解淀粉芽孢杆菌HM‑6及其菌剂的制备方法和应用与流程

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种防治植物病害的生防菌株及其菌剂的制备方法和应用。

背景技术：

玉米鞘腐病致病菌为层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)。该病是近年我国玉米生产上发生的一种新病害。玉米鞘腐病在我国春玉米区均有不同程度发生。该病主要发生在玉米生长后期的籽粒形成直至灌浆充实期。发病严重时，引起玉米秃尖、籽粒干瘪，或者穗腐，造成很大的产量损失。

目前该病在我国属新发生病害，并有加重危害趋势，发生规律及防治措施有待深入研究。生物防治对环境污染小，无残留，安全有效，在提倡可持续发展的今天，随着人们生活水平的提高和环保意识的加强，对农产品的质量提出了更高的要求。微生物杀菌剂成为植物病害防治研究的重要方面，具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种解淀粉芽孢杆菌HM-6及其菌剂的制备方法和应用，该生防菌株HM-6具有安全、无毒、无环境污染的特点；菌剂制备方法简单，成本低；HM-6及其菌剂对玉米鞘腐病的防效达75%以上，且施用简单，可替代或减少化学农药的施用，提高农产品的安全性；同时对玉米大斑病、番茄灰霉病、黄瓜枯萎病、苹果斑点落叶病均有很强的抑制作用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

对采自不同环境土样进行微生物的分离，以玉米鞘腐病病原菌为靶标菌，筛选得到防治效果稳定的拮抗菌HM-6，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。已于2017年01月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号），保藏号为CGMCC No. 13627。

本发明还提供了含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂。

含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂的制备方法，包括下述步骤：

（1）将解淀粉芽孢杆菌HM-6接种于牛肉膏蛋白胨平板上，在28-32℃下活化1d；

（2）转接于牛肉膏蛋白胨培养液中，在28-32℃、120-180rpm的摇床上培养16-20h，得种子液；

（3）按体积比为3%-5%的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在28-35℃、110-150rpm条件下培养2-3d，得发酵液；

（4）发酵液离心，离心得到的固体经冷冻干燥后，得到菌粉；

（5）菌粉中加入助剂，制得含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂。

优选的，步骤（3）中，发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米粉3-5%、豆粕3-5%、氯化钠0.2-0.4%、磷酸二氢钾0.03-0.05%，其余为水；pH值为7.0-7.5。

优选的，步骤（5）中，助剂的组成成分及其与菌粉的重量百分比为：蔗糖2.0-2.6％，羧甲基纤维素2.0-3.5%，十二烷基硫酸钠8.0-10.0%，硅藻土36.0-38.0%，菌粉50%。

进一步优选的，制得50%可湿性粉剂，活菌数达10⁹-10¹⁰CFU/g。

本发明还提供了解淀粉芽孢杆菌HM-6在防治玉米鞘腐病中的应用。

以及解淀粉芽孢杆菌HM-6在防治玉米大斑病、番茄灰霉病、黄瓜枯萎病、苹果斑点落叶病中的应用。

本发明还提供了解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂在防治玉米鞘腐病中的应用。

以及解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂在防治玉米大斑病、番茄灰霉病、黄瓜枯萎病、苹果斑点落叶病中的应用。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

（1）针对近年来新发病害玉米鞘腐病有加重发生的趋势，造成玉米产量和质量下降，损失严重，又缺乏有效防治措施的现状，本发明提供了防治该病效果稳定的生防菌株HM-6并提供了其简单易行的菌剂制备方法和应用技术；

（2）本发明的菌株HM-6是解淀粉芽孢杆菌，属于目前生物防治中应用较为广泛的芽孢杆菌属成员之一，具有安全、无毒、无环境污染的特点；

（3）本发明的HM-6菌剂制备方法简单，成本低；

（4）实践证明，本发明的HM-6菌剂，对玉米鞘腐病具有很好的防治效果。可采用拌种和喷施两种方式。拌种：菌剂500倍液拌种，堆闷4～8小时后直接播种，防效可达75%以上，即便发病，病斑也较小，对产量影响不大。喷施：在发病初期，隔7-10d喷施该菌剂500倍液，连续喷2-3次，其防效可达82.5%。且施用简单，可替代或减少化学农药的施用，提高农产品的安全性；

