专利名称：一种芽孢杆菌及其酯酶的提取方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种芽孢杆菌及其酯酶的提取方法和应用。
背景技术：
有机磷农药在保护农作物免受病、虫害，提高粮食产量方面具有巨大作用，但其过 度使用经常导致蔬菜和水果等农产品农药残留超标，直接危害人们的身体健康，因此有效 控制农产品的农药残留是我国当前解决食品安全问题的主要任务之一。减少农产品农药残 留危害的最有效的途径之一是建立快速有效的农药残留检测方法。目前国内大部分的农贸 市场都在使用酶抑制法来检测果蔬的有机磷农药残留，该法涉及了酶试剂、底物和显色剂， 其中的关键技术是对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感的酯酶的提取和获得。目前国内现有 的用于规模生产的酯酶都是从动物中提取的，主要还存在以下缺点和问题(1)筛选酶源 工作量很大、成本较高；( 酶来源不稳定，不同批次不同个体来源的酶的差异较大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种成本低、灵敏度高以及酶来源 稳定的芽孢杆菌酯酶的提取方法。该菌命名为芽孢杆菌(Bacillus brevis)GDXEase8，编号为。本发明芽孢杆菌(Bacillus brevis)⑶XEase8的分子分类地位的确定。该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO 1所示。该菌株在平板上的菌落呈圆形、浅黄色、不透明、表面光滑、边缘整齐。细胞呈杆 状，直径0. 8 μ m左右，长度约2-3 μ m,革兰氏染色为阳性，芽孢呈椭圆形，近端生。对该菌株进行的抗生素抗性、接触酶实验结果表明，菌株对萘啶酮酸和大观霉素 有抗性，接触酶实验结果为阳性。本发明还提供了芽孢杆菌酯酶的提取方法，包括以下步骤(1)斜面菌种将芽孢杆菌(Bacillus brevis)⑶XEase8接种到营养琼脂斜面上 培养；(2)扩大种子液培养将斜面菌种接种到装有种子培养基的三角瓶中，37士3°C， 100-300rpm，摇床培养12-14小时；所述种子培养基为蛋白胨1%，酵母膏0. 5%, NaCl 0. 5%,pH7. 0 ；(3)发酵培养将扩大培养种子液接种到发酵培养基中，于37士3°C培养M-26小 时；所述发酵培养基为葡萄糖1 %，蛋白胨2%，K2HPO4O. 1 %，NaH2PO4 0. 1%,ρΗ7.0 ；(4)芽孢杆菌酯酶的提取将发酵菌液3000-5000rpm离心10-20min，收集菌体， 用0. 01-003mol/L pH7. 0磷酸缓冲液洗涤后再次用磷酸缓冲液悬浮，用超声波破壁法提酶， 3000-5000rpm离心10_20min，所得上清即为芽孢杆菌酯酶。本发明还提供了该芽孢杆菌酯酶在农药残留检测方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果1.本发明以一株芽孢杆菌(Bacillus brevis)⑶XEase8为出发菌株进行发酵后 提取酶液，该酶在菌种不发生变异的情况下其性质完全相同，重复性好，克服了不同动植物 个体来源的酯酶存在差异的问题。2.本发明以芽孢杆菌(Bacillus brevis)⑶XEase8进行发酵提取酶液，不需要 筛选酶源，也不需要纯化，降低了酶提取的工作量和成本。3.本发明提供的芽孢杆菌酯酶在甲胺磷、敌敌畏浓度分别为0. 3ppm、0. 005ppm时 抑制率都高于50%，使检测限度远低于相关的国家标准，克服了目前产品对有机磷农药的 敏感度不高，特别是对甲胺磷等的敏感度低的缺点。本发明芽孢杆菌(Bacillus brevis)GDXEase8已于2010年11月9日保藏于国 家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为No. CCTCC M 2010295。
具体实施例方式实施例1本发明提供的芽孢杆菌(Bacillus brevis)⑶XEase8具有下述性质1.形态特征菌株在平板上的菌落呈圆形、浅黄色、不透明、表面光滑、边缘整齐。细胞呈杆状， 直径0. 8 μ m左右，长度约2-3 μ m,革兰氏染色为阳性，芽孢呈椭圆形，近端生。2.生理生化鉴定对菌株进行的抗生素抗性、接触酶实验结果表明，菌株对萘啶酮酸和大观霉素有 抗性，接触酶实验结果为阳性。3. 16SrDNA 序列该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO 1所示。实施例2实施例1所述的芽孢杆菌酯酶的制备方法(1)斜面菌种将保藏的菌种接种到营养琼脂斜面上培养，0-4°C保存。(2)扩大种子液培养将斜面菌种接种到装有IOOml种子培养基(蛋白胨1%，酵 母膏 0.5%，NaCl 0. 5%, pH7. 0)的 250ml 三角瓶中，37°C，200rpm，摇床培养 12 小时。