专利名称：巨大芽孢杆菌及其制备方法、用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境和饲用生物技术领域，特别是一种微生物菌种的筛选、制备方法及其应用。
背景技术：
自三千年前至今利用乳酸菌及其发酵制品制成人和畜禽的保健品，直接饲喂动物的微生物1974年首先被美国R.E.Parker称之为Probiotas(益生菌)1989年Enller等重新定义为一种可以通过改善肠道菌群平衡而对动物施加有影响的活微生物饲用添加剂。目前美国欧洲等地均在推广使用，中国在八五期间，国家也列入重点攻关课题。根据目前的研究进展仍然是乳酸菌属的微生物为主体。1989年美国食品药品管理局(FDA)公布的42种和中国农业部第105号公告公布的允许使用的菌中为12种，其中美国乳酸菌属占74％，中国占70％，而芽孢杆菌中美国有凝结芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌等五种，中国有枯草芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌二种，由于芽孢杆菌不仅具有丰富的多功能酶活性和促长、抗菌因素，抗逆性强，适宜加工耐贮藏等优点，同时消除人畜禽粪便腐败所产生的恶臭气体，也有显著的作用，因此是目前研究开发的重点。
发明内容
本发明目的在于为环保和畜禽的饲用提供一种新的巨大芽孢杆菌。本发明菌种于2004年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为GMCC No1259，其基因的DNA序列为ctggcggcgt gcctaatcat gcaagtcgag cgaactgatt agaagcttgc ttctatgacg 60ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg 120ggaaaccgaa gctaataccg gataggatct tctccttcat gggagatgat tgaaagatgg 180
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存活的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)已于2004年12月6日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。
本发明的第二个目的是发明巨大芽孢杆菌的一种制备方法，其特征在于包括以下步骤1)取畜禽粪，采用营养琼脂进行平板稀释分离；2)挑取芽孢杆菌的单菌落；3)纯化4)采用硫化氢和靛基质生化动力检测方法，将分离出呈阴性的单菌落，即巨大芽孢杆菌。
上述步骤1)中，先将畜禽粪稀释于1000倍～10000倍的无菌水中，经80℃水浴15分钟，再将稀释后的畜禽粪平铺在平板营养琼脂上，置于34℃～35℃中培养3～4天。
本发明还可采用沙土管或冻干粉管对巨大芽孢杆菌进行保藏。
本发明还可通过以下方法进行扩增培养将巨大芽孢杆菌移接到营养琼脂斜面，制成第一代原种，再移至发酵罐，经繁殖罐扩大培养，形成芽孢后，经离心浓缩，取固体物质，喷雾干燥获得粉状巨大芽孢杆菌。
上述发酵罐中液体配方中，每1000ml水，以下各组分为糖类20～25g、豆粕10～15g、鱼粉5g、硫酸氢二钾2g、硫酸镁1g、氯化钠5g、硫酸钙3g，PH为7.2。
于发酵罐中，在32±1℃培养温度条件下扩大培养48～52小时。
另外，本发明还提供了巨大芽孢杆菌的两种用途一种是巨大芽孢杆菌用于生产生物除臭剂。
另一种是巨大芽孢杆菌用于生产生物调理剂。
具体实施例1、将10g畜禽粪稀释于1000倍～10000倍的无菌水中，经80℃水浴15分钟，再将稀释后的畜禽粪平铺在平板营养琼脂上，置于34℃～35℃中培养3～4天。
2、挑取芽孢杆菌的单菌落。
3、以常规方法进行纯化。
4、采用硫化氢和靛基质生化动力检测方法，将分离出呈阴性的单菌落，即巨大芽孢杆菌将纯化后的单菌落分别进行硫化氢和靛基质生化动力检测。进行靛基质生化动力检测时，生成玖瑰吲哚呈紫红色为阳性反应，黄色为阴性反应。进行硫化氢生化动力检测时，生成黑色的硫酸亚铁沉淀的为阳性反应，否则为阴性反应。(由于另外一些细菌分解含硫氨基酸，生成硫化氢，或将硫酸盐还原为硫化氢，而硫化氢和亚铁结合形成黑色的硫酸亚铁沉淀。)留取上述反应都呈阴性的单菌落。
为了获得稳定的单菌落，可根据此原理经过反复的检测，筛选得到生化动力反应为阴性的芽孢杆菌属本发明的巨大芽孢杆菌。
5、采用沙土管或冻干粉管对巨大芽孢杆菌保藏。
6、扩增培养将巨大芽孢杆菌从沙土管或冻干粉管中移接到营养琼脂斜面，制成第一代原种，再移至发酵罐，在发酵罐内加入发酵液体，高压灭菌，冷却至32±1℃，然后在32±1℃培养温度条件下扩大培养48～52小时，在扩大培养其间，向密封的发酵罐连续通入无菌空气，无菌空气与发酵液的比值为1立方米∶1吨，并连续搅拌。待芽孢形成后放罐，一般每毫升发酵液体中含芽孢50亿以上，经离心浓缩，取固体物质，喷雾干燥获得粉状巨大芽孢杆菌，原粉中的活芽孢含量每克为500亿以上。喷雾干燥进风温度为125℃，出风温度为60℃。
上述发酵罐中液体配方中，每1000ml水，以下各组分为糖类20～25g、豆粕10～15g、鱼粉5g、硫酸氢二钾2g、硫酸镁1g、氯化钠5g、硫酸钙3g，PH为7.2，发酵罐在121±2℃中灭菌。
