一种蜡样芽孢杆菌及其在降解羽毛中的应用的制作方法

本发明涉及养殖业环境资源应用领域，具体地说涉及一种能够有效地降解羽毛的蜡样芽孢杆菌及应用。

背景技术：

随着养禽业的集约化发展，养殖企业，尤其是大中型畜牧场在提供肉、禽、蛋的同时，每天都会产生粪、羽毛、骨粉、血渣等大量的废弃物，这些废弃物如果处理不好，常常会污染环境，传播病原。尤其是羽毛，由于其羽毛角蛋白含量高，具有难以降解的特点，比其他废弃物更难以回收利用。据研究报道，羽毛中的角蛋白含量高达80％，并且含有丰富的赖氨酸、色氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、组氨酸、脯氨酸、甘氨酸以及其他一些维生素、常量元素及微量元素，由于缺乏实用的降解羽毛的手段，致使大量羽毛废弃、污染环境。尽管高压加温水解法、化学酸碱水解法等处理方法能够降解羽毛，但由于成本高，实用性不强。

研究表明，生物发酵方法已成为处理农业废弃物的首选，最重要的是筛选合适的微生物发酵降解菌株，最好能找到能够降解鸡、鸭、鹅、鸽等多种羽毛的角蛋白的菌株。角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，是一种不溶性的纤维状动物蛋白质，是禽类羽毛的主要构成物质。角蛋白因含有较多的氢键、二硫键、盐键且折叠紧密，又不溶于水，一般不容易被酶溶解。而且由于不同禽类羽毛角蛋白的结构组成有所不同，因此，即便是能够降解一种禽类的羽毛，不一定能降解其他禽类的羽毛。

近年来，有不少专利及研究报道，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌能够降解鸡的羽毛，但可以较好降解鸭、鹅、鸽等羽毛的降解菌株尚未见报道，而能够同时降解鸡、鸭、鹅、鸽的羽毛的菌降解菌株更为少见。

cn106350558a公开了利用蜡样芽孢杆菌和角蛋白酶联合降解鸡毛，但未公开可同时降解鸡、鸭、鹅、鸽的羽毛，且联合降解的效果优于蜡样芽孢杆菌或角蛋白酶单独降解。目前国内外尚未见蜡样芽孢杆菌同时降解鸡、鸭、鹅、鸽羽毛的报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的空白，提供一种能够同时降解鸡、鸭、鹅、鸽等多种羽毛的蜡样芽孢杆菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述蜡样芽孢杆菌的应用，该菌种能够有效降解鸡、鸭、鹅、鸽等多种羽毛的角蛋白，变成易于吸收的氨基酸营养物质，降低环境污染程度，并可用来制备有机肥和养殖蚯蚓、蝇蛆等动物源饲料。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种蜡样芽孢杆菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)，菌株号为nj-02，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年3月30日，保藏编号为cctccno：m2017155，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。该菌株是发明人于2016年9月从江苏省南京市某鸽场健康鸽肠道中分离筛选获得的，对鸡、鸭、鹅、鸽等多种羽毛能够有效降解的细菌菌株，这对降解处理养禽场废弃的羽毛，降低养禽场环境污染程度，减少疾病的传播具有重要意义。

菌株nj-02的主要生物学特征：菌落边缘不整齐呈乳白色不透明，表面粗糙呈白蜡状，纯培养细菌经革兰氏染色和芽孢染色，然后置于光学显微镜油镜头下进行观察。结果为有芽孢的g+中等大小杆菌，多数单在，少数呈3～5个短链状，细菌大小1.0～1.2μm×3.0～5.0μm，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5μm，孢囊无明显膨大。该菌株赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、柠檬酸盐、肌醇、侧金盏花醇、水杨苷、1％美蓝牛乳均为阴性，v.p试验、m.r、明胶液化、硝酸盐、0.01％溶菌酶均为阳性。

