本发明属于心肌细胞分离
技术领域：
，具体涉及一种心肌细胞分离方法。
背景技术：
：心肌细胞动物生长发育、生理、代谢的重要细胞之一。为了方便研究心肌细胞的生理功能、观察细胞形态，排除体内各种限制因素对心肌细胞的影响，通常采用体外分离培养方法。由于心肌细胞位于心脏的心肌组织内，实验人员分离心肌细胞时，通常需要向离体的心脏中注射消化液，待消化完成后才收集心肌细胞。然而，由于分离心肌细胞时，心脏已经离体，缺乏保护，长时间的消化作用容易引起心肌细胞变形，降低心肌细胞的存活率。技术实现要素：本发明提供的一种心肌细胞分离方法，解决了现有技术中长时间的消化作用容易引起的心肌细胞变形，降低心肌细胞的存活率的问题。本发明提供的一种心肌细胞分离方法，包括以下步骤：步骤1，将新鲜离体的心脏放入4℃预冷的保护液中，剪取心室肌组织，并用冲洗液洗净，再将心室肌组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，然后于冲洗液中浸泡3-5min，过滤，得到心肌组织样品，备用；每升所述保护液含有以下组分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶剂为双蒸水；每升冲洗液中含有以下组分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶剂为双蒸水；步骤2，将心肌组织样品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化5-8min，弃去上清液，得到第一次沉淀物；步骤3，将第一次沉淀物置于高浓度缓冲液中浸泡3-5min，过滤，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高浓度缓冲液中含有以下组分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶剂为双蒸水；步骤4，将第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH调节pH至7-7.5，37℃消化5-8min，过滤，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步骤5，将第三次沉淀物置于低浓度缓冲液中浸泡3-5min，得到细胞混合物；每升低浓度缓冲液中含有以下组分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2-4mg的L-谷氨酸、2-4mg的甘氨酸、1-2g的葡萄糖，溶剂为双蒸水；步骤6，将第二次上清液、第三次上清液和细胞混合物混合均匀，并用吸管吹打，然后过滤掉心肌组织沉淀物，收集滤液并离心，得到分离后的心肌细胞沉淀。优选的，上述心肌细胞分离方法中，步骤6还包括：用吸管吹打后，加入胎牛血清。优选的，上述心肌细胞分离方法中，步骤6中，胎牛血清的添加量为：胎牛血清与所述细胞混合物的质量比例为5～10:100。优选的，上述心肌细胞分离方法中，步骤5中，每升低浓度缓冲液中含有以下组分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2mg的L-谷氨酸、2mg的甘氨酸、2g的葡萄糖，溶剂为双蒸水。优选的，上述心肌细胞分离方法中，步骤5还包括调节pH步骤，具体为：先用0.01mol/L的HCl调节低浓度缓冲液的pH至6.0-6.5，然后加入第三次沉淀物浸泡。优选的，上述心肌细胞分离方法中，步骤6中，滤液离心的条件为：10000r/min，4℃，离心10min。与现有技术相比，本发明提供的一种心肌细胞分离方法具有以下有益效果：(1)步骤3中采用高浓度的缓冲液浸泡、步骤5中采用低浓度的缓冲液浸泡，使细胞外钾离子浓度下降，对心肌细胞产生刺激，提高心肌细胞的活性，避免长时间的消化引起的心肌细胞形态发生变化、细胞存活率降低的问题。再者，步骤5中采用的低浓度缓冲液一方面可以促使心肌细胞快速溶出，另一方面为心肌细胞提供了维持细胞渗透压的NaCl和KCl，以及维持细胞营养的L-谷氨酸、甘氨酸和葡萄糖，使细胞能够维持一定的生理活性。(2)步骤5中，用吸管吹打后，加入胎牛血清，一方面抑制了胰蛋白酶的活性，防止胰蛋白酶对后续操作的影响，另一方面，心肌细胞在一定浓度的血清中可以维持生理活性。(3)，用HCl调节低浓度缓冲液的pH至6.0-6.5后，可抑制胰蛋白酶的生理活性，快速终止反应，避免具有活性的胰蛋白酶长期与心肌细胞接触，影响心肌细胞活性。(4)该提取方法避免使用复杂的设备，操作简单，且经过长时间的消化后，心肌细胞仍保持良好的细胞形态和活性，且能够存活较长时间。