（5）同时本发明的HM-6菌剂对玉米大斑病、番茄灰霉病、黄瓜枯萎病、苹果斑点落叶病均有很强的抑制作用。其中，对番茄灰霉病的预防作用防效可达81.3%，治疗作用防效可达72.5%。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明；

图1是本发明实施例3中HM-6对玉米鞘腐病原菌的抑制效果图；

图2是本发明实施例3中HM-6对番茄灰霉病原菌的抑制效果图；

图3是本发明实施例3中HM-6对玉米大斑病原菌的抑制效果图。

具体实施方式

实施例1

HM-6的分离、筛选与鉴定

（1）HM-6的分离：不同生境采集土样，称取土壤10g放入盛有90ml无菌水的三角瓶，充分振荡20min，静置10min，再吸菌液逐级稀释得10^-5和10^-6的菌悬液，吸取0.2ml菌悬液至牛肉膏蛋白胨平板上，涂布均匀，每个稀释度重复三次，置于28℃生化培养箱中培养24h，挑取菌落特征不同的单菌落进行划线分离纯化，接入斜面，得到不同的菌株，进行编号并记录菌落特征，置于4℃冰箱保存备用。

（2）HM-6的筛选：

采用平板对峙培养的方法进行初筛。将玉米鞘腐病菌在PDA平板上培养后，用打孔器取直径为0.6cm的菌盘，置于PDA平板的中央，将在牛肉膏蛋白胨平板上活化过的菌株划线接至距病原菌2 cm处，每个处理重复3次，在25℃培养箱中培养4d。观察有无抑菌带产生，并记录抑菌带大小，将产生抑菌带的菌株作为拮抗菌进行复筛。

采用活体测试法进行复筛。

将初筛获得的拮抗菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30℃、150rpm下培养48h，得菌悬液备用。玉米种子在25℃下催芽，播种于装有灭菌珍珠岩的营养钵中，定期喷洒营养液，当株高约30cm时，进行实验测试。将玉米鞘腐病菌在PDA平板上培养后，用打孔器取直径为0.6cm的菌盘，长有菌丝的一面紧贴于叶鞘，用胶带小心固定到玉米叶鞘上。每株接种2个，待叶鞘处出现典型病斑后喷拮抗菌菌悬液，并设清水对照，每个处理10株。置于温室培养，观察记录发病状况，进行统计分析，计算防效。期间每隔一天每个营养钵加入20mL的营养液。

通过上述方法筛选得到防治效果稳定的HM-6。

（3）HM-6的鉴定：通过对HM-6进行培养特征观察、显微观察、革兰氏染色、16S rDNA全序列分析、系统发育分析等研究，结果初步鉴定其为解淀粉芽孢杆菌。

形态特征：牛肉膏培养基上生长初期，菌落呈白色，边缘光滑，有突起，水润透明，不产色素。生长后期菌株呈乳白色，边缘呈小波浪状，有明显的突起，褶皱，不产色素，呈黏稠状。PDA培养基上生长初期与牛肉膏上相似，后期转为黄褐色，边缘光滑，突起不明显，菌落外缘有透明圈。通过染色在显微镜下观察，细胞短杆状，具有运动性，周生鞭毛，芽孢直径小于菌体、中生，革兰氏染色呈阳性。

分子生物学鉴定：将提取的拮抗菌HM-6基因组DNA进行16S rDNA的PCR扩增。PCR扩增的引物27F：5^’ GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3^’；1492R：5^’CGGCTACCTTGTTACGACTT 3^’。PCR扩增产物回收后寄送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序。然后将测序结果在Blast在线分析比对，并构建系统发育树来鉴定其分类地位。结果与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens AB006920)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis subsp AJ276351)相似度均达99%。利用MEGA软件构建出系统发育树，其与解淀粉芽孢杆菌处于同一分支，结合细菌生长形态特征，鉴定HM-6为解淀粉芽孢杆菌。