将获得的巨大芽孢杆菌进行基因测序，其基因的DNA序列为ctggcggcgt gcctaatcat gcaagtcgag cgaactgatt agaagcttgc ttctatgacg 60ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg 120ggaaaccgaa gctaataccg gataggatct tctccttcat gggagatgat tgaaagatgg 180tttcggctat cacttacaga tgggcccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240caccaaggca acgatgcata gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga 420agaacaagta cgagagtaac tgctcgtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg 540cgtaaagcgc gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg 600agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cctaagagaa aagcggattt ccacgtgtag 660cggtgaaatg cgtta。
应用一、巨大芽孢杆菌原粉用于生物快速除臭剂。主要应用于人畜禽粪便、生活垃圾污泥等除臭和腐解。
将猪粪鸡粪牛粪等投入具有加温搅拌的反应槽中，用稻草粉或煤炭等干料，调节含水量60％左右，加巨大芽孢杆菌原粉2～5‰，搅拌均匀，12小时后，粪便自发温度即可达40℃左右，24小时之内消除恶臭，并迅速温度发酵(50～60℃)约持续3～5天高温发酵，有机氮提高25％左右，并已达到半腐熟状态，间隙搅拌促使水分蒸发，在一周这内可使畜禽粪便加工成无臭无害的半腐熟有机肥。
取1000g生活垃圾污泥和1g巨大芽孢杆菌原粉充分混和、堆置，经60小时后，经测定，无臭味。
二、巨大芽孢杆菌原粉用于生产生物除臭调理剂，主要应用于畜禽饲用添加剂，可以过腹除臭，降低畜禽舍内臭味，特别是氨的含量，同时可以促进生长与提高免疫功能。
对大白鼠、毕克犬、猪、鸡等不同剂量的喂养均表现安全又无副作用，发现尿液澄清无臭感，粪便较干燥成形，无臭感，并有显著促进生长的作用。
以1～2‰巨大芽孢杆菌原粉混合入饲料，饲喂两批黄羽鸡，结果表明，消化道系统得到改善，食欲旺，消化吸收好，第一批黄羽鸡比对照组增重8～12％，第二批鸡增重6～8％，均达到显著水平，并且肉质香嫩，毕克犬饲喂不同剂量试验，每周称重，86天后分别比对照组增重8％、10％、15％，并且毛色亮丽，体态健美，猪的增重也很显著，比对照组增重10％以上。
权利要求
1.巨大芽孢杆菌，其特征在于该菌种在中国微生物菌种保藏登记号为GMCC No 1259，其基因的DNA序列为ctggcggcgt gcctaatcat gcaagtcgag cgaactgatt agaagcttgc ttctatgacg 60ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg 120ggaaaccgaa gctaataccg gataggatct tctccttcat gggagatgat tgaaagatgg 180tttcggctat cacttacaga tgggcccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240caccaaggca acgatgcata gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga 420agaacaagta cgagagtaac tgctcgtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg 540cgtaaagcgc gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg 600agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cctaagagaa aagcggattt ccacgtgtag 660cggtgaaatg cgtta。
2.巨大芽孢杆菌的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)取畜禽粪，采用营养琼脂进行平板稀释分离；2)挑取芽孢杆菌的单菌落；3)纯化；4)采用硫化氢和靛基质生化动力检测方法，将分离出呈阴性的单菌落，即巨大芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述巨大芽孢杆菌的制备方法，其特征在于步骤1)中，先将畜禽粪稀释于1000倍～10000倍的无菌水中，经80℃水浴15分钟，再将稀释后的畜禽粪平铺在平板营养琼脂上，置于34℃～35℃中培养3～4天。
4.根据权利要求2所述巨大芽孢杆菌的制备方法，其特征在于采用沙土管或冻干粉管对巨大芽孢杆菌保藏。
5.根据权利要求2、或3或3所述巨大芽孢杆菌的制备方法，其特征在于将巨大芽孢杆菌移接到营养琼脂斜面，制成第一代原种，再移至发酵罐，经繁殖罐扩大培养，形成芽孢后，经离心浓缩，取固体物质，喷雾干燥获得粉状巨大芽孢杆菌。
6.根据权利要求5所述巨大芽孢杆菌的制备方法，其特征在于发酵罐中液体配方中，每1000ml水，以下各组分为糖类20～25g、豆粕10～15g、鱼粉5g、硫酸氢二钾2g、硫酸镁1g、氯化钠5g、硫酸钙3g，PH为7.2。
7.根据权利要求5所述巨大芽孢杆菌的制备方法，其特征在于在32±1℃培养温度条件下扩大培养48～52小时。
8.巨大芽孢杆菌用于生产生物除臭剂。
9.巨大芽孢杆菌用于生产生物调理剂。
全文摘要
巨大芽孢杆菌及其制备方法、用途，涉及环境和饲用生物技术领域，特别是一种微生物菌种的筛选、制备方法及其应用。包括以下步骤取畜禽粪，采用营养琼脂进行平板稀释分离、挑取芽孢杆菌的单菌落、纯化，最后采用硫化氢和靛基质生化动力检测方法，将分离出呈阴性的单菌落，即巨大芽孢杆菌，可用于生产生物除臭剂和生物调理剂。
文档编号C12N15/31GK1786151SQ20051009127
公开日2006年6月14日 申请日期2005年8月15日 优先权日2005年8月15日
发明者戴承镛 申请人:戴承镛