附图说明图1为本发明实施例1的方法分离得到的心肌细胞的显微观察视图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。本发明提供的一种心肌细胞分离方法，包括以下步骤：步骤1，将新鲜离体的心脏放入4℃预冷的保护液中，剪取心室肌组织，并用冲洗液洗净，再用眼科剪将心室肌组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，然后于冲洗液中浸泡3-5min，过滤，得到心肌组织样品，备用；每升所述保护液含有以下组分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶剂为双蒸水；使用该保护液可保持心肌组织的生理活性。每升冲洗液中含有以下组分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶剂为双蒸水。步骤2，将心肌组织样品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化5-8min，弃去上清液，得到第一次沉淀物。步骤3，将第一次沉淀物置于高浓度缓冲液中浸泡3-5min，过滤，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高浓度缓冲液中含有以下组分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶剂为双蒸水。步骤4，将第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH调节pH至7-7.5，37℃消化5-8min，过滤，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步骤5，用0.01mol/L的HCl调节低浓度缓冲液的pH至6.0-6.5，将第三次沉淀物置于低浓度缓冲液中浸泡3-5min，使心肌细胞分散于低浓度缓冲液中，得到细胞混合物；每升低浓度缓冲液中含有以下组分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2-4mg的L-谷氨酸、2-4mg的甘氨酸、1-2g的葡萄糖，溶剂为双蒸水。步骤6，将第二次上清液、第三次上清液和细胞混合物混合均匀，并用吸管吹打，然后过滤掉心肌组织沉淀物，收集虑液，并将收集的滤液经10000r/min，4℃，离心10min，得到分离后的心肌细胞沉淀。步骤3中采用高浓度的缓冲液、步骤5中采用低浓度的缓冲液，使细胞外钾离子浓度下降，对心肌细胞产生刺激，提高心肌细胞的活性，避免长时间的消化引起的心肌细胞形态发生变化、细胞存活率降低的问题。需要说明的是，步骤6还包括：用吸管吹打后，加入胎牛血清，胎牛血清与所述细胞混合物的质量比例为5～10:100。胎牛血清的添加一方面抑制了胰蛋白酶的活性，防止胰蛋白酶对后续操作的影响，另一方面，心肌细胞在一定浓度的血清中可以维持生理活性。优选的，本发明提供的心肌细胞分离方法，包括以下实施例：实施例1一种成年大鼠的心肌细胞分离方法，包括以下步骤：步骤1，将新鲜离体的心脏放入4℃预冷的保护液中，剪取心室肌组织，并用冲洗液洗净，再用眼科剪将心室肌组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，然后于冲洗液中浸泡3min，用纱布过滤，得到心肌组织样品，备用；每升所述保护液含有以下组分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶剂为双蒸水；每升冲洗液中含有以下组分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶剂为双蒸水。步骤2，将心肌组织样品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化8min，弃去上清液，得到第一次沉淀物。步骤3，将第一次沉淀物置于高浓度缓冲液中浸泡5min，用纱布过滤，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高浓度缓冲液中含有以下组分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶剂为双蒸水。步骤4，将第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH调节pH至7.5，37℃消化8min，用纱布过滤，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步骤5，用0.01mol/L的HCl调节低浓度缓冲液的pH至6.0-6.5，将第三次沉淀物置于低浓度缓冲液中浸泡5min，使心肌细胞分散于低浓度缓冲液中，得到细胞混合物；每升低浓度缓冲液中含有以下组分：6g的NaCl、0.2g的KCl，2mg的L-谷氨酸、2mg的甘氨酸、2g的葡萄糖，溶剂为双蒸水。