实施例2

含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂的制备方法，包括下述步骤：

首先将解淀粉芽孢杆菌HM-6接种于牛肉膏蛋白胨平板上，在28℃下活化1d，然后转接于牛肉膏蛋白胨培养液中，在28℃、120rpm的摇床上培养18h，得种子液，最后按体积比为3%的接种量将种子液接种到发酵培养基（重量百分比：玉米粉4%、豆粕3%、氯化钠0.3%、磷酸二氢钾0.04%，其余为水；pH7.0-7.5）中，在30℃、150rpm条件下培养3d，得发酵液，发酵液离心，离心得到的固体经冷冻干燥后，得到菌粉。然后菌粉中加入助剂（重量百分比：2.5％蔗糖，8.5% SDS，3.0% CMC，36.0%硅藻土，50%菌粉），制得含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂（50%可湿性粉剂，活菌数达10⁸-10⁹cfu/g）。

实施例3

含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂的应用

（一）对玉米鞘腐病的防治作用（温室盆栽试验）

拌种施用：菌剂500倍液拌种，堆闷4～8h后直接播种于装有灭菌珍珠岩的营养钵中，定期喷洒营养液，当株高约30cm时，进行实验测试。将玉米鞘腐病菌在PDA平板上培养后，用打孔器取直径为0.6cm的菌盘，长有菌丝的一面紧贴于叶鞘，用胶带小心固定到玉米叶鞘上。每株接种2个，接20株。并设清水对照。置于温室培养，观察记录发病状况，进行统计分析，计算防效。期间每隔一天每个营养钵加入20mL的营养液。

叶面喷施：玉米种子在25℃下催芽，播种于装有灭菌珍珠岩的营养钵中，定期喷洒营养液，当株高约30cm时，进行实验测试。将玉米鞘腐病菌在PDA平板上培养后，用打孔器取直径为0.6cm的菌盘，长有菌丝的一面紧贴于叶鞘，用胶带小心固定到玉米叶鞘上。每株接种2个，待叶鞘处出现典型病斑后喷菌剂500倍液，隔7d喷一次，连续喷3次。并设清水对照。每个处理20株。置于温室培养，观察记录发病状况，进行统计分析，计算防效。期间每隔一天每个营养钵加入20mL的营养液。

测试结果表明含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂通过拌种对玉米鞘腐病的防效可达75%以上；通过叶面喷施其防效可达82.5%。

HM-6对玉米鞘腐病原菌的抑制效果，见图1所示。

（二）对番茄灰霉病的防治作用（温室盆栽试验）

番茄种子在25℃下催芽，播种于装有灭菌珍珠岩的营养钵中，当株高约20cm时，进行实验测试作如下处理。

预防作用：

处理1：喷500倍液含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂24h后接种番茄灰霉病原菌

处理2：喷清水24h后接种番茄灰霉病原菌

处理3：常规种植，不喷菌剂不接种病原菌

治疗作用：

处理1：接种番茄灰霉病原菌1d、7d、15d后连续喷含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂500倍液3次

处理2：接种番茄灰霉病原菌1d、7d、15d后喷清水

处理3：常规种植，不喷菌剂不接种病原菌

每个处理20株。置于温室培养，每隔一天每个营养钵加入20mL的营养液。观察记录发病状况，进行统计分析，计算防效。

测试结果表明含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂对番茄灰霉病既具有预防作用，也具有治疗效果。其预防作用防效可达81.3%，治疗作用防效可达72.5%。

HM-6对番茄灰霉病原菌的抑制效果，见图2所示。

（三）对其他病原菌的抑制作用

通过平板对峙培养测试，该含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂对玉米大斑病、黄瓜枯萎病、苹果斑点落叶病均有很强的抑制作用。

HM-6对玉米大斑病原菌的抑制效果，见图3所示。

本发明生防菌株HM-6具有安全、无毒、无环境污染的特点；菌剂制备方法简单，成本低；HM-6及其菌剂对玉米鞘腐病的防效达75%以上，且施用简单，可替代或减少化学农药的施用，提高农产品的安全性；同时对玉米大斑病、番茄灰霉病、黄瓜枯萎病、苹果斑点落叶病均有很强的抑制作用。