(3)发酵培养将IOOml扩大培养种子液接种到IOL发酵罐中，于37°C培养M小 时(培养基配方葡萄糖 1%，蛋白胨 2%，K2HPO4O. 1 %, NaH2PO4O. 1%, pH7. 0) (4)酶液的提取将发酵菌液离心(4000rpm) 15min,收集菌体，用0. 02mol/ L磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤后再次用磷酸缓冲液悬浮，用超声波破壁法提酶，离心 (4000rpm) 15min，所得上清即为酯酶液。实施例3实施例2所述的芽孢杆菌酯酶对有机磷农药的敏感度检测材料细菌酯酶、靛酚乙酸酯溶液和磷酸缓冲液仪器恒温水浴锅、分光光度计酯酶活力测定在试管中加入4. 7mL 0. 02mol/L, ρΗ7· 0磷酸缓冲液，200 μ L2%靛 酚乙酸酯，混勻，37°C水浴10分钟，加入100 μ L芽孢杆菌酯酶，反应5分钟后加入5mL无水乙醇终止反应(对照管在加无水乙醇后再加芽孢杆菌酯酶)，测0D605。抑制率计算(0D0-0D1)/ODOX 100% (0D0 不被抑制时的OD值；ODl 抑制后的OD
值)测定结果(1)芽孢杆菌酯酶对敌敌畏的敏感度敌敌畏浓度为0. 005ppm时，抑制率高于50 %，低于相关标准[GB/T 5009. 199-2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测]。(2)芽孢杆菌酯酶对敌百虫的敏感度敌百虫浓度为0. Ippm时，抑制率高于50%，低于相关标准[GB/T5009. 199-2003蔬
菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测]。(3)芽孢杆菌酯酶对甲胺磷的敏感度甲胺磷浓度为0. 5ppm时，抑制率高于50%，低于相关标准[GB/T5009. 199-2003蔬
菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测]。(4)芽孢杆菌酯酶对乐果的敏感度乐果浓度为2ppm时，抑制率高于50%，低于相关标准[GB/T 5009. 199-2003蔬菜 中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测]。(5)芽孢杆菌酯酶对乙酰甲胺磷的敏感度乙酰甲胺磷浓度为0. 6ppm时，抑制率高于50 %，低于相关标准[GB/ T5009. 199-2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测]。
权利要求
1.一种芽孢杆菌(Bacillus brevis)⑶XEase8，其特征在于其保藏编号为CCTCC M 2010295。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillusbrevis)⑶XEase8，其特征在于所述芽 孢杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO 1所示。
3.—种权利要求1或2的所述的芽孢杆菌酯酶的提取方法，其特征在于包括以下步骤(1)斜面菌种将芽孢杆菌(Bacillusbrevis)⑶XEaseS接种到营养琼脂斜面上培养；(2)扩大种子液培养将斜面菌种接种到装有种子培养基的三角瓶中，37士 3°C， 100-300rpm，摇床培养12-14小时；所述种子培养基为蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 0. 5%,pH7.0 ；(3)发酵培养将扩大培养种子液接种到发酵培养基中，于37士3°C培养M-26小时； 所述发酵培养基为葡萄糖1 %，蛋白胨2%，K2HPO4 0.1%，NaH2PO4 0. 1%,ρΗ7.0 ；(4)芽孢杆菌酯酶的提取将发酵菌液3000-5000rpm离心10-20min，收集菌体，用 0. 01-003mol/L pH7. 0磷酸缓冲液洗涤后再次用磷酸缓冲液悬浮，用超声波破壁法提酶， 3000-5000rpm离心10_20min，所得上清即为芽孢杆菌酯酶。
4.如权利要求3所述的芽孢杆菌酯酶在农药残留检测方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种芽孢杆菌(Bacillus brevis)GDXEase8及其酯酶的提取方法和应用，该菌已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2010年11月9号，保藏编号为CCTCC No:M2010295。本发明成本低、灵敏度高以及酶来源稳定。
文档编号C12R1/08GK102134559SQ201010546319
公开日2011年7月27日 申请日期2010年11月15日 优先权日2010年11月15日
发明者肖桂秋, 隆湘蕾 申请人:广州吉家庄生物科技有限公司