步骤6，将第二次上清液、第三次上清液和细胞混合物混合均匀，并用吸管吹打，然后用纱布过滤掉心肌组织沉淀物，收集虑液，并将收集的滤液经10000r/min，4℃，离心10min，得到分离后的心肌细胞沉淀。实施例2一种新生大鼠的心肌细胞分离方法，包括以下步骤：步骤1，将新鲜离体的心脏放入4℃预冷的保护液中，剪取心室肌组织，并用冲洗液洗净，再用眼科剪将心室肌组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，然后于冲洗液中浸泡5min，用纱布过滤，得到心肌组织样品，备用；每升所述保护液含有以下组分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3，溶剂为双蒸水；每升冲洗液中含有以下组分：9g的NaCl、0.3g的KCl，溶剂为双蒸水。步骤2，将心肌组织样品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化5min，弃去上清液，得到第一次沉淀物。步骤3，将第一次沉淀物置于高浓度缓冲液中浸泡3min，过滤，收集第二次上清液和第二次沉淀物；每升高浓度缓冲液中含有以下组分：8.5g的NaCl、0.25g的KCl，溶剂为双蒸水。步骤4，将第二次沉淀物置于消化液中，然后用NaOH调节pH至7.5，37℃消化5min，过滤，收集第三次上清液和第三次沉淀物；步骤5，将第三次沉淀物置于低浓度缓冲液中浸泡3min，使心肌细胞分散于低浓度缓冲液中，得到细胞混合物；每升低浓度缓冲液中含有以下组分：6g的NaCl、0.2g的KCl，4mg的L-谷氨酸、4mg的甘氨酸、1g的葡萄糖，溶剂为双蒸水。步骤6，将第二次上清液、第三次上清液和细胞混合物混合均匀，并用吸管吹打，加入胎牛血清，胎牛血清与所述细胞混合物的质量比例为5～10:100，静置2min，然后过滤掉心肌组织沉淀物，收集虑液，并将收集的滤液经10000r/min，4℃，离心10min，得到分离后的心肌细胞沉淀。为了验证本发明的方法可以减缓长时间的消化作用引起的心肌细胞变形缺陷，我们对实施例1的方法获得的心肌细胞形态进行显微观察，结果如图1所示，分离得到的心肌细胞呈边缘规则的圆形或者杆状，细胞形态良好。进一步的，我们分别对实施例1的方法、对照组1的方法、对照组2的方法分离得到的成年大鼠心肌细胞进行存活率进行测定。其中，对照组1的方法为：除将步骤5的低浓度缓冲液分别替换为步骤3中使用的高浓度缓冲液之外，其他操作步骤均同实施例1。对照组2的方法为：步骤(1)，将新鲜离体的心脏放入4℃预冷的保护液中，剪取心室肌组织，并用冲洗液洗净，再用眼科剪将心室肌组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，用纱布过滤，得到心肌组织样品，备用；每升所述保护液含有以下组分：8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3,溶剂为双蒸水。步骤(2)，将心肌组织样品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化8min，弃去上清液，得到初始沉淀物。步骤(3)，将初始沉淀物置于1g/L的胰蛋白酶溶液中，37℃消化8min，并用吸管吹打，然后过滤掉心肌组织沉淀物，收集虑液，并将收集的滤液经10000r/min，4℃，离心10min，得到分离后的心肌细胞沉淀。实施例1的方法、对照组1的方法、对照组2的方法分离得到的成年大鼠心肌细胞存活率(采用常规方法测定心肌细胞存活率)如表1所示，结果表明实施例1的方法中，心肌细胞存活率最高，为89.3％，且细胞分离程度良好，说明长时间的消化作用对心肌细胞的存活率影响较低。对照组1的方法中，由于步骤3和步骤5均采用的是高浓度缓冲液，不存在钾离子浓度的降低，缺少了对心肌细胞产生的刺激，故心肌细胞活性稍低。对照组2的方法中，既没有钾离子浓度的变化，也没有调节溶液的pH，在心肌组织消化过程中，基本上没有采用保护措施，细胞分离程度一般，细胞存活率最低，不利于后续传代培养。表1不同处理方法的新生大鼠心肌细胞存活率实施例1对照组1对照组2百分比(％)89.375.658.0细胞分离程度良好良好一般能否传代能能传代细胞存活率不高细胞存活时间4天4天3天尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。当前第1页1 2 3