一种从动物肺组织中分离纯化II型固有淋巴细胞的方法与流程

文档序号:11899087阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种从动物肺组织中分离纯化II型固有淋巴细胞的方法,该方法包括:

取动物肺脏组织,破碎,加入I型胶原酶消化,得到肺组织消化溶液;

将肺组织消化溶液过滤;

通过Percoll法分离得到肺组织淋巴细胞;

用Ⅱ型固有淋巴细胞特异性抗体标记所得到的肺组织淋巴细胞,经细胞流式技术分选得到Ⅱ型固有淋巴细胞。

2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述动物为小鼠。

3.根据权利要求1所述的方法,其中,是将动物肺脏组织剪成1~2mm3大小再加入I型胶原酶消化。

4.根据权利要求1所述的方法,其中,对应每只小鼠的肺脏加入3~20ml浓度为0.03~0.5%(m/v)的I型胶原酶消化。

5.根据权利要求1或4所述的方法,其中,加入I型胶原酶后在30~42℃间的环境中消化10~90分钟。

6.根据权利要求1所述的方法,其中,肺组织消化溶液是200目的筛网过滤。

7.根据权利要求1所述的方法,其中,Percoll法分离得到肺组织淋巴细胞的具体操作为:

用42%Percoll 3ml重悬沉淀,然后将该细胞悬液缓慢加到3ml 70%Percoll表面,进行离心1260g 30分钟。

8.根据权利要求1所述的方法,其中,通过四种抗体从肝脏单个核细胞中进行流式细胞术分选纯化Ⅱ型固有淋巴细胞。

9.根据权利要求1或8所述的方法,其中,所述抗体为FITC-anti mouse KLRG1、PE-anti mouse Lineage Cocktail、PerCP.Cy5.5-anti mouse CD90.2、APC-anti mouse IL33R。

10.根据权利要求1所述的方法,该方法包括:

将动物肺组织剪成1~2mm3左右小块将组织块放入离心管中加5ml不含血清的具有生理渗透压的溶液(如不完全DMEM或生理盐水等)配制的0.1%胶原酶I溶液,置于30~42℃震荡箱中110~220rpm消化10~90分钟;置于冰上终止消化,用200目筛网过滤,将停留在网上的肺组织轻轻研磨后再过滤;

4℃1060g离心10分钟,弃上清;

密度梯度离心:用42%Percoll 3ml重悬沉淀,然后将该细胞悬液缓慢加到3ml70%Percoll(GE Healthcare)表面,离心1260g 30分钟;

取中间层细胞到新的15毫升离心管,PBS加满,1060g离心10分钟后弃去上清液;

细胞悬液加入大鼠血清封闭Fc受体并标记荧光抗体:FITC-anti mouse KLRG1、PE-anti mouse Lineage Cocktail、PerCP.Cy5.5-anti mouse CD90.2、APC-anti mouse IL33R,4℃避光孵育15min;

加满PBS,4℃1060g×10min,洗两遍;

用流式细胞仪分选Lineage-IL33R+CD90.2+KLRG1+细胞,即为ILC2细胞。

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