌悬液在紫外灯下照射30～60s,取出，30℃恒温培养24h，然后涂布在营养琼脂培养基固体平板上，在30℃培养2天，挑取生长的单菌落进行划线、分离纯化，得到几株突变菌株，经过脱硫率筛选，最后获得一株脱硫率较高，达97.4％的突变菌株ZJNB-B3。

具体实施例2蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3菌株的鉴定

(1)形态特性

该菌株革兰氏染色为阳性，杆菌，细胞大小1.0～1.2×3.0～5.0μm，形态见扫描电子显微镜照片图1。

(2)分子生物学鉴定

采用16S rDNA通用引物，对细菌的16S rDNA进行PCR扩增，并进行DNA测序，将得到的序列与美国The National Center for Biotechnology Information(NCBI)的GenBank中公开的已知序列经过Blast软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行比对，目标菌株与已知的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus LN890259.1)相似性达到了100％，根据分子生物学鉴定结果，将鉴定菌株命名为蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3(Bacillus cereus ZJNB-B3)，具体见基因表。

具体实施例3蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3菌株对不同浓度硫化物的氧化生理代谢研究。

挑取二环试管斜面培养物至100ml营养肉汤培养基中，30℃摇床振荡培养18小时，得到对数生长期的种子液。按5～10％的体积比将种子接种于pH为7、总量100ml营养肉汤培养基中，添加Na₂S水溶液，使反应初始S^2-浓度为100，200，250，300，400m_g/L，置于30℃、150r/min振荡培养48小时，每隔12h取样分析瓶内液体的硫化物、硫酸根的含量，及pH值变化，结果见图2。当初始S^2-浓度为400mg/L时，该条件下的0h初始pH高达9.3，在强碱性条件下，反应开始阶段细菌被部分杀死而且生长受到抑制，到24小时pH才有所下降到7.53，菌体开始繁殖，48小时pH降为7.17，但产生的硫酸根为1.9mg/L，脱硫效率较低，因此可知菌株最高可以耐受S^2-浓度为300mg/L。图2还表明了菌株氧化还原态无机硫化物的最适初始S^2-浓度为250mg/L，此条件氧化S^2-产生的硫酸根浓度最大，达60.5mg/L。

具体实施例4蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3菌株将S^2-氧化产生硫酸根的最适初始pH值、最适培养温度生理代谢研究。

(1)ZJNB-B3菌株在不同初始pH值下，培养温度为30℃，氧化初始S^2-浓度为250mg/L能够积累产生的硫酸根生理代谢变化见图3，积累产生的硫酸根浓度由高到低的结果为pH7＞pH6＞pH5，因此，菌株将硫化物氧化产生硫酸根的最适初始pH值是7。

(2)ZJNB-B3菌株在初始pH值为7，不同培养温度下，氧化初始S^2-浓度为250mg/L能够积累产生的硫酸根生理代谢变化见图4，积累产生的硫酸根浓度由高到低的结果为30℃＞25℃＞35℃，菌株将硫化物氧化产生硫酸根的最适培养温度是30℃。

具体实施例5蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3菌株在初始S^2-浓度为250mg/L、最适初始pH值和最适培养温度下对硫化物的氧化生理代谢研究。

ZJNB-B3菌株在最适初始pH值为7，最适培养温度30℃培养下，氧化250mg/L硫化物产生的硫酸根和pH值变化见图5。该菌株在48h能够将液体中S^2-浓度降为6.32mg/L，脱硫率达97.4％。

该蜡状芽孢杆菌ZJNB-B3菌可以在pH4.5～9.1较宽范围将还原态无机硫化物氧化成硫酸根，可以不加入碱实现在pH4.5～9.1环境下进行还原态无机硫化物的氧化脱除，因此可应用于禽畜屠宰加工、饲料鱼粉加工或者其它食品加工产生的无机硫化物恶臭硫化氢气体的脱除无害化处理。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁波大学

<120> 一株蜡状芽孢杆菌及其在氧化无机硫化物中的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1295

<212> DNA

<213> 蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）

<400> 1

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