菌株nj-0216srdna基因序列，见seqidno.1所示。

将菌株16srdna序列与genbank数据库中的序列进行blast比对。结果表明，菌株nj-02的669bp核苷酸片段与已知蜡样芽孢杆菌对应核苷酸片段同源性均高达97％以上。结合形态、生理生化特征及16srdna序列分析，鉴定为蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)。

上述蜡样芽孢杆菌在降解羽毛中的应用也在本发明的保护范围内。

其中，所述的羽毛优选为鸡毛、鸭毛、鹅毛或鸽毛，最优选鹅毛。

具体的应用方法是，将羽毛作为蜡样芽孢杆菌nj-02的发酵培养基的组成部分，蜡样芽孢杆菌nj-02的发酵过程与羽毛的降解过程同步。

优选的是，羽毛的降解过程包括如下步骤：

(1)蜡样芽孢杆菌菌株nj-02的活化

将蜡样芽孢杆菌菌株nj-02划线于活化培养基上，35℃～40℃下培养24h～48h，由此获得经过活化的nj-02菌株；

(2)种子液的制备

将步骤(1)活化后的菌株，接种于种子培养基中，35～40℃震荡培养24～36h，得种子液；

(3)发酵降解

以5～10％的体积比的接种量，将步骤(2)得到的种子液接种于含有羽毛的发酵培养基中，35～40℃发酵48-60h，直接降解羽毛。

其中，所述的活化培养基按如下方法制备得到：称取营养琼脂38g，蒸馏水800ml，调整ph7.5，加蒸馏水至1000ml，高压灭菌，制得。

其中，所述的种子培养基按如下方法制备得到：称取牛肉膏1.5g，蝇蛆消化浓缩膏1.5g，蛋白胨5g，nacl5g，k2hpo41g，蒸馏水800ml，初始ph7.5，加蒸馏水至1000毫升，高压灭菌，制得。

其中，蝇蛆消化浓缩膏自行制备，具体步骤为：将500g新鲜蝇蛆，用水冲洗干净后，加水至800ml，置组织捣碎机中高速捣碎后，取出置提取罐中，加水冲洗合并，使捣碎后的混合物体积为1500ml，加入胰蛋白酶1.5g(酶活：每毫克胰蛋白酶效价不少于2500酶活单位)，边加边搅拌均匀，置于50℃条件下酶解8-10h，期间每小时搅拌一次，加热升温至沸腾后停止升温，静置30min，用四层纱布过滤，去除滤渣，将滤液减压浓缩，使每克浸膏相当于原新鲜蝇蛆5g。

使用蝇蛆消化浓缩膏替代部分牛肉膏是基于以下考虑：蝇蛆作为一种完整的生命个体，营养成分更全面，含有18种氨基酸和7种必需氨基酸，含有丰富的矿物质元素、维生素、微量元素及不饱和脂肪酸，其每一种氨基酸含量都高于鱼粉。蝇蛆粉与牛肉粉营养价值相近，但营养成分更全面，蝇蛆粉已达到联合国粮农组织提出的优质蛋白质饲料标准。因此，为了使种子培养基更有效地培养细菌，在1000毫升培养液体系中添加了蝇蛆消化浓缩膏1.5g。

其中，所述的含有羽毛的发酵培养基配方如下：羽毛粉20g/l，k2hpo40.4g/l，feso40.1g/l，nacl0.5g/l，溶剂为水，初始ph7.5，高压灭菌。

其中，所述的羽毛粉，粒径为750μm～1200μm，优选粒径为900μm～1100μm。

有益效果：本发明的蜡样芽孢杆菌nj-02可直接用于羽毛的降解，对鹅毛的降解效果最佳，在第15天时，降解率达到100％，对鸭毛、鸡毛、鸽毛均有较好的降解作用，对鸡毛而言，发酵3天羽毛分解率已有35.3％，鸭毛、鸡毛、鸽毛在第15天时降解率都已达75％以上。蜡样芽孢杆菌nj-02可应用于家禽的废弃物回收利用，促进生态、循环养殖，属安全微生物，可用于羽毛的降解、养殖废弃物发酵及生物肥料领域。

附图说明

图1为蜡状芽孢杆菌nj-02菌落形态。

图2为蜡样芽孢杆菌nj-02菌体形态(革兰氏染色)。

图3为蜡样芽孢杆菌nj-02菌体形态(芽孢染色)。

图4为蜡样芽孢杆菌nj-0216srdna671bpncbi网blast系统发育进化树。

图5为蜡样芽孢杆菌nj-02对鹅羽毛降解5天结果(左管为对照)。

图6为蜡样芽孢杆菌nj-02对鹅羽毛降解10天结果(左管为对照)。

图7为蜡样芽孢杆菌nj-02对鹅羽毛降解15天结果(左管为对照)。

图8为蜡样芽孢杆菌nj-02对鸭羽毛降解5天结果(右管为对照)。

图9为蜡样芽孢杆菌nj-02对鸭羽毛降解10天结果(右管为对照)。

图10为蜡样芽孢杆菌nj-02对鸭羽毛降解15天结果(右管为对照)。

图11为蜡样芽孢杆菌nj-02对鸡羽毛降解5天结果(左管为对照)。

图12为蜡样芽孢杆菌nj-02对鸡羽毛降解10天结果(左管为对照)。

图13为蜡样芽孢杆菌nj-02对鸡羽毛降解15天结果(右管为对照)。

图14为蜡样芽孢杆菌nj-02对鸽羽毛降解5天结果(左管为对照)。

图15为蜡样芽孢杆菌nj-02对鸽羽毛降解10天结果(左管为对照)。

图16为蜡样芽孢杆菌nj-02对鸽羽毛降解15天结果(左管为对照)。

图17为鸡鸭鹅鸽羽毛降解残留量测定比较。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：菌株的培养鉴定。

1、原始菌株的获得

从南京某鸽场取健康鸽子数只，于酒精灯旁将鸽子进行剖解，并直接用灭菌接种环采取其盲肠内容物划线接种于普通琼脂平板，37℃培养24h后，观察生长出的单个菌落形态，取直径大小6mm左右，边缘不整齐呈乳白色不透明，表面粗糙呈白蜡状菌落进行进一步的分离培养，获得单个菌落后进行纯培养。细菌分离培养结果：通过细菌分离培养，获得一株纯培养细菌，命名为nj-02。分离到的细菌经革兰氏染色和芽孢染色，然后置于光学显微镜油镜头下进行观察。结果为有芽孢的g+中等大小杆菌，多数单在，少数呈3～5个短链状，细菌大小1.0～1.2μm××3.0～5.0μm，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5μm，孢囊无明显膨大。如附图1(菌落形态)、图2(革兰氏染色)、图3(芽孢染色)。

2、细菌的生化反应鉴定

取分离培养出的单个细菌菌落在载玻片上涂片进行革兰氏染色和芽孢染色，然后置于光学显微镜油镜头下进行观察。挑取菌落接种于微量生化鉴定管，37℃培养24h后观察结果。并按常规方法接种琼脂斜面和进行明胶液化试验、mr试验、vp试验、0.01％溶菌酶生长和柠檬酸盐利用试验并观察。结果见表1。

表1菌株生化反应试验结果

注：反应状态分为阳性和阴性，阳性形状编码为“+”，阴性形状编码为“-”。

从表1可以看出，该菌株赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、柠檬酸盐、肌醇、侧金盏花醇、水杨苷、1％美蓝牛乳均为阴性，v.p试验、m.r、明胶液化、硝酸盐、0.01％溶菌酶均为阳性。对照伯杰细菌鉴定手册第八版，该分离的菌株在生化鉴定上属于蜡样芽孢杆菌。

3、细菌16srdna基因片段序列测定及16srdna系统发育进化树分析结果

为了进一步鉴定该菌种，本研究作了细菌16srdna基因片段序列测定。取分离培养细菌接种琼脂斜面，37℃培养10h后，送斯普金公司合成测定分离细菌16srdna核苷酸片段序列。

细菌16srdna基因片段pcr产物有669bp序列测序结果如seqidno.1所示。

将nj-02菌株16srdna669bp核苷酸片段上述测序结果在ncbi网进行blast，结果表明，nj-02菌株669bp核苷酸片段与genbank中已知蜡样芽孢杆菌对应核苷酸片段同源性均高达97％以上。具体进化说明见图4。

综合通过以上结果分析表明，该分离的菌株为蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)。

以下实施例中，菌株nj-02种子液按照如下方法获得：

(1)蜡样芽孢杆菌菌株nj-02的活化

将蜡样芽孢杆菌菌株nj-02划线于活化培养基上，35℃～40℃下培养24h～48h，由此获得经过活化的nj-02菌株；

(2)种子液的制备

将步骤(1)活化后的菌株，接种于种子培养基中，35～40℃震荡培养24～36h，得种子液；

其中，所述的活化培养基按如下方法制备得到：称取营养琼脂38g，蒸馏水800ml，调整ph7.5，加蒸馏水至1000ml，高压灭菌，制得。

其中，所述的种子培养基按如下方法制备得到：称取牛肉膏1.5g，蝇蛆消化浓缩膏1.5g，蛋白胨5g，nacl5g，k2hpo41g，蒸馏水800ml，初始ph7.5，加蒸馏水至1000毫升，高压灭菌，制得。

其中，蝇蛆消化浓缩膏自行制备，具体步骤为：将500g新鲜蝇蛆，用水冲洗干净后，加水至800ml，置组织捣碎机中高速捣碎后，取出置提取罐中，加水冲洗合并，使捣碎后的混合物体积为1500ml，加入胰蛋白酶1.5g(酶活：每毫克胰蛋白酶效价不少于2500酶活单位)，边加边搅拌均匀，置于50℃条件下酶解8-10h，期间每小时搅拌一次，加热升温至沸腾后停止升温，静置30min，用四层纱布过滤，去除滤渣，将滤液减压浓缩，使每克浸膏相当于原新鲜蝇蛆5g。

实施例2：细菌对鸡、鸭、鹅、鸽多种家禽的羽毛降解形态观察。

为观察分离培养出的nj-02蜡样芽孢杆菌能否对鸡、鸭、鹅、鸽多种家禽的羽毛进行降解，设计了nj-02蜡样芽孢杆菌对鸡、鸭、鹅、鸽多种家禽的羽毛降解形态观察试验。在玻璃试管中加入5ml降解羽毛基础培养基(k2hpo40.4g/l，nacl0.5g/l，feso40.1g/l初始ph7.5)，和一片洁净家禽羽毛(鸡鸭鹅鸽的羽毛均同样处理观察)，高压灭菌15磅121℃15min，待冷后接种适量分离培养出的细菌，置37℃培养箱中培养5d～15d后观察结果。

1、鹅毛降解情况：第5天羽毛片：羽干不再完整，羽枝变得松软，大多数羽小枝解体，羽枝钩溶解，羽毛网状结构消失(见附图5，左边为空白对照)。

第10天羽毛片：羽干大部分降解，羽枝消失，羽小枝完全溶解消失(见附图6，左边为空白对照)。

第15天羽毛片：羽干全部消失，羽毛整体形态消失，羽毛绝全部溶解(见附图7，左边为空白对照)。每组对照羽毛片：可见到完整的羽干，上面分出众多的纤细羽枝，每根羽枝上又伸出若干更细的羽小枝，相连的羽小枝上面的小钩子相互钩连，羽毛片呈网状结构。

2、鸭毛降解情况：第5天羽毛片：羽干仍然完整，羽枝变得松软，羽小枝未解体，少许羽枝钩溶解，羽毛网状结构仍可见(如图8，右边为空白对照)。

第10天羽毛片：羽干大部分降解，羽枝消失，羽小枝完全溶解消失(图9，右边为空白对照)。

第15天羽毛片：羽干全部消失，仅有少许羽毛纤维状结构。至此，羽毛整体形态消失，羽毛绝大多数溶解(图10，右边为空白对照)。

对照羽毛组：可见到完整的羽干，上面分出众多的纤细羽枝，每根羽枝上又伸出若干更细的羽小枝，相连的羽小枝上面的小钩子相互钩连，羽毛片呈网状结构。

3、鸡毛降解情况：第5天羽毛片：羽枝变得松软，部分羽小枝解体，羽枝钩溶解，羽毛网状结构消失(图11，左边为空白对照)。

第10天羽毛片：羽小枝完全溶解消失(图12，左边为空白对照)。

第15天羽毛片：羽毛绝大多数溶解(图13，右边为空白对照)。

每组对照羽毛：可见到完整的羽干，上面分出众多的纤细羽枝，每根羽枝上又伸出若干更细的羽小枝，相连的羽小枝上面的小钩子相互钩连，羽毛片呈网状结构。

4、鸽毛降解情况：第5天羽毛片：羽干仍然完整，羽枝变得松软，但羽小枝、羽枝钩及羽毛网状结构仍然存在(图14，左边为空白对照)。

第10天羽毛片：羽干松软并稍稍降解，羽枝可见，部分羽小枝溶解消失(图15，左边为空白对照)。

第15天羽毛片：羽干有所消失，有少许羽毛纤维状结构(图16，左边为空白对照)。

每组对照原始片：可见到完整的羽干，上面分出众多的纤细羽枝，每根羽枝上又伸出若干更细的羽小枝，相连的羽小枝上面的小钩子相互钩连，羽毛片呈网状结构。

结果表明，该菌株对鹅的羽毛降解效果最好，在15d时，羽干全部消失，至此，羽毛整体形态消失，羽毛绝大多数溶解。对鸭毛、鸡毛及鸽毛也能够降解绝大多数。

实施例3：细菌对鸡、鸭、鹅、鸽等多种家禽的羽毛降解残留量测定

羽毛粉预处理：将收集的羽毛先经过0.04％的naoh溶液于20～25℃浸泡1h，用清水漂洗后过滤，烘干，粉碎粒径在750μm～1200μm之间，备用。

取250ml规格三角烧瓶24个，各加入粒径750μm～1200μm的鸡羽毛粉1克及发酵培养基50ml(发酵培养基配方如下：k2hpo40.4g/l，feso40.1g/l，nacl0.5g/l，溶剂为水，初始ph7.5，高压灭菌)，高压灭菌15磅121℃15min，待冷后备用。然后分成二组，第一组12个，每个各接种适量分离培养出的细菌nj-02(不少于10⁹cfu/ml)，另一组12个作空白对照，置37℃振荡培养箱中150rpm/min培养后第3天、第5天、第10天及第15天分别从第一组及对照组各取样3份，取出羽毛粉降解混合物，用灭菌的纯水反复冲洗，滤纸过滤，并将羽毛粉置60-80℃烘干，进行称重，观察结果。鸭、鹅、鸽羽毛同样处理。

结果表明，nj-02菌株对鹅毛的降解效果最佳，在第15天时，降解率达到100％，同时nj-02菌株对鸭毛、鸡毛、鸽毛均有一定的降解作用，对鸡毛而言，发酵3天羽毛分解率已有35.3％。在第15时鸡鸭鸽的羽毛降解率都已达75％以上。

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<120>一种蜡样芽孢杆菌及其在降解羽毛中的应用

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